专利名称：弓形虫虫体、风疹、巨细胞、疱疹Ⅰ、Ⅱ病毒抗原纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种TORCH检测诊断试剂盒中抗原物质的纯化方法。
新生儿出生缺陷已成为影响人口素质的重要因素，在引起出生缺陷的诸多因素中，宫内感染是一个重要因素。国内外研究指出，妊娠期间发生弓形体Toxoplasma(Toxo)，风疹病毒Rubella Virus(RV)、巨细胞病毒Cytomegalovirus(CMV)和单纯疱疹病毒Herpes Simplex Virus(HSV)，简称TORCH感染，可通过胎盘传给胎儿，发展成为先天性或围产期新生儿感染。是导致流产、死胎、先天畸形、智力障碍等不良妊娠结局的重要原因之一。
弓形虫妊娠期初次感染者，弓形虫通过胎盘感染胎儿；孕早期感染者可发生流产或畸胎妊娠中晚期感染者，可发生宫内胎儿生长迟缓，神经系统损害等。
风疹病毒病毒能使胎儿致畸，主要为先天性白内障，先天性心脏和神经性能耳聋。20周后感染者几乎无影响。
巨细胞病毒病毒能通过胎盘感染胎儿，引起宫胎儿生长迟缓，小头畸形、脑炎、视网膜脉络膜炎、黄疸、肝脾肿大、溶血性盆血等，新生儿死亡率甚高。
单纯疱疹病毒孕早期感染者能破坏胚芽而导致流产，孕中晚期感染者虽少发畸胎，但可引起胎儿和新生儿发病。
近年来，许多经济发达国家已将TORCH检测作为孕期常规筛查项目，在预防畸胎、流产等方面发挥重要的作用。在国内，随着科学技术的发展和人民生活水平的提高，人们对“优生优育”的认识逐步提高，TORCH检测越来越受到重视。
成人TORCH感染的临床症状不明显，无法自我感觉到是否受到感染，因此孕前及早期诊断对优生优育十分重要。
目前，国际上公认的最方便、最先进的早期诊断方法是检测人体血清中的特异IgM、IgG抗体，以判断受到感染的情况。TORCH检测有许多种，其中ELISA法因其特异性强，灵敏度高、操作简便，成本低廉等优点而成为各实验室首选。目前国内外均以IgM、IgG抗体的检测作为早期诊断或进行流行病学、免疫学调查的实验方法。检出特异性IgM说明患者近期感染，检出特异IgG说明患者既往感染。对孕期检测抗体阳性者建议定期复查，结合其他检测对抗体水平进行动态观察，了解胎儿发育情况，并给予相应治疗。
国内开展TORCH检测起步较晚，由于TORCH抗原纯化的技术难度影响TORCH试剂盒的开发生产，所用试剂盒多为国外进口或由国外购入包被抗原组装而成。这些进口试剂不但价格昂贵，而且未经国家检定部门检定，产品质量无法保障和规范。许多产品使用效果很不理想，市场情况混乱。
本发明的目的是为了提供一种工艺过程简便、所用试剂低廉、抗原纯度和收率高、可批量生产、批间差异小的TORCH抗原纯化工艺。
本发明的目的可通过如下措施来实现一种TORCH抗原纯化工艺含有下述步骤(1)将风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、II型的培养液，经离心去除细胞碎渣后，沉淀离心分离得病毒沉淀物；(2)将弓形虫腹水离心去除细胞，然后加入的0.01mol、PH＝7的磷酸盐(PBS)缓冲液稀释，离心后弓形虫腹水与缓冲液的体积比为1∶(0.8-1.3)，再沉淀后离心分离得弓形虫病毒沉淀物；(3)将上述(1)、(2)两步沉淀所取得的病毒深沉物分别溶于0.01mol、PH＝8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA的缓冲液中；然后再将溶解液采用透析得病毒浓缩液；(4)将病毒浓缩液用离子交换柱进行分离并用0.01mol、PH＝8的Tris-HCl-0.001molEDTA缓冲液含0.2-0.5mol的NaCl作梯度洗脱，收集各蛋白峰，包被酶标板，并用已知阳性血清，做间接ELISA试验检测抗原活性高峰液收集，即为纯化Torch抗原。
本发明相比现有技术具有如下优点1、本发明的工艺过程简便，无需特殊贵重设备，采用中性盐、有机溶剂和非离子多聚物沉淀浓缩病毒、步骤简单，所用试剂低廉、收率高可达80％以上。
2、本发明利用病毒体和弓形虫体的特定结构，选用DEAE阴离子交换柱，做NaCl梯度洗脱工艺纯化抗原，抗原纯度高，用于包被酶标试剂盒、包被抗原板、本底低，可批量生产，批间差异小，一个批次可生产100万人份以上的抗原用于酶标试剂盒。
本发明还将结合实施例作进一步详述实施例一一种TORCH抗原纯化工艺含有下述工艺(1)取风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、II型细胞病毒培养液100ml、经3000转/分离心30分钟，取上清液调PH7.0，加100ml饱和硫酸铵边滴加边搅拌，混匀，在4℃下静置30分钟，经7000转/分离心15分钟分离得沉淀物，再将沉淀物溶于100ml、0.01mol、PH7.0的PBS缓冲液中。
(2)将上述液体加入50ml饱和硫酸铵边滴加边搅拌，混匀，在4℃下静置30分钟，经7000转/分离心15分钟，分离得沉淀物，再将沉淀物溶于100ml、0.01mol、PH7.0的PBS缓冲液中。
(3)重复第(2)步两次，最后将沉淀物溶于10ml、0.01mol、PH8.00的Tris-HCl-0.001molEDTA缓冲液中。
(4)将此液在0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA缓冲液中，在4℃下透析直至无硫酸根离子和铵离子检出，再浓缩至10ml，此液为病毒浓缩提取液。
(5)将病毒浓缩提取液过DEAE纤维素交换柱，用0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA缓冲液含0.2-0.5mol的NaCl液作梯度洗脱，流速0.6ml/分，收集各蛋白峰包被酶标板用风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒阳性血清做间接ELISA试验，检测相应抗原活性，收集抗原活性高的峰液，加0.02％叠氮钠和50％甘油混匀，低温保存。
弓形虫纯化(1)取弓形虫腹水100ml加100ml、0.01mol、PH7.0的PBS液混匀，经3000转/分离心30分钟，取上清液调PH7.0加入200ml饱和硫酸铵，混匀，在4℃下静置30分钟，经7000转/分离心15分钟，分离得沉淀物，将沉淀物溶于100ml、0.01mol、PH7.0的PBS液中。
(2)将上述液体加入50ml饱和硫酸铵边滴加边搅拌，混匀后，在4℃下静置30分钟，经7000转/分离心15分钟，分离得沉淀物，将沉淀物溶于100ml、0.01mol、PH7.0的PBS液中。
(3)重复上述第(2)步两次，最后将沉淀溶于10ml、0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA缓冲液中。
(4)将此液在0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA缓冲液中，在4℃下透析直至无硫酸根离子和铵离子检出，再浓缩至10ml，此液为弓形虫浓缩提取液。
(5)弓形虫浓缩提取液过DEAE纤维素交换柱，用0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA缓冲液含0.2-0.5molNaCl液作梯度洗脱，流速0.6ml/分，收集各蛋白峰液，包被酶标板，用弓形虫阳性血清做间接ELISA试验，检测弓形虫抗原活性，收集抗原活性高的峰液，加0.02％叠氮钠和50％甘油低温保存。
实施例二在实施例一中将硫酸铵用硫酸钠代替，最后浓缩提取液过于离离子交换柱可采用Qsepharose Fast Flow柱，其余工艺和参数与例一同。
实施例三一种TORCH抗原纯化工艺含有下述步骤(1)将风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、II型细胞培养液，经3000转/分离心30分钟，取上清液；(2)取弓形虫腹水100ml加100ml、0.01mol、PH7.0的PBS液混匀，经3000转/分离心30分钟，取上清液；(3)将上述(1)(2)两步的上清液分别加入预冷的95％的乙醇至浓度达到60％，在-5℃下静置过液，次日经3000r/m离心30分钟得沉淀物；(4)再将沉淀物溶于10ml、0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA缓冲液中；(5)将上述(4)的溶液分别在0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA液中透析平衡过DEAESepharose Fast Flow柱，并用0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA液含0.2-0.5molNaCl液作梯度洗脱，流速0.6ml/分，收集各蛋白峰，包被酶标板，用风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、II型和弓形虫阳性血清分别做间接ELISA试验，检测相应抗原活性，收集抗原活性高峰液，加0.02％叠氮钠和50％甘油低温保存。
实施例四一种TORCH抗原纯化工艺含有下述步骤(1)将风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、II型细胞培养液，经3000转/分离心30分钟，取上清液；(2)取弓形虫腹水100ml加100ml、0.01mol、PH7.0的PBS液混匀，经3000转/分离心30分钟，取上清液；(3)将上述(1)(2)两步的上清液分别加入葡聚糖至浓度达到12％，调PH7.4，在4℃下静置过液，次日经7000r/m离心20分钟得沉淀物；(4)再将沉淀物溶于10ml、0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA缓冲液中；(5)将上述(4)的溶液分别在0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA液中透析平衡过DEAESepharose Fast Flow柱，并用0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA液含0.2-0.5molNaCl液作梯度洗脱，流速0.6ml/分，收集各蛋白峰，包被酶标板，用风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、II型和弓形虫阳性血清分别做间接ELISA试验，检测相应抗原活性，收集抗原活性高峰液，加0.02％叠氮钠和50％甘油低温保存。
权利要求
1.一种TORCH抗原纯化工艺，其特征在于含有下述步骤(1)将风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、II型的培养液，经离心去除细胞碎渣后，沉淀离心分离得病毒沉淀物；(2)将弓形虫腹水离心去除细胞，然后加入的0.01mol、PH＝7的磷酸盐(PBS)缓冲液稀释，离心后弓形虫腹水与缓冲液的体积比为1∶(0.8-1.3)，再沉淀后离心分离得弓形虫病毒沉淀物；(3)将上述(1)、(2)两步沉淀所取得的病毒深沉物分别溶于0.01mol、PH＝8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA的缓冲液中；然后再将溶解液采用透析得病毒浓缩液；(4)将病毒浓缩液用离子交换柱进行分离并用0.01mol、PH＝8的Tris-HCl-0.001molEDTA缓冲液含0.2-0.5mol的NaCl作梯度洗脱，收集各蛋白峰，包被酶标板，并用已知阳性血清，做间接ELISA试验检测抗原活性高峰液收集，即为纯化TORCH抗原。
2.如权利要求1所述的TORCH抗原纯化工艺，其特征在于所述的细胞沉淀工艺可采用盐析沉淀、有机溶剂沉淀和非离子多聚物沉淀工艺。
3.如权利要求1或2所述的TORCH抗原纯化工艺，其特征在于所述的盐析沉淀工艺含有下述步骤(1)将风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、II型的培养液经离心后的病毒液和弓形虫腹水经离心后的虫体稀释液分别加入饱和硫酸铵至饱和度达20-60％，混匀，在4℃下静置再离心分离得病毒沉淀物；(2)将病毒沉淀物溶于体积比为1∶(5-10)的0.01mol、PH＝7.0的PBS缓冲液中；(3)将上述溶解液再加入饱和硫酸铵至饱和度达20-60％进行二次沉淀，经离心分离得沉淀物，并将沉淀物按(2)步的溶解工艺溶解；(4)重复(3)步工艺至少一次，并将最后的沉淀物溶于体积比为1∶(0.5-1.5)的0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA缓冲液中。
4.如权利要求3所述的TORCH抗原纯化工艺，其特征在于所述的硫酸铵还可用硫酸钠代替，但其浓度为10-20％，其余工艺步骤和参数不变。
5.如权利要求1或2所述的TORCH抗原纯化工艺，其特征在于所述的有机溶剂沉淀工艺是将风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、II型的培养液经离心后的病毒液和弓形虫腹水经离心后的虫体稀释液分别加入乙醇和/或丙酮至浓度达50-80％进行沉淀，离心分离得病毒沉淀物，再将沉淀物溶于体积比为1∶(0.5-1.5)的0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDTA缓冲液中。
6.如权利要求1或2所述的TORCH抗原纯化工艺，其特征在于所述的非离子多聚物沉淀工艺是将采风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、II型的培养液经离心后的病毒液和弓形虫腹水经离心后的虫体稀释液分别加入葡聚糖/右旋糖酐硫酸钠至浓度达5-15％进行沉淀，离心分离得病毒沉淀物，再将深沉物溶于体积比为1∶(0.5-1.5)的0.01mol、PH8.0的Tris-HCl-0.001molEDPA缓冲液中。
7.如权利要求1所述的TORCH纯化抗原工艺，其特征在于所述的离子交换柱可选自DEAE纤维素柱、DEAE Sepharose Fast Flow柱、Qsepharose FastFlow柱中的任一种。
全文摘要
本发明涉及一种TORCH抗原纯化工艺,该工艺是将风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒培养液离心分离后和弓形虫腹水经离心分离再稀释的虫体液进行沉淀分离得沉淀物,再将沉淀物溶解,然后经透析得浓缩病毒液和弓形虫提取浓缩液,将浓缩液过DEAE类阴离子交换柱,收集各蛋白峰,包被酶标板,并用已知阳性血清做间接ELISA试验检测抗原活性高峰液收集,即为纯化TORCH;本发明的工艺收率高可达80%以上、生产的抗原纯度高、工艺简便,可批量生产、批间差异小、一个批次可生产100万人份以上的抗原。
文档编号G01N33/531GK1389731SQ0111528
公开日2003年1月8日 申请日期2001年6月1日 优先权日2001年6月1日
发明者李克生, 杜惠芬 申请人:李克生