专利名称：一种中药注射制剂的质量检验和控制方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及对中药注射制剂进行质量检验的方法，具体而言，涉及 使用基于抗原-抗体反应原理建立的免疫分析技术，如酶联免疫吸附法、 乳胶凝集法等对中药注射制剂中残留的植物蛋白和/或多肽类物质进行 检测的方法。本发明还涉及用于该检测目的的试剂盒，以及一种中药注 射制剂的质量控制方法。
背景技术：
大多数中药注射制剂通常按照以下方法制备将中药材粉碎，加水 煎煮或进行水蒸气蒸馏提取(水提)，提取液用乙醇进行沉淀(醇沉)， 过滤，除去滤液中的乙醇，再经稀释等处理制成注射制剂。作为对传统中药剂型的一种改进，中药注射制剂具有广阔的市场前 景。但人们同时注意到，在使用中药注射制剂的过程中，经常会出现一 些不良的临床反应，例如过敏反应。这些不良反应在某种程度上限制了 中药注射制剂的使用。在中药注射制剂引起的不良反应事件中，以香丹/丹参注射液引起 的药物不良反应事件最为多见。另外，包括刺五加注射液在内的其它中 药注射液亦时有不良临床反应报道。该问题虽经业内技术人员多方探 究，但原因一直无法确定，并直接导致中药注射制剂的质量无法得到有 效的控制和提高。目前对中药注射制剂进行质量检验的方法中，例如专利 03104765. 3和200410070103. 1，多是通过红外光谱和色语等方法对制 剂中的有效成分进行检测。但临床结果表明，经这些质量检验方法被确 定为合格产品的中药注射制剂依然会引起前述不良临床反应。另外，中华人民共和国药典2005年版(一部)附录IXS注射剂有关物质检查法中提供了蛋白质检测方法"除另有规定外，取注射液 lml,加新配制的30°/。磺基水杨酸溶液lml,混匀，放置5分钟，不得出
现混浊。注射液中如含有遇酸能产生沉淀的成分，可改加鞣酸试液l-3 滴，不得出现混浊。"但是，使用该方法检验合格的中药注射制剂在临 床应用时，同样经常会有上述不良反应出现。因此，确定发生不良临床反应的原因，并寻找到有效的检测方法， 对于中药注射制剂质量的控制和提高有着至关重要的意义。发明内容本发明人在对大量中药注射制剂进行多方研究后意外地发现，中药 注射制剂中残留的低含量植物蛋白和/或多肽类物质(抗原)是造成临 床不良反应，例如过敏反应的原因之一。因此，本发明的目的之一是提供一种中药注射制剂的质量检验方法，该方法使用基于抗原-抗体反应原理建立的免疫分析:技术，如酶联 免疫吸附法、乳胶凝集法、放射免疫法和荧光免疫法等对注射制剂中的 低浓度植物蛋白和/或多肽类物质进行检测。本发明所述中药注射制剂质量检验方法包括以下步骤(1) 制备标准抗原选择制备该中药制剂的原料中药材中的 一种， 依照生产待测中药注射制剂的工艺条件，从该原料中药材中提取和纯化 其中的植物蛋白和/或多肽类物质，作为标准抗原；(2) 制备标准抗体使用标准抗原对动物如家兔等进4亍免疫处理， 并从免疫后的动物血清中提取抗体作为标准抗体；(3) 使用上述标准抗体，通过基于抗原-抗体反应原理建立的免疫分 析技术检测待测样品中相应的残留植物蛋白和/或多肽类物质；(4) 如果需要，可重复步骤(l)、 (2)及(3),依次检测该制剂中用于 制备该制剂的其它原料中药材的残留植物蛋白和/或多肽类物质。本发明的另 一个目的在于提供用于上述检测的酶联免疫吸附试剂 盒，该试剂盒包括盒体、盒体内的酶标板、阳性对照液、阴性对照液、 稀释液、洗涤液、封闭液、标准抗体、酶标抗体、底物緩冲液和终止液；本发明的再一个目的在于提供用于上述检测的乳胶凝集试剂盒，该 试剂盒包括盒体、阳性对照液、阴性对照液、乳胶偶联抗体、稀释緩 沖液、凝集板。本发明的又一个目的在于提供一种中药注射制剂的质量控制方法， 该方法通过监控注射制剂中残留的植物蛋白和/或多肽类物质的含量对 注射制剂的质量进行控制。使用本发明方法检验结果为合格的同批次产品临床使用后上述不 良临床反应明显降低。同时，使用本发明方法检验结果为不合格的中药 注射制剂，按照药典中记载的蛋白质检测方法进行检测并未检测到蛋白 质的存在。由此可知，本发明的方法灵敏度高于药典的已知检验方法。 同时，本发明方法还具有准确度高，操作简单方便，检测成本低的优点， 适合对市场上中药注射制剂进行普查式检测和中药注射制剂的质量控 制。
具体实施方式
具体而言，本发明的中药注射制剂质量检验方法包括以下步骤(1) 制备标准抗原选择制备该中药制剂的原料中药材中的 一种， 依照生产待测中药注射制剂的工艺条件，从该原料中药材中提取和纯化 其中的植物蛋白和/或多肽类物质，作为标准抗原；(2) 制备标准抗体使用标准抗原对动物如家兔等进4亍免疫处理， 并从免疫后的动物血清中提取抗体作为标准抗体；(3) 使用上述标准抗体，通过基于抗原-抗体反应原理建立的免疫分 析技术检测待测样品中相应的残留植物蛋白和/或多肽类物质；(4) 如果需要，可重复步骤(l)、 (2)及(3),依次检测该制剂中用于 制备该制剂的其它原料中药材的残留植物蛋白和/或多肽类物质。其中，标准抗原的制备可采用以下方法将用于提取标准抗原的中药材加水回流后过滤，向滤液中加入乙醇 并静置，过滤弃去滤渣后，向滤液中再次加入乙醇并再行静置、过滤， 将滤出的沉淀作为标准抗原。其中第一次加入乙醇使乙醇的体积百分比 达到50%至80%,第二次加入乙醇使乙醇的体积百分比达到70%至90%，优选将所制得的沉淀重新溶于水后冻干。此外，也可依照生产待测中药注射制剂的工艺条件，采用其他方法，如超滤等方法提取标准抗原。对动物进行免疫处理以产生标准抗体可采用例如以下方法 首先对动物注射标准抗原溶液与弗氏完全佐剂的等体积乳状混合物； 一段时间后再对动物注射标准抗原溶液与弗氏不完全佐剂的等体积乳状混合物。其中所述标准抗原溶液的浓度可为0. 2mg/ml至5mg/ml，
每次注射的乳状混合物剂量可为0.2ml至1. Oml，所述一段时间可为例 如7至24天。也可采用本领域技术人员已知的其他方法进行免疫处理。 从免疫后的动物血清中提取、纯化标准抗体可采用例如在动物血清 中加入硫酸铵溶液进行沉淀、然后再从沉淀中去除硫酸铵的方法。其中 加入辟u酸铵溶液后应偵7危酸铵的饱和度达到40%至60°/。， ^!L酸铵的去除 可通过例如透析、凝胶过滤等方法进行，任选在将标准抗体沉淀出来之 前先用较低浓度的硫酸铵溶液在血清中进行预沉淀，或者在将标准抗体 沉淀出来之后对标准抗体进行进一步纯化。此外，也可采用本领域技术人员已知的其他方法从动物血清中提取 标准抗体。基于抗原-抗体反应原理建立的免疫分析技术包括酶联免疫吸附 法、乳胶凝集法以及本领域技术人员已知的基于抗原-抗体反应原理建 立的其他免疫分析技术。其中，酶联免疫吸附法可包括以下步骤首先，在固相载体表面分别使用待测注射制剂以及阳性和阴性对照 液进行包被，并使用封闭液进行封闭；其次，使用所述标准抗体处理经过上述封闭的固相栽体；再次，使用酶标抗体处理经过上述标准抗体处理的固相载体；然后将由此获得的固相栽体与底物緩冲液接触；当与包被有阳性对照物的固相载体接触的底物緩冲液出现明显颜 色变化时，向与各固相栽体接触的底物緩冲液中分别加入终止液以终止 反应；对所得各反应溶液的吸光度进行检测，如果待测样品的反应溶液的 吸光度小于或等于阴性对照物的反应溶液的吸光度，认定待测注射制剂 质量合格；如果其吸光度大于阴性对照物的反应溶液的吸光度，认定待 测注射制剂质量不合格。使用待测注射制剂对固相载体表面进行包被时，可首先使用稀释液 将待测注射制剂稀释，再使稀释后的待测注射制剂与固相栽体相接触， 然后洗去未被固相载体吸附的物质。其中所述固相栽体可为微量滴定 板、小珠或小试管或本领域中常用的其他固相栽体。所述稀释液可为 pH值为9.6的碳酸盐緩冲液、pH值为7.2的磷酸盐緩冲液或本领域已
知的其他稀释液。待测注射制剂可被稀释至抗原浓度为1 p g/ml至200 jag/ml，优选为g/ml至150pg/ml。抗原溶液和抗体溶液的浓度采 用以下经验公式计算C(mg/ml)=0D x 1. 45—OD260nmx 0. 74其中，C为抗原或抗体浓度，OD28。加及OD26。』分别表示所述溶液在波长280nm处和260nm处的吸光度。稀释后的溶液的pH值优选为8至10。本文中"接触"的含义为 当固相栽体为微量滴定板或小试管时，将液体加入微量滴定板的板孔中 或小试管中以实现接触；当固相载体为小珠时，将小珠悬浮在液体中以 实现接触。此处所述接触的持续时间应为15至20小时。上述酶联免疫吸附法的各步骤中所述洗涤均可采用例如含有0. 05% 吐温80的pH值为7. 4的磷酸盐緩冲液作为洗涤液，也可为本领域中习 知的其他洗涤液，洗涤优选重复数次。封闭液可为含有0. 05-0. 5%的牛血清白蛋白的pH值为7. 4的鳞酸 盐緩冲液，或含有5%脱脂奶粉的pH值为7. 4的磷酸盐緩沖液，或本领 域中使用的其他已知封闭液。封闭的方法是将经过上述包被的固相载体 与封闭液接触，然后对固相栽体进行洗涤。此处所述接触的持续时间应 为1至3小时。阴性对照液可为稀释液，或者封闭液。阳性对照液可为浓度>0. 25 Mg/ml的标准抗原溶液。可通过将标准抗体用稀释液稀释至所需浓度、再将所得溶液与经过 上述封闭的固相栽体相接触、然后洗去未被吸附的物质，来实现所述使 用标准抗体对经过上述封闭的固相载体的处理。可供使用的稀释液如上 所述。标准抗体可被稀释至浓度为0. 01 mg/ml至0. lmg/ml，优选为0. 01 mg/ml至0. 05mg/ml。此处所述接触的持续时间优选为1至3小时。可通过用稀释液稀释酶标抗体、再将稀释后的酶标抗体溶液与经过 上述标准抗体处理的固相栽体相接触、然后洗去未被吸附的物质的方i。其V所述酶标抗体可为市4的辣4艮过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 或其他合适的酶标抗体。可供使用的稀释液定义如上所述。稀释后的酶标抗体的浓度取决于酶标抗体的效价，具体浓度可由本 领域技术人员用常规方法通过预备实验来确定，该浓度通常在0.1 ja g/ml至100 ja g/ml的范围内。此处所述接触的持续时间优选为1至3 小时。底物緩沖液可以是可被所述酶标抗体中的酶催化而进行反应的任 何本领域已知底物緩沖液。终止液可为浓度为2y。的辟u酸，或本领域中已知的其他终止液。 除包被过程应在o至4x:下进行之外，上述酶联免疫吸附法的其他步骤均可在25至40n下进行。此外，还可使用其他的酶联免疫吸附法进行检测。 当所述基于抗原-抗体反应原理建立的免疫分析技术为酶联免疫吸附法时，还可用于进行定量检测。具体而言，是利用一系列浓度已知的标准抗原溶液，绘制酶联免疫反应后的反应溶液的吸光度值与标准抗原浓度之间关系的标准曲线，测得待测注射制剂的吸光度值后，在标准曲线中进行插值计算即可定量推知其中该抗原的浓度。所述基于抗原-抗体反应原理建立的免疫分析技术还可为乳胶凝集法，包括以下步骤将所述标准抗体与乳胶颗粒进行共价偶联，形成乳胶偶联抗体； 将上述乳胶偶联抗体分别与待测注射制剂、阳性对照液和阴性对照液混合后在25至401C下静置；l-5分钟内，在阳性对照物中出现肉眼可见的凝集颗i)a，且阴性对照物中无凝集的条件下，如果待测样品中出现肉眼可见的凝集颗粒，则表明待测样品中含有植物蛋白和/或多肽类物质，即待测样品不合格，反之则为合格。其中乳胶颗粒可为市售的用于乳胶凝集法的乳胶颗粒，或由其他途径获得的乳胶颗粒，其直径为0. 3pm至0. 8jam。将标准抗体与乳胶颗粒共价偶联可通过例如以下方法进行 将乳胶颗粒与含有碳二亚胺(EDAC)和标准抗体的2-(F吗啡啉)乙磺酸(MES)緩冲液混合，制成乳胶颗粒悬浮液，室温下静置10-60分钟；以3000g的离心力离心5-30分钟，然后弃去上清液； 将沉淀重新悬浮于与离心分离之前的乳胶颗粒悬浮液等体积的MES 緩沖液中。
其中MES与EDAC的浓度均在0. 15-2. 6mM范围内，标准抗体的浓度 为0 mg/ml〈标准抗体浓度《2mg/ml， MES緩沖液的pH值为6.1，离心 分离之前的乳胶颗粒悬浮液中乳胶颗粒的质量百分比浓度在0. 5-2%的 范围内。也可以使用本领域中用于将乳胶颗粒与抗体共价偶联的其他方法。 待测注射制剂可用稀释緩冲液稀释，通常稀释0至11倍。 乳胶偶联抗体悬浮液的用量应为稀释后的注射制剂体积的2-5倍。 阳性对照液为用稀释緩沖液溶解的浓度为10 n g/ml至20 u g/ml的所述标准抗原的溶液，阴性对照液可为稀释緩冲液、盐水或不含所述标准抗原的其它水溶液。稀释緩沖液可为例如pH值为7.2的PBS，或MES緩冲液，或本领域已知的其他稀释液。本发明的酶联免疫试剂盒包括盒体、盒体内的酶标板、阳性对照液、阴性对照液、稀释液、洗涤液、封闭液、标准抗体、酶标抗体、底物緩冲液和终止液。此外，盒中还可以包括一系列浓度已知的标准抗原的溶液作为参考标准品用于定量检测。本发明的乳胶凝集试剂盒包括盒体、阳性对照液、阴性对照液、稀释緩沖液、乳胶偶联抗体、凝集板。本发明所称中药注射制剂是指，含有中药材提取物的各种注射制剂。下面结合具体实施例对本发明进一步说明，但本发明不限于这些具 体的实施例。实施例1酶联免疫吸附法检测含丹参提取物的注射液 1.标准抗原与标准抗体的制备与纯化取丹参10克，轻微破碎后加水80ml，回流2小时后过滤，将滤液 浓缩至40ml，加入乙醇至乙醇的体积百分比达到75%，静置20小时后 过滤，弃滤渣，滤液浓缩至33ml，再次加入乙醇至乙醇的体积百分比 达到85%,静置20小时后过滤，将所得滤渣加水溶解后冻千，制得丹 参标准抗原。使用所得丹参标准抗原对家兔进行免疫处理。家兔在进行免疫之前 先饲养一周，然后分别于第0天，第7天以1. Oml的剂量皮下多点注射
浓度为0. 5mg/ml的上述丹参标准抗原的溶液与弗氏完全佐剂的等体积 乳状混合物；第21天以1. Oml的剂量注射浓度为0. 5mg/ml的上述丹参 标准抗原的溶液与弗氏不完全佐剂的等体积乳状混合物。取免疫处理后家兔的血清2. Oml,向其中加入饱和硫酸铵溶液，使 血清溶液中硫酸铵的饱和度达到20%,于4'C静置2小时，再于4t:以 5000g的离心力离心30分钟，沉淀弃置不用。向所得上清液中再加入 饱和的硫酸铵溶液，使溶液中硫酸铵的饱和度达到50%,重复上述沉淀 分离步骤。弃去上清液，将所得沉淀溶于2. Oml稀释液(PBS， pH7. 4) 后装入透析袋中，再置于100倍的上述样本稀释液中并于41C透析24 小时，制得标准抗体，其间更换4次透析液。2.注射液中残留植物蛋白和/或多肽类物质的检测 对308批丹参注射液、丹香冠心注射液、香丹注射液样品按以下步 骤进行检测(1) 包被抗原将lml待测注射液用10ml pH值为9. 6的碳酸盐 緩冲液稀释，在微量滴定板的每孔中加入100 p 1该稀释后的待测注射 液，然后在4'C的水箱中放置16-18小时；另外用同样方法包被阳性和 阴性对照液，其中阳性对照液是使用pH值为9.6的碳酸盐緩沖液溶解 的浓度为0. 25Mg/ml的丹参标准抗原溶液，阴性对照液为pH值为9.6 的碳酸盐緩沖液；(2) 洗涤倾尽板孔中的液体，加入pH值为7.4，含有0.05%吐 温80的磷酸盐緩沖液200 nl，静置3分钟，振荡1分钟，反复3次， 最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中液体流尽；(3) 封闭每孔中加入pH值为7.4,含有5%脱脂奶的磷酸盐溶 液200jul， 37C下放置1小时；(4) 重复洗涤步骤(2);(5 )加标准抗体用pH值为7. 4的磷酸盐緩冲液将制得的标准抗 体稀释至浓度为20pg/ml,向每孔中加入100p 1， 37n下放置1.5小时；(6)重复洗涤步骤(2);(7 )加酶标抗体用pH值为7. 4的磷酸盐緩沖液将来自Santa Cruz Biotechnology的浓度为400 pg/ml的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG按1: 1000的比例稀释，每孔中加100jul， 37X:下放置l小时； (8)重复洗涤步骤(2);(9 )每孔中加入&02尿素-TMB底物緩冲液100 y 1， 37。C下在暗处 放置约15分钟。其中，所使用的H202尿素-TMB底物緩沖液按下述方法 制备首先将含有0. lmol/ml柠檬酸和0. 2mol/ml Na2HP04的溶液 993. 6ml与0. 75 %的&02尿素溶液6. 4ml混合并调节pH值至5. 2，获 得溶液A，再将200mgTMB用100ml无水乙醇溶解，加水稀释至1000 ml， 获得溶液B，将溶液A与溶液B以1:1的体积比混合，即得到HA尿素 -TMB底物緩沖液；(10)加终止液当阳性对照物的底物緩沖液出现明显颜色变化时， 向每孔中加入浓度为2。/。的硫酸溶液50ji 1;结果显示，其中有38批样品的相应吸光度大于阴性对照物的吸光 度，质量不合格；其它样品的相应吸光度小于阴性对照物的吸光度，质 量合格。3.线性范围的确定取纯化的丹参标准抗原用稀释液配制成以下系列浓度的溶液128、 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 0.5、 0. 25pg/ml，各取100 jn 1包被在96 孔酶标板上，按上述2中的步骤进行操作。以吸光度值为横坐标，以抗 原浓度对数值为纵坐标作线性回归，得线性范围为2 jli g/ml-128 ja g/ml，最低检出浓度为0.25jig/ml。实施例2 酶联免疫吸附法检测刺五加注射液 1.标准抗原和标准抗体的制备与纯化取刺五加标准药材粉碎，从中取粉末58克，第一次加水100ml煎 煮回流2小时，过滤分离煎液和滤渣，向滤渣中第二次加水80ml煎煮 回流1.5小时，再次过滤分离煎液和滤渣。合并两次煎液，过滤。将所 得滤液浓缩至90ml，加乙醇至乙醇体积百分比为70%，静置48小时后 过滤，向滤液中加入乙醇至乙醇体积为86%，静置48小时后过滤，滤 渣加水溶解后冻干，制得刺五加标准抗原。选择雄性新西兰大白兔，将其在免疫之前先饲养一周。第0天于后 肢淋巴结处以1.0ml的剂量注射浓度为2. 5mg/ml的上述标准抗原的溶
液与弗氏完全佐剂的等体积乳状混合物；第14天以1. Oml的剂量皮下 多点注射浓度为2. 5mg/ml的上述标准抗原的溶液与弗氏完全佐剂的等 体积乳状混合物；第24天以l.Oml的剂量皮下多点注射浓度为 2. 5mg/ml的上述标准抗原的溶液与弗氏不完全佐剂的等体积乳状混合 物。第34天在耳缘静脉以1. Oml的剂量注射上述标准抗原的溶液。一 周内采用凝胶双向扩散法试血，抗体效价大于等于l: 16即认为合格， 进行颈动脉采血。取兔血在室温下放置过夜，离心取血清2.0ml,向其中加入饱和石危 酸铵溶液，使血清溶液中硫酸铵的饱和度达到50%，于41C静置2小时， 再于4"C以12000g的离心力离心30分钟，取沉淀加2. Oml水溶解，加 入饱和的疏酸铵溶液，使硫酸铵的饱和度达到50%，于4t:静置2小时， 在4'C下以12000g的离心力离心30分钟，弃上清液，将沉淀溶于2. 0ml 样本稀释液(PBS， pH7.4)后装入透析袋中，再置于100倍的上述样本 稀释液中并于4X:下透析24小时，其间更换4次透析液。2.注射液中残留植物蛋白和/或多肽类物质的检测 对98批刺五加注射液按以下步骤进行检测(1) 包被抗原将lml待测注射液用10ml pH值为9. 6的碳酸盐 緩冲液稀释，在微量滴定板的每孔中加入100jul该稀释后的待测注射 液，在4。C的水箱中放置16~ 18小时。另外用同样方法包被阳性和阴 性对照液，其中阳性对照液为用pH值为9.6的碳酸盐緩沖液溶解的浓 度为0. 5jLig/ml的刺五加标准抗原溶液，阴性对照液为pH值为9.6的 碳酸盐緩沖液。(2) 洗涤倾尽板孔中的液体，加入pH值为7.4的含有0.05% 吐温80的磷酸盐緩冲液200 n 1，静置3分钟，振荡1分钟，反复3 次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中液体流尽。(3) 封闭每孔中加入含有5%脱脂奶粉的pH值为7. 4的磷酸盐 溶液200jal， 37。C下放置l小时。(4) 重复洗涤步骤(2)。(5 )加标准抗体用pH7. 4的磷酸盐緩沖液将所制标准抗体稀释 至浓度为30ng/ml向每孔中加入lOOji 1， 37。C下放置1. 5小时。 (6)重复洗涤步骤(2)。(7) 加酶标抗体用pH值为7. 4的砩酸盐緩沖液将来自Santa Cruz Biotechnology的浓度为400 p g/ml的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG按l: 1000的比例稀释，每孔中加IOO 37。C下放置l小时。(8) 重复洗涤步骤(2)。(9) 加底物緩冲液每孔中加H202尿素-TMB底物緩冲液100jLi 1， 37。C下放置约15分钟，其中所使用的H202尿素-TMB底物緩冲液与实施 例1中相同。(10) 加终止液当阳性对照物的底物緩冲液出现明显颜色变化时， 向每孔中加入浓度为2%的硫酸50 n 1。(11) 观察结果用酶标仪记录450nm的吸光度读数并与阴性对照 物进行比较。结果显示，11批样品的吸光度大于阴性对照物的吸光度，表明这 些样品中含有植物蛋白和/或多肽类物质。实施例3乳胶凝集法检测丹参注射液1. 乳胶偶联抗体的制备将lml含有O. 15mM EDAC (Sigma Prod. No. E-7750) 、 0. 15mM MES (Sigma Prod. No.M-8250 )和l mg/ml标准抗体的緩冲液(pH 6.1) 与乳胶颗粒混合，其中乳胶颗粒直径为O. 8ym，所得混合物中乳胶颗粒的质量百分比浓度为1%; 室温下静置30分钟；以3000g的离心力离心10分钟，弃去上清液； 将沉淀重新悬浮于lml MES緩沖液中。2. 乳胶凝集试验将50nl上述乳胶偶联抗体的悬浮液分别与lOjul丹参注射液(经 酶联免疫吸附法检测，其中含有抗原)、10 n 1阴性对照液和10" 1阳 性对照液在无菌玻片上混合，其中阴性对照液为PBS(pH=7.2)，阳性对 照液为浓度为2mg/ml的标准抗原的PBS(pH=7. 2)溶液。室温下静置3分钟。阳性对照物和被测丹参注射液中出现明显的凝集颗粒，阴性对照物 中没有出现凝集现象。
权利要求
1. 一种中药注射制剂的质量检验或控制方法，包括使用基于抗原-抗体反应原理建立的免疫分析技术对待测注射制剂中的植物蛋白和/或 多肽类物质进行检测。
2. 权利要求l所述的方法，包括以下步骤(1) 制备标准抗原选择制备该中药制剂的原料中药材中的一种，依 照生产待测中药注射制剂的工艺条件，从该原料中药材中提取和纯化其 中的植物蛋白和/或多肽类物质，作为标准抗原；(2) 制备标准抗体使用标准抗原对动物进行免疫处理，并从免疫后 的动物血清中提取抗体作为标准抗体；(3) 使用上述标准抗体，通过基于抗原-抗体反应原理建立的免疫分 析技术检测待测样品中相应的残留植物蛋白和/或多肽类物质；(4) 如果需要，可重复步骤(l)、 (2)及(3)，依次检测该制剂中用于 制备该制剂的其它原料中药材的残留植物蛋白和/或多肽类物质。
3. 权利要求2所述的方法，其中所述免疫分析技术为酶联免疫吸附 法、乳胶凝集法、放射免疫法或荧光免疫法。
4. 权利要求3所述的方法，其中酶联免疫吸附法包括以下步骤在固相栽体表面分别使用待测注射制剂以及阳性和阴性对照液进行 包被，并使用封闭液进行封闭；使用所述标准抗体处理经过上述封闭的固相栽体；使用酶标抗体处理经过上述标准抗体处理的固相载体；再将由此获得的固相载体与底物緩冲液接触；当与包被有阳性对照物的固相载体接触的底物緩沖液出现明显颜色 变化时，向与各固相载体接触的底物緩冲液中分别加入终止液以终止反 应；对所得各反应溶液的吸光度进行检测，如果待测样品的反应溶液的 吸光度小于或等于阴性对照物的反应溶液的吸光度，认定待测注射制剂 质量合格，如果其吸光度大于阴性对照物的反应溶液的吸光度，认定待 测注射制剂质量不合格。
5. 权利要求4所述的方法，其特征在于所述阳性对照液为浓度> 0. 25 p g/ml的标准抗原溶液。
6. 权利要求4所述的方法，其特征在于使用待测注射制剂进行包被 前，先用稀释液将待测注射制剂稀释至抗原浓度为lug/ml至200 ji g/ml。
7. 权利要求6所述的方法，其特征在于使用待测注射制剂进行包被 时，用稀释液将待测注射制剂稀释至抗原浓度为2 jag/ml至150Mg/ml。
8. 权利要求6或7所述的方法，其特征在于稀释后的待测注射制剂 的pH值为8至10。
9. 权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述稀释液为pH值为 9. 6的碳酸盐緩沖液或pH值为7. 2的磷酸盐緩冲液。
10. 权利要求4所述的方法，其特征在于使用标准抗体处理所述经 过封闭的固相载体前，先用稀释液将标准抗体的浓度稀释至0. 01 mg/ml 至0. lmg/ml。
11. 权利要求10所述的方法，其特征在于用稀释液将标准抗体的浓 度稀释至0. 01 mg/ml至0. 05mg/ml。
12. 权利要求4所述的方法，其特征在于所述酶标抗体为辣根过氧 化物酶标记的羊抗兔IgG。
13. 权利要求4或12所述的方法，其特征在于所述酶标抗体可在使 用前被稀释至浓度为0. 1 pg/ml至100ng/ml。
14. 权利要求3所述的方法，其中所述免疫分析技术为乳胶凝集法， 包括以下步骤将所述标准抗体与乳胶颗粒进行共价偶联，形成乳胶偶联抗体； 将上述乳胶偶联抗体分别与待测注射制剂、阳性对照液和阴性对照液混合，并在25至401C下静置；l-5分钟内，在阳性对照物中出现肉眼可见的凝集颗粒，且阴性对照物中无凝集的条件下，如果待测样品中出现肉眼可见的凝集颗粒，则表明待测样品中含有植物蛋白和/或多肽类物质，即待测样品不合格，反之则为合格。
15. 权利要求14所述的方法，其特征在于所述阳性对照液为用稀释 緩冲液溶解的浓度为10pg/ml至20pg/ml的所述标准抗原的溶液。
16. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述注射制剂中含有 丹参提取物或刺五加提取物。
17. 权利要求3或4所述的方法，所述方法中还包括利用一系列浓 度已知的标准抗原溶液，绘制酶联免疫反应后的反应溶液的吸光度值与 标准抗原浓度之间关系的标准曲线，测得待测注射制剂在酶联免疫反应 后的反应溶液的吸光度值后，在标准曲线中进行插值计算即可定量推知 其中该标准抗原的浓度。
18. 用于对中药注射制剂中残留植物蛋白和/或多肽类物质进行检测 的酶联免疫试剂盒，包括盒体、盒体内的酶标板、阳性对照液、阴性对 照液、稀释液、洗涤液、封闭液、标准抗体、酶标抗体、底物緩冲液和 终止液，其特征在于所述标准抗体按照以下方法制得选择制备待测中 药制剂的原料中药材中的一种，依照生产待测中药注射制剂的工艺条件， 从该原料中药材中提取和纯化其中的植物蛋白和/或多肽类物质，作为标 准抗原，然后使用标准抗原对动物进行免疫处理，并从免疫后的动物血 清中提取抗体作为标准抗体；如果需要，可以按照上述步骤制取相应于该制剂中不同的原料中药材的标准抗体以供测试之用。
19. 权利要求18的酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于盒中还包括 用于制作标准曲线的参考标准品。
20. 用于对中药注射制剂中残留植物蛋白和/或多肽类物质进行检 测的乳胶凝集试剂盒，包括盒体、阳性对照液、阴性对照液、乳胶偶联 抗体、凝集板，其特征在于所述标准抗体按照以下方法制得选择制备 待测中药制剂的原料中药材中的 一 种，依照生产待测中药注射制剂的工 艺条件，从该原料中药材中提取和纯化其中的植物蛋白和/或多肽类物 质，作为标准抗原，然后使用标准抗原对动物进行免疫处理，并从免疫 后的动物血清中提取抗体作为标准抗体；如果需要，可以按照上述步骤 制取相应于该制剂中不同的原料中药材的标准抗体以供测试之用。
21. 权利要求18至20之一的试剂盒，其特征在于所述中药注射制 剂为含有丹参提取物或刺五加提取物的中药注射制剂。
全文摘要
本发明提供一种中药注射制剂的质量检验方法，该方法使用基于抗原-抗体反应原理建立的免疫分析技术对注射制剂中的低浓度植物蛋白和/或多肽类物质进行检测。所述方法包括以下步骤(1)制备标准抗原；(2)制备标准抗体；(3)使用上述标准抗体，通过基于抗原-抗体反应原理建立的免疫分析技术检测待测样品中相应的残留植物蛋白和/或多肽类物质；(4)如果需要，可重复步骤(1)、(2)及(3)，依次检测该制剂中用于制备该制剂的其它原料中药材的残留植物蛋白和/或多肽类物质。本发明的检测方法不但可以进行定性检测，还可以进行定量检测。本发明还提供用于该方法的酶联免疫吸附试剂盒和乳胶凝集试剂盒，以及一种中药注射制剂的质量控制方法。
文档编号G01N21/25GK101122602SQ20071014956
公开日2008年2月13日 申请日期2007年9月6日 优先权日2007年9月6日
发明者于风平, 崔生辉, 晨 王, 胡昌勤, 许明哲 申请人:中国药品生物制品检定所