专利名称：一种硅烷化云母基底及其在蛋白质晶体生长中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质晶体生长的基底材料领域，特别涉及一种硅烷化云母基底及其在作为蛋白质晶体生长的基底材料中的应用。
背景技术：
随着人类基因组测序的完成，由基因控制表达的各种蛋白质的结构的测定成为当今生物学家的首要任务。确切地了解每一种蛋白质的三维结构，无论是对于客观地了解蛋白质的各项功能，还是研究出直接有效的治疗药物都是非常重要的。目前蛋白质三维结构的测定很大程度上还是通过X射线衍射来实现的，因此如何获得衍射能力强的蛋白质晶体是结构测定的前提条件。但由于蛋白质分子量大、结构复杂、容易失活等特点，蛋白质晶体生长要比其他晶体困难得多。现在如何获得适合于衍射试验的蛋白晶体已经成为了制约蛋白质结构测定的瓶颈。正是因为如此，研究蛋白质晶体生长的机理，改善蛋白质晶体生长的方法和条件成为研究热点。在结晶基底材料的选择上，现实验室常用的是硅烷化玻璃片，但曾有过多种其它尝试，如多种矿物质表面、高分子聚合膜及多孔硅等等，但效果并不明显。

发明内容
本发明要解决的关键技术问题是改善用于蛋白质晶体生长用基底材料的表面性质，提供一种更适合于蛋白质晶体生长的基底材料及在该特殊基底上生长蛋白质晶体的方法。
故而本发明的目的之一是提供一种硅烷化云母基底。
上述目的是通过下列技术方案来实现
一种硅烷化云母基底，其由新解理的云母经清洗、干燥预处理后，进行硅烷化修饰，再钝化处理后制得，其特征在于该预处理中选用去离子水、乙醇或醋酸清洗。
其中，该去离子水是指其电阻率至少为18.2兆欧的水。
上述硅烷化修饰的具体步骤参见专利号ZL 00 1 16715.4，国际专利分类号GO1N 13/16，发明名称为一种用于DNA操纵的云母衬底的制造方法的中国发明专利。
而其钝化处理是指在80-150℃范围内进行30分钟至4小时的热处理。
本发明的另一目的是上述硅烷化云母基底在作为蛋白质晶体生长的基底材料中的应用。
为实现上述目的，将常规蛋白质结晶实验中的基底材料换成本发明的硅烷化云母基底，具体而言1)将各种蛋白质分别用相应的缓冲液溶解至一定浓度后取5微升滴在本发明的硅烷化云母基底表面，再取5微升相应的槽液(沉淀剂)滴入上述蛋白质溶液，充分混匀，并防止气泡生成。
2)将该滴有各种蛋白质溶液的云母基底分别覆盖到结晶板上，结晶孔中一般含有1毫升左右的槽液，并用凡士林密封。
3)将结晶板静置在相应的温度中结晶。
其中，该醋酸清洗过的硅烷化云母基底较佳的是适用于天花粉蛋白晶体生长。
在经本发明特殊方法处理后的硅烷化云母基底上进行蛋白质晶体生长，可以加快蛋白质晶体的生长过程，明显放宽其晶体生长的条件，且有效地控制蛋白质晶体生长过程中的晶核数量。本发明的积极进步效果在我们的实际应用过程中得以充分证实，下面将予实施例配以附图具体说明。


图1的A为溶菌酶晶体在硅烷化的盖玻片上，当沉淀剂的浓度下降至45％时，28天后的生长情况照片；B为溶菌酶晶体在本发明的硅烷化云母基底上，当沉淀剂的浓度下降至35％时，20天后的生长情况照片。
图2的A为溶菌酶晶体在硅烷化的盖玻片上，当沉淀剂的浓度下降至60％时，29小时后的生长情况照片；B为溶菌酶晶体在本发明的硅烷化云母基底上，当沉淀剂的浓度下降至60％时，29小时后的生长情况照片；C为溶菌酶晶体在硅烷化的盖玻片上，同样浓度下，4天后的生长情况照片；D为溶菌酶晶体在本发明的硅烷化云母基底上，同样浓度下，4天后的生长情况照片。
图3的A为天花粉蛋白在硅烷化的盖玻片上形成的晶体照片；B为天花粉蛋白在相同条件下、本发明的硅烷化云母基底上形成的晶体照片。
具体实施例方式
实施例11)用去离子水彻底清洁新解理的云母表面，然后吹干；2)取配置好的1％(体积百分数)3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)水溶液置于封口膜上(1μl/cm2，即每平方厘米云母片需用1％的APTES 1微升)，将步骤1所得的云母覆盖于液滴将其铺开，放置2分钟左右，然后用镊子夹取云母片，用重蒸水或去离子水清洗三次，再吹干(具体步骤参见专利号为ZL 00 1 16715.4的发明专利说明书)；3)对步骤2)所得硅烷化后的云母表面在80℃范围内进行约4小时的热钝化处理后即得本发明的硅烷化云母基底。
实施例21)用乙醇溶液彻底清洁新解理的云母表面，然后吹干；
2)同实施例1的步骤2)；3)对步骤2)所得硅烷化后的云母表面在120℃范围内进行约2小时的热钝化处理后即得本发明的硅烷化云母基底。
实施例31)用去离子水彻底清洁新解理的云母表面，然后吹干；2)同实施例1的步骤2)；3)对步骤2)所得硅烷化后的云母表面在150℃范围内进行约30分钟的热钝化处理后即得本发明的硅烷化云母基底。
实施例41)用醋酸溶液彻底清洁新解理的云母表面，然后吹干；2)同实施例1的步骤2)；3)对步骤2)所得硅烷化后的云母表面在120℃范围内进行约1.5小时的热钝化处理后即得本发明的硅烷化云母基底。
实施例51)用去离子水或乙醇溶液彻底清洁新解理的云母表面，然后吹干；2)同实施例1的步骤2)；3)对步骤2)所得硅烷化后的云母表面在80℃范围内进行约3小时的热钝化处理后即得本发明的硅烷化云母基底。
应用实施例1溶菌酶晶体生长选用实施例1-3的任一本发明硅烷化云母基底作为溶菌酶晶体生长的基底材料，溶菌酶的结晶的实验过程请参见Hampton公司出版的《Crystallization Research Tools》一书中关于悬滴法的介绍。其具体步骤为
1)将溶菌酶蛋白粉末用缓冲液(0.1M醋酸钠，pH4.8)溶解，浓度为50mg/ml，取5微升滴在实施例1-3的任一本发明硅烷化云母基底上，再取5微升相应的槽液(8％W/V(重量/体积百分比)氯化钠，0.1M醋酸钠，pH4.8)滴入上述溶菌酶溶液中，充分混匀，并防止气泡生成。
2)将滴有溶菌酶溶液的本发明硅烷化云母基底覆盖到结晶板上，结晶孔中含有1毫升上述槽液，并用凡士林密封。
3)将结晶板静置在室温环境中结晶。
4)逐渐降低上述槽液中的盐离子浓度，直至上述浓度的35％(即2.8％W/V氯化钠，0.035M醋酸钠)，重复步骤1)～3)。
每隔一定时间用光学显微镜观察一次晶体生长情况，并用数码相机拍照纪录。
将现常用的硅烷化盖玻片替换上述本发明的云母基底，重复步骤1)～4)，也每隔一定时间用光学显微镜观察一次晶体生长情况，并用数码相机拍照纪录以作对照。
实验结果如图1所示当槽液的浓度降低至上述浓度的45％时，在硅烷化的盖玻片上28天后还观察不到有晶体生成(图A)，但槽液的浓度降低至35％时，在本发明的云母基底上，20天后就可以观察到有较大的蛋白质晶体生成(图B)。另外，如图2所示，当槽液的浓度为上述浓度的60％时，实验开始29小时后，在本发明的云母片上就有较大的蛋白质晶体出现(图B)，而在硅烷化的盖玻片上没有观察到任何晶体(图A)，实验开始4天之后，在盖玻片上也出现了较大的蛋白质晶体(图C)，此时生长在本发明的云母基底上的蛋白质晶体尺度更大了(图D)。这说明用本发明的硅烷化云母基底作为蛋白晶体生长的基底，可促进蛋白质晶体的生长，能够将生成蛋白质晶体所必需的槽液浓度范围放宽，在同样条件下，常规的基底上长不出晶体，而在本发明的云母基底上能生长出很好的蛋白质晶体。
应用实施例2天花粉蛋白晶体生长选用实施例4或5的本发明硅烷化云母基底作为天花粉蛋白晶体生长的基底材料，天花粉蛋白的结晶的实验过程请参见科学通报(1985)，30卷，1396页。其具体步骤为1)天花粉蛋白用纯水溶解，浓度为40mg/ml，完全溶解后，1万5千转/分钟离心20分钟，取上清5微升滴在实施例4或5的本发明硅烷化云母基底上，再取5微升相应的槽液(0.075M柠檬酸缓冲液，14％W/V氯化钾，pH5.4)滴入上述天花粉蛋白溶液中，充分混匀，并防止气泡生成。
2)将滴有天花粉蛋白溶液的本发明硅烷化云母基底覆盖到结晶板上，结晶孔中含有1毫升上述槽液，并用凡士林密封。
3)将结晶板静置在室温环境中结晶。
每隔一定时间用光学显微镜观察一次晶体生长情况，并用数码相机拍照纪录。
将现常用的硅烷化盖玻片替换上述本发明的云母基底，重复步骤1)～3)，也每隔一定时间用光学显微镜观察一次晶体生长情况，并用数码相机拍照纪录以作对照。
实验结果如图3所示在相同的条件下，在两种基底上都有晶体生成，但相比较而言，在常规使用的硅烷化盖玻片上(图A)生成的晶体数目较多，尺度较小，而在本发明的云母基底上(图B)，形成的蛋白晶体数目较少，尺度较大，更适合于X射线衍射试验。
上述实施例中所用的云母为购自四川雅安云母公司的白云母；溶菌酶蛋白购自Sigma公司；天花粉蛋白取自中科院上海有机化学研究所；去离子水为电阻率至少为18.2兆欧的水，本发明是用Millipore公司生产的Milli-Q纯水系统制得；乙醇与醋酸为市售分析纯。
权利要求
1.一种硅烷化云母基底，其由新解理的云母经清洗、干燥预处理后，进行硅烷化修饰，再钝化处理后制得，其特征在于该预处理中选用去离子水、乙醇或醋酸清洗。
2.根据权利要求1所述的硅烷化云母基底，其特征在于该去离子水是指其电阻率至少为18.2兆欧的水。
3.根据权利要求1所述的硅烷化云母基底，其特征在于其钝化处理是指在80-150℃范围内进行30分钟至4小时的热处理。
4.根据权利要求1或2或3所述的硅烷化云母基底在作为蛋白质晶体生长的基底材料中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于该蛋白质是指溶菌酶或天花粉蛋白。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于该醋酸清洗过的硅烷化云母基底适用于天花粉蛋白晶体生长。
全文摘要
本发明公开一种硅烷化云母基底，其由新解理的云母经清洗、干燥预处理后，进行硅烷化修饰，再钝化处理后制得，其特征在于该预处理中选用去离子水、乙醇或醋酸清洗。本发明还公开上述经过特殊处理的硅烷化云母基底在作为蛋白质晶体生长的基底材料中的应用。其可以加快蛋白质晶体的生长过程，明显放宽晶体生长的条件，并有效地控制蛋白质晶体生长过程中的晶核数量。
文档编号G01N23/20GK1707252SQ20041002513
公开日2005年12月14日 申请日期2004年6月11日 优先权日2004年6月11日
发明者唐琳, 黄一波, 何建华, 胡钧 申请人:中国科学院上海应用物理研究所