专利名称：生物体试样制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物体试样制备方法。
背景技术：
以往，已知一种通过照射高输出的激光来从生物体组织的组织切片的确定区域提取碎片的技术(例如，参照非专利文献I)。提取出的碎片使用于存在于病变部位等确定区域内的核酸、蛋白质等生物体分子的分析。此时，使用色素对组织切片进行染色而能够用显微镜来识别组织形态，由此正确地判断要提取的碎片的位置。非专利文献1:Leica MICROSYSTEMS、“ > 一 廿 7 4 夕口夕' 4 七夕 3 > LeicaLMD7000”、[online]、[平成 22 年 10 月 5 日検索]、4 > 夕一才、卜〈URL:http://www.leica-microsyste ms.com/jp/products/light-microscopes/life-science-research/Iase r-microdissection/details/product/1eica-lmd7000/>

发明内容
_4] 发明要解决的问题然而，为了用组织切片的染色图像来详细地识别组织形态，需要使组织切片薄到从数ym到IOym左右。因而，存在以下问题:提取出的一个碎片所包含的生物体分子量少，为了在分析中收集足够量的生物体分子，必须使用很多组织切片来多次反复提取碎片。另一方面，通过增加组织切片的厚度能够增加从一个碎片得到的生物体分子的量。但是，在该情况下细胞、组织在厚度方向上重叠，因此组织切片整体被大致均匀地染色。因而，存在变得无法根据染色图像正确地判断要提取的碎片的位置这种问题。本发明是鉴于上述情形而完成的，目的在于提供一种通过一次操作能够从组织切片内的期望区域提取足够量的生物体分子的生物体试样制备方法。
_7] 用于解决问题的方案为了达到上述目的，本发明提供以下方法。本发明提供一种生物体试样制备方法，包括以下步骤:切薄片步骤，通过一个切断面将生物体组织切薄片；染色步骤，对通过该切薄片步骤切薄片而得到的两个组织切片内的一个组织切片进行染色；染色图像摄像步骤，获取在该染色步骤中被染色的组织切片的染色图像；无染色图像摄像步骤，针对通过上述切薄片步骤切薄片而得到的两个上述组织切片内的另一个组织切片获取定义有用于将该组织切片分割成多个碎片的分割线的无染色图像；以及对应步骤，使在该无染色图像摄像步骤中获取到的无染色图像与在上述染色图像摄像步骤中获取到的染色图像对应。根据本发明，沿着在无染色图像摄像步骤中获取到的无染色图像内的分割线来分割在切薄片步骤中切薄片而得到的另一个组织切片，由此能够制备组织切片的碎片。在该情况下，在染色步骤中进行染色、在染色图像摄像步骤中拍摄到的染色图像内的一个切片的组织形态与无染色图像内的另一组织切片的组织形态相同。因而，通过参照在对应步骤中与无染色图像内的各碎片对应的染色图像内的一个组织切片的部位，操作者能够获知各碎片所具有的组织形态，能够制备或者分析组织切片的期望区域的碎片。另夕卜，要提取碎片的组织切片不需要薄到适合于染色的薄度。因而，以在一个碎片中大量包含生物体分子的方式将另一个组织切片切成比一个组织切片厚的薄片，通过一次操作能够提取足够量的生物体分子。在上述发明中，也可以是，在上述无染色图像摄像步骤中，在能够沿着上述分割线进行分割的基板上搭载上述另一个组织切片来进行拍摄。通过设为这种结构，仅拍摄搭载于基板上的组织切片就能够获取对组织切片定义有分割线的无染色图像。在上述发明中，也可以是，上述对应步骤包括以下步骤:轮廓抽取步骤，从上述无染色图像和上述染色图像中分别抽取两个上述组织切片的轮廓；以及叠加步骤，以使通过该轮廓抽取步骤抽取出的两个上述轮廓一致的方式将上述无染色图像与上述染色图像叠加。在上述发明中，也可以是，上述对应步骤包括以下步骤:特征点抽取步骤，从上述无染色图像和上述染色图像中抽取多个相同的特征点；以及叠加步骤，以使通过该特征点抽取步骤抽取出的特征点的位置一致的方式将上述无染色图像与上述染色图像叠加。通过设为这种结构，能够使各个图像内的组织切片容易且更正确地对应。在上述发明中，也可以构成为还包括以下步骤:指定步骤，在上述对应步骤之后指定要从上述组织切片提取的上述碎片；以及回收步骤，沿着上述分割线将上述组织切片分割成多个碎片，回收在上述指定步骤中指定的上述碎片。通过设为这种结构，能够从多个碎片中选择性地回收例如由操作者指定的碎片。也可以是，在包括上述指定步骤的结构中，上述指定步骤包括以下步骤:确定步骤，根据上述染色图像来确定上述组织切片中要提取的位置；以及决定步骤，根据上述无染色图像来决定与通过该确定步骤确定的要提取的位置对应的碎片。通过设为这种结构，能够选择性地仅回收根据染色图像判断的具有期望的组织形态的碎片。在上述发明中，也可以是，还包括回收步骤，在该回收步骤中沿着上述分割线将上述组织切片分割成多个碎片，附加碎片在上述组织切片中的位置信息来回收各上述碎片。通过设为这种结构，即使在分割回收另一个组织切片之后，通过进行染色步骤、染色图像摄像步骤以及对应步骤，也能够根据位置信息参照染色图像来获知回收的各碎片具有哪种组织形态。由此，例如，在想要分析容易改性的生物体分子时等，能够优先于一个组织切片的处理来迅速地进行另一个组织切片的处理。发明的效果根据本发明，起到以下效果:通过一次操作能够从组织切片内的期望区域提取足够量的生物体分子。


图1是表示本发明的一个实施方式所涉及的生物体试样制备方法的过程的流程图。
图2A是说明无染色图像摄像步骤的图，示出分割分析用切片之前。图2B是说明无染色图像摄像步骤的图，示出分割分析用切片之后。图3是表示抽取出了染色用切片的轮廓的染色图像的图。图4是表示抽取出了分析用切片的轮廓和分割线的无染色图像的图。图5是表示将染色图像与无染色图像叠加显示的状态的图。图6是表示本实施方式所涉及的生物体试样制备方法的变形例的流程图。图7是说明在图6的生物体试样制备方法中对各碎片附加其位置信息的方法的一例的图。
具体实施例方式以下，参照

本发明的一个实施方式所涉及的生物体试样制备方法。如图1所示，本实施·方式所涉及的生物体试样制备方法具备以下步骤:切薄片步骤SI，从生物体组织切出两个组织切片1、2 ;染色步骤S2，对一个组织切片I进行染色；染色图像摄像步骤S3，对染色的一个组织切片I进行拍摄；无染色图像摄像步骤S4，在将另一个组织切片2粘贴到具有分割线3的基板4上的状态下对另一个组织切片2进行拍摄；轮廓抽取步骤(对应步骤)S5，从获取到的染色图像5和无染色图像6各自中抽取组织切片1、2的轮廓7、8 ;叠加步骤(对应步骤)S6，将染色图像5和无染色图像6叠加；指定步骤S7,根据叠加后的图像来指定要从组织切片2提取的位置；以及回收步骤S8，从另一个组织切片2回收指定的位置。在切薄片步骤SI中，制作从一个切断面切断的两个组织切片1、2。即，两个组织切片1、2具有共通的组织形态的切断面。一个组织切片(以下称为染色用切片)I被切成厚度为适合于观察染色图像的厚度的Iym到10 μ m左右的薄片。另一个组织切片(以下称为分析用切片)2比染色用切片I厚，例如被切成厚度50μπι IOOym左右的薄片。在染色步骤S2中对染色用切片I进行染色。关于染色，除了使用色素进行的染色以外，还示出与酶起反应而使生物体分子发光的处理等用于能够用各种显微镜观察生物体分子的处理，能够根据要分析的生物体分子来适当地决定。在染色图像摄像步骤S3中，使用显微镜对在染色步骤S2中被染色的染色用切片I进行放大拍摄，由此获取染色图像5。基板4只要是具有能够粘贴染色用切片I的平面的基板即可。基板4优选使用由玻璃等对可见光来说透明的材料构成以能够用显微镜来观察透过光图像的基板。基板4也可以使用由树脂、金属等对于可见光来说半透明或者不透明的材料构成的基板。在无染色图像摄像步骤S4中，例如，通过明视野显微镜对分析用切片2进行放大拍摄。如图2Α所示，在获取到的无染色图像6内与分析用切片2 —起还显示形成于基板4的分割线3。由此，能够容易地获取到对分析用切片2定义了分割线3的位置的无染色图像6。分割线3构成为操作者能够在其位置处分割基板4，例如是形成于基板4的槽。能够通过使用了激光加工、化学蚀刻、切割或者玻璃切割等的操作者的手动作业来形成槽。由此，如图2Β所示，操作者通过沿表面方向拉伸基板4，能够在分割线3的位置处将基板4分割成多个小片4a。此时，能够将粘贴在基板4上的分析用切片2也与基板4 一起沿着分割线3分割成多个碎片2a。分割线3的间隔能够根据要从分析用切片2提取的碎片2a的大小适当地变更。优选将分割线3的间隔设为0.05mm 5.0mm，使得以足够精细的位置精度从分析用切片2中提取期望区域的碎片2a，并且在提取出的碎片2a中包含足够量的生物体分子。拉伸基板4的方法并没有特别限定，但是例如通过在沿表面的方向能够伸展的粘合片上粘接基板4并向沿表面的方向拉伸粘合片，能够容易地分割基板4。分割线3例如也可以由预先分割而排列在粘合片上的多个小片4a之间的间隙构成。通过设为这种结构，在操作者沿表面方向拉伸基板4时能够更可靠地分割基板4。在轮廓抽取步骤S5中，如图3所示那样从染色图像5中抽取染色用切片I的轮廓7，并如图4所示那样从无染色图像6中抽取分析用切片2的轮廓8和分割线3。作为抽取轮廓7、8和分割线3的方法，例如能够使用利用邻接像素之间的明度的差或者微分的方法等公知的方法。也可以适当地实施图像处理以更清楚地抽取轮廓7、8。作为图像处理，例如能够举出通过伽马曲线校正、明暗调整、对比度强调、亮度的二值化、明度的反转、中值滤波器等进行的噪声去除等。在叠加步骤S6中，如图5所示，以使抽取出的两个轮廓7、8的位置一致的方式叠加显示染色图像5和无染色图像6。为了使两个轮廓7、8 —致，例如，在轮廓7、8的互相关值最大的相对位置叠加两个图像5、6即可。由此，使染色用切片I与分析用切片2的各位置对应，并且在叠加显示的图像内，以与对分析用切片2定义的位置关系相同的位置关系对染色用切片I也定义分割线3。在此，对于染色图像5和无染色图像6内的各切片1、2，有时朝向、表面和背面不同或者由于用不同的显微镜、照相机进行拍摄而倍率不同。因而，也可以使一个图像旋转、反转或者缩小放大等适当地操作图像5、6以使抽取出的轮廓7、8更可靠地一致。在指定步骤S7中，操作者通过观察叠加显示的图像中的染色图像5的组织形态来决定要提取的区域，指定配置在与决定的区域一致的位置处的碎片2a。例如，对利用分割线3进行划分而得到的碎片2a附加行编号A、B、C、D和列编号1、2、3、...，使用行编号和列编号的组合来指定要提取的碎片2a的位置。在回收步骤S8中，沿着分割线3来分割基板4和分析用切片2，选择在指定步骤S7中由操作者指定的位置的碎片2a并回收。由此，能够在碎片2a粘贴于基板4的小片4a的状态下从分析用切片2提取碎片2a，该碎片2a的的组织形态与根据染色图像5决定的区域的组织形态相同。根据回收的碎片2a，能够将例如核酸、蛋白质、糖链、类脂质等作为生物体分子进行分析。在该情况下，根据本实施方式，在从比薄染色用切片I厚的分析用切片2提取出的碎片2a中包含足够量的生物体分子。因而，具有以下优点:能够一次或者数次作业来完成以往为了收集足够分析的量的生物体分子而需要使用很多染色用切片来多次反复提取碎片的作业。另外，在这种厚分析用切片2的情况下，在厚度方向上细胞、组织重叠，因此在进行染色时对整体大致均匀地进行染色，难以用显微镜来识别组织形态。因此，制作具有与分析用切片2相同的组织形态的薄染色用切片1，通过使染色用切片I的染色图像5与分析用切片2的无染色图像6对应，能够参照染色用切片I来获知分析用切片2的各位置处的详细的组织形态。由此，具有以下优点:即使是从分析用切片2也能够提取期望部位的碎片
2β ο另外，作为使染色用切片I与分析用切片2的位置对应的方法，考虑对各个组织切片1、2的对应位置附加标记的方法。在该方法的情况下，为了决定附加标记的位置而详细比较两个组织切片1、2，需要以高位置精度附加标记。因而，存在作业烦杂并且工序数增加这种问题。与此相对，根据本实施方式，只要拍摄两个组织切片1、2并叠加显示这些图像即可，因此具有能够通过简单的作业使两个组织切片1、2对应这种优点。此外，在本实施方式中，设为在使分析用切片2的碎片2a的位置与染色用切片I的位置对应之后，分割分析用切片2来选择性地回收期望的碎片2a，但是作为代替，也可以如图6所示，在分割分析用切片2而回收全部碎片2a之后，拍摄染色图像5来使各碎片2a的位置与染色用切片I的位置对应。在该情况下，附加各碎片2a在分析用切片2内的位置信息来回收各碎片2a。例如图7所示，在将碎片2a回收至多孔板9时，使作为各碎片2a的位置信息的行编号和列编号与回收目的地的上述多孔板9的孔的位置对应并记录到列表10。由此，在回收之后也能够获知在哪一个位置的孔中收容了哪一个位置的碎片2a。通过设为这种结构，在优先进行使用了分析用切片2的处理而对各碎片2a所包含的生物体分子进行分析之后，通过从各碎片2a的位置信息中搜索并参照与该各碎片2a对应的染色用切片I的部位能·够获知各分析结果是从哪一种组织形态的碎片2a得到的结果。由此，制作分析用切片2之后到对生物体分子进行分析为止的时间缩短，因此，例如即使是mRNA那样容易分解的生物体分子，也能够趁新鲜迅速地进行分析而得到正确的分析结果。另外，在本实施方式中，设为为了使染色图像5与无染色图像6叠加而从各图像5、6中抽取组织切片1、2的轮廓7、8，但是作为代替，也可以从各图像5、6中抽取多个相同特征点，以使抽取出的特征点的位置一致的方式叠加这些图像5、6。即使这样，也能够以两个组织切片1、2完全重叠的方式叠加图像5、6。作为特征点，例如能够使用组织切片1、2的尖锐的部位、管腔构造等。对于特征点的抽取，例如通过用户输入到各图像5、6内来进行。此时指定的特征点数为两个以上即可，但是为了提高叠加时的位置精度而优选三个以上。另外，也可以抽取四个以上的特征点，从四个以上的特征点中采用三个特征点，算出所采用的三个特征点一致时的两个图像5、6的互相关值，最终采用互相关值最高时的特征点的组合。通过设为这种结构，例如即使用户所指定的特征点中存在位置在两个图像5、6之间偏离的特征点，也能够以使两个组织切片1、2更正确地一致的方式叠加两个图像5、6。另外，在本实施方式中，设为通过将分析用切片2粘贴到形成有分割线3的基板4来对分析用切片2定义分割该分析用切片2的分割线3，但是作为代替，也可以在拍摄分析用切片2之后在拍摄到的无染色图像6内定义分割线，按照定义的该分割线来分割分析用切片2。分割线可以通过由操作者输入到无染色图像6来定义，也可以通过图像处理来定义。另外，在本实施方式中，设为在使染色图像5与无染色图像6叠加的状态下指定要提取的碎片2a，但是作为代替，也可以将染色图像5和无染色图像6进行排列而分别进行显示，通过比较两个图像5、6来指定要提取的碎片2a。在该情况下，首先，观察染色图像5来确定要提取的位置(确定步骤)，将两个图像5、6内的组织切片1、2相比较，决定与确定的位置对应的位置的碎片2a (决定步骤)。即使这样，也能够从分析用切片2中指定并提取具有期望的组织形态的区域的碎片2a。另外，在本实施方式中，设为在分割分析用切片2之前拍摄无染色图像6，但是作为代替，也可以在进行分割之后对各碎片2a的无染色图像6进行拍摄，通过图像处理在分割线3的位置处将各碎片2a连接，由此再现分割前状态的分析用切片2。即使这样，也与上述实施方式同样地能够使分析用切片2与染色用切片I的位置对应。附图标记说明1:染色用切片；2:分析用切片；2a:碎片；3:分割线；4:基板；4a:小片；5:染色图像;6:无染色图像;7、8:轮廓；9:多孔板；10:列表；S1:切薄片步骤；S2:染色步骤；S3:染色图像摄像步骤；S4:无染色图像摄像步骤；S5:轮廓抽取步骤(对应步骤);S6:叠加步骤(对应步骤);S7:指定步骤；S8:回收步骤。
权利要求
1.一种生物体试样制备方法，包括以下步骤: 切薄片步骤，通过一个切断面将生物体组织切薄片； 染色步骤，对通过该切薄片步骤切薄片而得到的两个组织切片内的一个组织切片进行染色； 染色图像摄像步骤，获取在该染色步骤中被染色的组织切片的染色图像； 无染色图像摄像步骤，针对通过上述切薄片步骤切薄片而得到的上述两个组织切片内的另一个组织切片获取定义有用于将该组织切片分割成多个碎片的分割线的无染色图像；以及 对应步骤，使在该无染色图像摄像步骤中获取到的无染色图像与在上述染色图像摄像步骤中获取到的染色图像对应。
2.根据权利要求1所述的生物体试样制备方法，其特征在于， 在上述无染色图像摄像步骤中，在能够沿着上述分割线进行分割的基板上搭载上述另一个组织切片来进行拍摄。
3.根据权利要求1或者2所述的生物体试样制备方法，其特征在于， 上述对应步骤包括以下步骤: 轮廓抽取步骤，从上述无染色图像和上述染色图像中分别抽取上述两个组织切片的轮廓；以及 叠加步骤，以使通过该轮廓抽取步骤抽取出的两个上述轮廓一致的方式将上述无染色图像与上述染色图像叠加。
4.根据权利要求1或者2所述的生物体试样制备方法，其特征在于， 上述对应步骤包括以下步骤: 特征点抽取步骤，从上述无染色图像和上述染色图像中抽取多个相同的特征点；以及叠加步骤，以使通过该特征点抽取步骤抽取出的特征点的位置一致的方式将上述无染色图像与上述染色图像叠加。
5.根据权利要求1 4中的任一项所述的生物体试样制备方法，其特征在于，还包括以下步骤: 指定步骤，在上述对应步骤之后指定要从上述组织切片提取的上述碎片；以及回收步骤，沿着上述分割线将上述组织切片分割成多个碎片，回收在上述指定步骤中指定的上述碎片。
6.根据权利要求5所述的生物体试样制备方法，其特征在于， 上述指定步骤包括以下步骤: 确定步骤，根据上述染色图像来确定上述组织切片中要提取的位置；以及决定步骤，根据上述无染色图像来决定与通过该确定步骤确定的要提取的位置对应的碎片。
7.根据权利要求1 4中的任一项所述的生物体试样制备方法，其特征在于， 还包括回收步骤，在该回收步骤中沿着上述分割线将上述组织切片分割成多个碎片，附加碎片在上述组织切片中的位置信息来回收各上述碎片。
全文摘要
通过一次操作从组织切片内的期望的区域提取足够量的生物体分子。提供一种生物体试样制备方法，该生物体试样制备方法包括以下步骤切薄片步骤(S1)，通过一个切断面将生物体组织切薄片；染色步骤(S2)，对通过该切薄片步骤(S1)切薄片而得到的两个组织切片中的一个进行染色；染色图像摄像步骤(S3)，获取染色后的组织切片的染色图像；无染色图像摄像步骤(S4)，针对通过切薄片步骤(S1)切薄片而得到的另一个组织切片获取定义有用于将该组织切片分割成多个碎片的分割线的无染色图像；对应步骤(S5、S6)，使无染色图像与染色图像对应。
文档编号G01N1/30GK103221800SQ20118005531
公开日2013年7月24日 申请日期2011年7月29日 优先权日2010年11月19日
发明者森本伸彦 申请人:奥林巴斯株式会社