专利名称：维生素b9酶联免疫吸附测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物技术领域，尤其涉及维生素B9酶联免疫吸附测定试剂盒。
背景技术：
维生素B9(VB9)，也就是叶酸，是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的化合物，是一种水溶性 B族维生素。叶酸作为重要的一碳载体，在核苷酸合成、同型半胱氨酸的再甲基化等诸多重要生理代谢功能方面有重要作用。因此叶酸在快速的细胞分裂和生长过程(如婴儿发育、怀孕)中有尤其重要的作用。有研究证实，人类(或其他动物)如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，还会导致身体无力、易怒、没胃口以及精神病症状。此外，研究还发现，叶酸对孕妇尤其重要。如在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可导致胎儿神经管发育缺陷，从而增加裂脑儿，无脑儿的发生率。其次，孕妇经常补充叶酸，可防止新生儿体重过轻、早产以及婴儿腭裂(兔唇)等先天性畸形。用于评价人体叶酸营养状况最常用的检测指标是红细胞叶酸及血清或血浆叶酸。目前，叶酸的测定方法主要有微生物法、放射免疫法和酶联免疫吸附测定法等。微生物法是检测生物体内叶酸的经典方法，通常所用的微生物有干酪样乳酸杆菌(L. casei)、粪链球菌和啤酒小球菌属。叶酸是干酪样乳酸杆菌(L. casei)、粪链球菌和啤酒小球菌属生长所必需的营养素。在一定条件下，L. C的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖的量以光密度值计，通过与标准曲线相比较，计算出样品中叶酸的含量。传统的微生物学检测方法有许多局限性操作繁杂，实验周期长，批间检测结果重复性差，且检测结果受样品中所含抗叶酸药物或抗生素成分的影响。放射免疫分析法(Radioimmunoassay, RIA)是利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析方法。通常先将抗原与一定量的抗体反应，然后加入一定量的标记抗原竞争反应，待反应平衡后，离心分离去除未结合的部分，测定结合部分放射性，根据标准曲线从结合率推算样品中待测抗原的量。RIA法的优点是灵敏、特异，而其技术也具有放射性同位素易衰减，不易保存，试剂有效期短、放射性污染和操作受限等弊端。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测技术是利用抗原-抗体之间特异性的免疫反应识别生物液体中的待测物，并利用酶-底物的显色反应定量的反应待测样本中靶分子的含量。由于其特异性强、灵敏度、操作简便及不需大型仪器等优点，现广泛用于生物样本的定量检测实验中。在该方法中，其中使用的试剂盒是影响检测结果准确性的关键。ELISA试剂盒中的关键因素是获得高特异性、高亲和力的抗体，但由于维生素B9分子式为C19H19N706，分子量仅为441. 4，不具备免疫原性，通过传统的免疫方法不易产生特异性的抗体。因此，获得的ELISA试剂盒不能满足实际的需要。因此，需要提供一种维生素B9酶联免疫吸附测定试剂盒以解决上述问题
实用新型内容
[0007]为了解决该问题，本实用新型公开了一种维生素B9酶联免疫吸附测定试剂盒，所述试剂盒包括固相载体，所述固相载体上设置有微孔条，所述微孔条包括微孔、包被层和封闭层。较佳地，所述固相载体采用96孔聚苯乙烯试剂板形成。较佳地，所述包被层由抗维生素B9抗体组成。较佳地，所述固相载体采用48孔聚苯乙烯试剂板形成。本实用新型的维生素B9酶联免疫吸附测定试剂盒，具有高品质，在试剂盒的特异 性、灵敏度等方面有很大的改善。在实用新型内容部分中引入了一系列简化形式的概念，这将在具体实施方式
部分中进一步详细说明。本实用新型内容部分并不意味着要试图限定出所要求保护的技术方案的关键特征和必要技术特征，更不意味着试图确定所要求保护的技术方案的保护范围。
以下结合附图，详细说明本实用新型的优点和特征。

图I是根据本实用新型一个实施例的维生素B9酶联免疫吸附测定试剂盒的酶标板沿着一列微孔的纵剖示意图。
具体实施方式
在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本实用新型更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本实用新型可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本实用新型发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。为了彻底了解本实用新型，将在下列的描述中提出详细的结构。显然，本实用新型的施行并不限定于本领域的技术人员所熟习的特殊细节。本实用新型的较佳实施例详细描述如下，然而除了这些详细描述外，本实用新型还可以具有其他实施方式。以下参考附图对本实用新型的实施例做出详细描述。参看图1，是根据本实用新型一个实施例的维生素B9酶联免疫吸附测定试剂盒的酶标板沿着一列微孔的纵剖示意图。本实用新型的试剂盒包括固相载体，该固相载体上设置有微孔条，微孔条包括微孔1，包被层2和封闭层3。其中使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体。当然也可采用48孔聚苯乙烯试剂板(PS)或其他材料的试剂板。包被层2由抗维生素B9抗体组成。上述试剂盒的只要制备方法如下。抗维生素B9特异性抗体的筛选通过购买商业化构建好的噬菌体抗体库，并进行菌液培养进行噬菌体表面呈现。以目的抗原，即维生素B9对抗体库进行筛选，采用3次“吸附-洗脱-扩增”的循环过程，去除非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选并富集抗维生素B9的特异性抗体。抗维生素B9抗体scFv的改造筛选获得的scFv只有一个抗原结合区，抗原结合力较完整的单克隆抗体低。为此，我们通过基因工程技术将抗维生素B9scFv和p53四聚功能域基因融合，其表达产物会自动组装成四聚体，使得该抗体具有四个功能区，可明显的提高对抗原的结合力(见图3)。将含融合基因的质粒转染至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，扩增培养后采用亲和层析法纯化目的抗体，并通过Western-Blot和ELISA等方法对其亲和性和特异性进行鉴定。ELISA试剂盒的制备本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定血清、血浆或红细胞样本中维生素B9的水平。制备过程如下使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗维生素B9抗体，4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。并制备及配置试剂盒的其他组分试剂，包括标准品(维生素B9)、检测液A (Biotin labeled anti_VB9)、检测液B (HRP-linked Avidin)、底物、终止液、标准品稀释液、检测液A稀释液、检测液B稀释液以及洗液，完成维生素B9的ELISA试剂盒的制备。检测维生素B9 检测样本时，依次加入待测标本及生物素化的维生素B9，标本中的维生素B9和酶标板上包被的维生素B9竞争结合抗生物素标记的VB9抗体，充分反应后，除去未结合的维生素B9，酶标板上的生物素标记的维生素B9抗体可与后续加入亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)，以3，3'结合，催化底物5，5'-四甲基联苯胺(TMB)产生蓝色可溶性物质，最后加入硫酸终止后呈黄色，于450nm检测标准品孔及样本孔O. D.值。在试剂盒的检测范围内，待测物浓度越高，样本O. D.值则越低。本实用新型的技术效果描述如下。噬菌体抗体展示技术相较传统的单克隆或多克隆抗体技术有许多优点，可以快速闻效的获得闻质量的抗体(见表I)。
权利要求1.一种维生素B9酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固相载体，所述固相载体上设置有微孔条，所述微孔条包括微孔、包被层和封闭层。
2.根据权利要求I所述的维生素B9酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于，所述固相载体采用96孔聚苯乙烯试剂板形成。
3.根据权利要求2所述的维生素B9酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于，所述包被层由抗维生素B9抗体组成。
4.根据权利要求I所述的维生素B9酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于，所述固相载体采用48孔聚苯乙烯试剂板形成。
专利摘要本实用新型公开了一种维生素B9酶联免疫吸附测定试剂盒，所述试剂盒包括固相载体，所述固相载体上设置有微孔条，所述微孔条包括微孔、包被层和封闭层。本实用新型的维生素B9酶联免疫吸附测定试剂盒，具有高品质，在试剂盒的特异性、灵敏度等方面有很大的改善。
文档编号G01N33/82GK202383146SQ20112045622
公开日2012年8月15日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者万定一, 丛旭霞, 何峰容, 姚雯, 李庆, 杨娟 申请人:武汉优尔生科技股份有限公司