专利名称：一种真假蜂胶的鉴别方法
技术领域：
本发明涉及一种真假蜂胶的鉴别方法，特别涉及一种利用生物酶蛋白显色法鉴别真假蜂胶的方法，属于生物医药领域。
背景技术：
蜂胶(Propolis)是蜜蜂将采自胶源植物的枝条、叶芽及愈伤组织的脂类分泌物与密封本身的上颚腺、蜡腺等的分泌物同少量花粉釀制后形成的粘性物质。味苦辛，性寒， 归脾、胃经，呈棕黄色或黄褐色固体块状，遇热变软具粘性，特有芳香气味。内服蜂胶能补虚弱、化浊脂、止消渴，用于体虚早衰、高脂血症、消渴；外用蜂胶能解毒消肿，用于皮肤皲裂、 烧烫伤。另外，蜂胶作为保健食品主要有免疫调节的功效，还可辅助抗氧化、调节血脂、血压、血糖、辅助保护胃粘膜等保健功能。但是，大约IOOg左右的蜂胶需要5万只蜜蜂采集1 年才能得到，非常珍贵，因此蜂胶有“紫黄金”之称。据中国蜂产品协会统计，我国蜂胶每年产量约300吨。然而据业内人士透露，我国蜂胶每年的实际销量却将近1000吨。那么这些多出来的蜂胶又是从哪冒出来的呢？中国蜂产品协会给出的结果是目前市场上有一半以上蜂胶产品是假的。假蜂胶一般是指杨树芽胶或掺了杨树芽胶的蜂胶。杨树芽胶是由人工采集杨树芽，经高温蒸煮熬出芽孢的胶状物质，再经乙醇浸泡提取和浓缩得到的黑色胶状物质。《蜂胶国家标准》明确规定，非蜜蜂采集，人工加工而成的任何树脂胶状物不能称之为蜂胶，更不允许添加到真正的蜂胶里面。与蜂胶相比，假蜂胶价格低廉，生理活性物质含量得不到保证，更无法保证安全。所以对真假蜂胶的辨别关乎人们的食品安全，非常重要。目前，现有的鉴别真假蜂胶的方法包括感官辨别和仪器检测。现有的感官辨别方法有很多，例如(1)外观在常温下，蜂胶是不透明的固体，块状蜂胶表面光滑或粗糙，折断面呈沙粒状，似大理石；国产蜂胶原料颜色呈棕褐色、棕红色或灰褐色，少数为黄绿色，也有黑色；(2) 口感嚼开尝，好的蜂胶在嚼服入口的那一瞬间， 虽然会感到辛辣，但是一下子便会自然消失，随之而来的是清爽的感觉；而劣质蜂胶在嚼开后则会让人有想呕吐的感觉。但是感官辨别方法主观性大，鉴定结果不可靠。现有的仪器检测主要有指纹图谱法、分光光度比色测定总黄酮评价法、有机酸含量判断法、GC-MS鉴定成分法、热分析法、肉桂酸与对-香豆酸以及黄酮类含量法、癸烯酸含量法、糖类成分法等。目前的仪器检测大都基于对蜂胶中黄酮的检测。所谓的“黄酮”，在 《蜂胶国家标准》中统称为“总黄酮”。按照国家标准规定，“总黄酮”含量是检验蜂胶的一项重要指标。蜂胶之所以有良好的保健效果是因为蜂胶中含有大量的黄酮类物质，但这种物质在人体内不能合成，只能从饮食中摄取。但是中央电视台在2010年11月份曝光了“销售假蜂胶”的节目，引起了社会轰动，其中提到，造假者为了产品能够检测合格，会偷偷往假蜂胶里加一些神秘的原料，其中一种黄色的粉末是槲皮素，此外还有芦丁。这是因为，槲皮素和芦丁都是人工提取的黄酮类物质，添加在“假蜂胶”中，用以提高其总黄酮的含量，以次充好，蒙混过关。由此看，仅仅对蜂胶中黄酮的量进行检测难以将假蜂胶鉴别出来。另外，仪器检测的方法虽然较感官辨别更客观，但是所用仪器设备昂贵，一个色谱动辄几十万甚至上百万，而且步骤复杂，人力、物力和时间成本非常昂贵。另外，浙江大学动物科学学院的章彬佳、胡福良(《蜂胶中酶活力的测定》，中国蜂业，2008年第59卷第6期)认为蜜蜂在采胶过程中可能添加进了腺体分泌物，尝试对蜂胶中的α-淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶的活力进行了研究，以期从特征组分酶的角度探讨蜂胶真伪鉴别问题。但实验结果表明不同地区的蜂胶及混合蜂胶反应时间小于45min时，检测不到三种酶；当混合蜂胶、新鲜蜂胶反应时间达池以上，未检测到α-淀粉酶，而在检测蔗糖酶和蛋白酶时测试管与阴性对照管出现明显色差，证明两种酶的存在，但活力较小，结果表明要从这3种酶活力的角度来鉴别蜂胶真伪有很大的难度。综上，目前急需开发一种灵敏、简易、低成本、准确可信的假蜂胶的鉴别方法，以保证市场的正常秩序和消费者的权益。

发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种真假蜂胶的鉴别方法。蜂胶的形成过程非常复杂，是蜜蜂以胶源植物的新生枝芽处采集的树脂类物质， 经过蜜蜂混入其上颚腺、蜡腺分泌物反复咀嚼加工而成的胶状物质。因此，蜂胶中除了含有黄酮类化合物之外，生物酶也是组成蜂胶广泛生物活性的重要物质。而假蜂胶是采用植物的枝条、叶芽及愈伤组织直接提炼熬制，没有经过与蜜蜂上颚腺、蜡腺等的分泌物同少量花粉酿制的生化过程。因此生物酶蛋白的存在与否，存量水平是区别真假蜂胶的特征指标。 本发明虽然以生物酶为检测目标物，但是并不检测其活性，而是以组成生物酶的蛋白质和多肽为目标物，即通过显色反应对蜂胶中的生物酶蛋白的含量进行显色从而鉴别蜂胶的真假。本发明通过如下技术方案实现一种真假蜂胶的鉴别方法，具体步骤包括(1)配制蜂胶溶液；⑵配制显色液；(3)进行显色反应；⑷比色判定。本发明的优选技术方案为一种真假蜂胶的鉴别方法，具体步骤包括(1)将蜂胶溶于水得到蜂胶的水溶液；(2)配制蛋白显色液；(3)将步骤(2)得到的显色液滴加到步骤(1)得到的蜂胶水溶液中，进行显色反应；(4)观察显色反应，比色判定蜂胶的真假。本发明的进一步优选技术方案为一种真假蜂胶的鉴别方法，具体步骤包括(1)配制蜂胶溶液准确称取1. 8000 2. 2000g的6_10批已知的真蜂胶和1_6批待测蜂胶，分别置于IOOml烧杯中，向各烧杯中准确加入去离子水10. 00ml，得到蜂胶和去离子水的混合液；将所得混合液超声溶解，过滤得到蜂胶的去离子水溶液；(2)配制显色液配置缩二脲显色液；配置茚三酮显色液；配置考马斯亮蓝G250 显色液；(3)进行显色反应吸取步骤(1)得到的蜂胶的去离子水溶液2. 0ml，移入纳氏比色管中，滴加步骤( 配置的显色液8-12滴，观测颜色变化；
(4)比色判定a、缩二脲比色反应中，真蜂胶的显色为黄绿色，显色不是黄绿色判定为假蜂胶，显色与黄绿色深浅不一致的蜂胶判定为掺假蜂胶；b、茚三酮比色反应中，真蜂胶的显色为紫红色，显色不是紫红色判定为假蜂胶，显色与紫红色深浅不一致判定为掺假蜂胶；C、考马斯亮蓝G250比色反应中，真蜂胶的显色为墨绿色，显色不是墨绿色判定为假蜂胶，显色与墨绿色深浅不一致判定为掺假蜂胶。本发明采用超声的方法将蜂胶完全溶于水中，一方面能够缩短溶解的时间，另一方面因超声温度不高，避免了高温对蜂胶中酶活性的破坏。优选地，本发明所述的超声功率为 200W-500W，例如 200W、201W、230W、300W、400W、490W、498W、500W，优选 300W-400W, 特别优选:350W ；温度为 40 V -80 V，例如 40 °C >41 °C >45 °C >50 °C >70 °C >78 °C >80 V，优选 500C _70°C，特别优选 60°C;超声时间为 20-50min，例如 20min、21min、28min、35min、46min、 49min、50min，优选 20_40min，特别优选 30min。双缩脲反应(Biuret Reaction)是在强碱性溶液中，双缩脲(NH3C0NHC0NH3)与铜离子(Cu2+)形成有络合物的显色反应。所生产的显色溶液在MOnm波长处有最大吸收，是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。双缩脲显色反应的所显颜色深浅与蛋白质的含量关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关。双缩脲反应使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1 IOmg蛋白质。本发明所述的双缩脲显示剂的配制是常规的实验室操作，本领域技术人员可根据自己掌握的技术知识或查阅相关文献进行，典型但非限制性的操作步骤为称取硫酸铜 1. 5g和酒石酸钾钠6. 0g，加水500ml使其溶解，边搅拌边加入浓度为IOwt^的氢氧化钠溶液300ml，用水稀释至1000ml，混勻，即得双缩脲显色液，本试剂如有黑色沉淀出现，应重新配制。本发明中，所述缩二脲比色反应中，黄绿色为阳性，判定为真蜂胶；色调与颜色深浅与黄绿色不一致为阴性，其中，不是黄绿色(即总色差△ E与真蜂胶所显黄绿色相比偏差大于50% )判定为假蜂胶，与黄绿色颜色深浅不一致(即总色差ΔΕ与真蜂胶所显黄绿色相比偏差为30% -50% )判定为掺假蜂胶。所述掺假蜂胶即为向采用植物的枝条、叶芽及愈伤组织直接提炼熬制的假蜂胶中添加部分真蜂胶的蜂胶产品。茚三酮反应是2，2- 二羟基-1，3-茚三酮与氨基酸、肽类或蛋白质的游离α _氨基或其他氨基化合物所产生的一种显色反应，其通常的反应显色成紫色，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生(亮)黄色物质，可用作定性检测。本发明所述的茚三酮显示剂的配制是常规的实验室操作，本领域技术人员可根据自己掌握的技术知识或查阅相关文献进行，典型但非限制性的操作步骤为称取茚三酮试剂2g，加化学试剂95%乙醇使溶解成IOOml即得茚三酮显色液。本发明中，所述茚三酮比色反应，真蜂胶的显色为紫红色，显色不是紫红色(即总色差ΔΕ与真蜂胶所显紫红色相比偏差大于50% )判定为假蜂胶，显色与紫红色深浅不一致(即总色差ΔΕ与真蜂胶所显紫红色相比偏差为30% -50% )判定为掺假蜂胶。考马斯亮蓝法(Bradford)是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465nm变为595nm，蛋白质在1-1000 yg范围内，蛋白质-色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。本发明所述考马斯亮蓝反应，优选考马斯亮蓝G250反应。本发明所述的考马斯亮蓝G250显示剂的配制是常规的实验室操作，本领域技术人员可根据自己掌握的技术知识或查阅相关文献进行，典型但非限制性的操作步骤为称取考马斯亮蓝G2500. Olg，加乙醇5ml溶解后，加磷酸10ml，加水稀释至100ml，混勻、滤过， 取滤液，即得考马斯亮蓝G250显色液。将配制好的考马斯亮蓝G250显色液储存在60ml棕色瓶中。本发明中，所述考马斯亮蓝G250比色反应中，真蜂胶的显色为墨绿色，显色不是墨绿色(即总色差ΔΕ与真蜂胶所显墨绿色相比偏差大于50% )判定为假蜂胶，显色与墨绿色深浅不一致(即总色差ΔΕ与真蜂胶所显墨绿色相比偏差为30% -50% )判定为掺假蜂胶。本发明所述显色反应所显颜色可通过GB/T3979《物体色的测量方法》获得，本领域技术人员有能力获取相关方法，此处不再赘述。本发明所显颜色可通过目测或色差仪测定。本发明所述的显色反应通过蛋白显色反应进行，优选缩二脲反应、茚三酮反应、考马斯亮蓝G250反应中的1种或至少2种的组合进行，优选缩二脲反应/茚三酮反应/考马斯亮蓝G250反应的组合。所述组合的意思是指，选用的显色反应均为阳性则判定待测样为真蜂胶，例如选择缩二脲反应，则当缩二脲显色为阳性则判定待测样为真蜂胶；如选择缩二脲\茚三酮组合则只有当缩二脲和茚三酮的显色反应均为阳性则判定待测样为真蜂胶；如选择缩二脲反应/茚三酮反应/考马斯亮蓝G250反应的组合，则只有当缩二脲反应/茚三酮反应/考马斯亮蓝G250反应的组合均为阳性才能判定待测样为真蜂胶，否则有一个显色反应为阴性即判定为假蜂胶。本发明可选的技术方案包括一种真假蜂胶的鉴别方法，具体步骤包括(1)配制蜂胶溶液准确称取1. 8000 2. 2000g的6_10批已知的真蜂胶和1_6批待测蜂胶，分别置于IOOml烧杯中，向各烧杯中准确加入去离子水10. 00ml，得到蜂胶和去离子水的混合液；将所得混合液在功率为300W，温度为60°C条件下超声30min，过滤得到蜂胶的去离子水溶液；(2)配制显色液(I)配置缩二脲显色液称取硫酸铜1. 5g和酒石酸钾钠6. Og,加水500ml使其溶解，边搅拌边加入浓度为IOwt^的氢氧化钠溶液300ml，用水稀释至1000ml，混勻，即得双缩脲显色液，本试剂如有黑色沉淀出现，应重新配制；(II)配置茚三酮显色液称取茚三酮试剂2g，加乙醇使溶解成IOOml即得茚三酮显色液；(III)配置考马斯亮蓝G250显色液称取考马斯亮蓝G2500. Olg，加乙醇5ml溶解后，加磷酸10ml，加水稀释至100ml，混勻、滤过，取滤液，即得考马斯亮蓝G250显色液。将配制好的考马斯亮蓝G250显色液储存在60ml棕色瓶中；(3)进行显色反应吸取步骤(1)得到的蜂胶的去离子水溶液2. 0ml，移入纳氏比色管中，滴加步骤( 配置的显色液10滴，观测颜色变化；(4)比色判定a、缩二脲比色反应中，真蜂胶的显色为黄绿色(总色差ΔΕ的偏差范围小于等于30%)，显色不是黄绿色(即总色差△ E与真蜂胶所显黄绿色相比偏差大于 50% )判定为假蜂胶，显色与黄绿色深浅不一致(即总色差ΔΕ与真蜂胶所显黄绿色相比偏差为30% -50% )的蜂胶判定为掺假蜂胶；b、茚三酮比色反应中，真蜂胶的显色为紫红色(总色差ΔΕ的偏差范围小于等于30%)，显色不是紫红色(即总色差ΔΕ与真蜂胶所显紫红色相比偏差大于50%)判定为假蜂胶，显色与紫红色深浅不一致(即总色差ΔΕ与真蜂胶所显紫红色相比偏差为 30% -50% )判定为掺假蜂胶；C、考马斯亮蓝G250比色反应中，真蜂胶的显色为墨绿色(总色差Δ E的偏差范围小于等于30 % )，显色不是墨绿色(即总色差△ E与真蜂胶所显墨绿色相比偏差大于50 % ) 判定为假蜂胶，显色与墨绿色深浅不一致(即总色差△ E与真蜂胶所显墨绿色相比偏差为 30% -50% )判定为掺假蜂胶。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1、与仪器检测相比，本发明大大降低了检测成本和操作时间。本发明以组成生物酶的蛋白质和多肽为目标物，即通过显色反应对蜂胶中的生物酶蛋白的含量进行显色从而鉴别蜂胶的真假。仪器检测多采用HPLC、GC、GC-MS等仪器设备，这些仪器设备价格昂贵，动辄几十万上百万，另外仪器设备的化学试剂消耗也是非常大的，这些对生产厂家是非常大的一笔开支；而本发明只需要比色管、试管架、超声仪等实验室常用设备，无需添加昂贵的色谱仪，所需试剂也是生物医药领域常用的价格低廉的蛋白显色剂。较之仪器检测的方法检测成本大为降低，非常适宜广泛推广。本发明的检测过程简单，即配置样品和显色液-显色-判定，操作时间不会超过池。而仪器检测一般要经过复杂的前处理过程、色谱分离过程、数据分析过程，操作时间至少1天，像是指纹图谱检测法更是需要一个建立指纹图谱库的几天甚至几星期的漫长过程。2、与感官鉴别相比，本发明的判定结果准确可信。本发明人发现真假蜂胶在相同标示浓度及相同显色条件下显色强度相差甚远，基于此用以鉴别真假蜂胶。而现有的感官鉴别仅是从外观形态、口感等方面进行判定，没有固定的判定界限，判定结果非常不能令人信服。与感官鉴别相比，本发明更能为真假蜂胶的判定提供可信的依据。


图1为实施例一中缩二脲比色反应的比色结果。图2为实施例一中茚三酮比色反应的比色结果。图3为实施例一中考马斯亮蓝G250比色反应的比色结果。图4为对比例三中真假蜂胶TLC法的测定结果。图5为对比例三中真假蜂胶TLC法的测定结果。图6为对比例四中真假蜂胶TLC法的测定结果。
具体实施例方式为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。实施例一(1)配制蜂胶溶液准确称取2. OOOOg的6批已知的真蜂胶(标记为A、B、C、D、E、 F)和6批假蜂胶(标记为a、b、C、d、e、f)，分别置于IOOml烧杯中，向各烧杯中准确加入去离子水10. 00ml，得到蜂胶和去离子水的混合液；将所得混合液在功率为300W，温度为60°C 条件下超声30min，过滤得到蜂胶的去离子水溶液。(注本实施例中的真假蜂胶均为通过色谱法确定的真假蜂胶样品)(2)配制显色液(I)配置缩二脲显色液称取硫酸铜1. 5g和酒石酸钾钠6. Og,加水500ml使其溶解，边搅拌边加入浓度为IOwt^的氢氧化钠溶液300ml，用水稀释至1000ml，混勻，即得双缩脲显色液；(II)配置茚三酮显色液称取茚三酮试剂2g，加化学试剂95 %乙醇使溶解成 IOOml即得茚三酮显色液；(III)配置考马斯亮蓝G250显色液称取考马斯亮蓝G2500. Olg，加乙醇5ml溶解后，加磷酸10ml，加水稀释至100ml，混勻、滤过，取滤液，即得考马斯亮蓝G250显色液。(3)进行显色反应吸取步骤(1)得到的蜂胶的去离子水溶液2. 0ml，移入纳氏比色管中，滴加步骤( 配置的显色液10滴，观测颜色变化。(4)目视比色判定a、缩二脲比色反应中，A、B、C、D、E、F显色为黄绿色，阳性；a、 b、d、e显色为蓝绿色，色差大于60%，阴性，判定为假蜂胶；c、f为颜色较深的黄绿色，色差为30% _50%，判定为掺假蜂胶。图1为缩二脲比色反应的比色结果。b、茚三酮比色反应中，A、B、C、D、E、F显色为棕色背景下的紫红色，阳性；a、b、d、e 为蓝黑色，阴性，色差大于50%，判定为假蜂胶；c、f为颜色较深的紫棕色，与真蜂胶的色差为30% _35%，判定为掺假蜂胶。图2为茚三酮比色反应的比色结果。C、考马斯亮蓝G250比色反应中，A、B、C、D、E、F显色为蓝绿色，阳性；a、b、d、e、f 显色为亮蓝色，色差大于60%，阴性，判定为假蜂胶，c为墨绿色，色差为40-50%，判定为掺假蜂胶。图3为考马斯亮蓝G250比色反应的比色结果。综上，通过缩二脲反应/茚三酮反应/考马斯亮蓝G250反应的综合结果可以看出，假蜂胶a、b、d、e以及掺假蜂胶c、f完全可以被鉴别出来。实施例二(1)配制蜂胶溶液准确称取2. OOOOg的6批已知的真蜂胶(标记为Al、Bi、Cl、 DUEU Fl)和2批待测蜂胶(标记为al、bl)，分别置于IOOml烧杯中，向各烧杯中准确加入去离子水10. 00ml，得到蜂胶和去离子水的混合液；将所得混合液在功率为500W，温度为 40°C条件下超声20min，过滤得到各蜂胶的去离子水溶液。(注本实施例中的真蜂胶均为通过色谱法确定的真假蜂胶样品)(2)配制显色液称取考马斯亮蓝G2500. Olg，加乙醇5ml溶解后，加磷酸10ml，加水稀释至100ml，混勻、滤过，取滤液，即得考马斯亮蓝G250显色液。(3)进行显色反应吸取步骤(1)得到的蜂胶的去离子水溶液2. 0ml，移入纳氏比色管中，滴加步骤( 配置的显色液8滴，观测颜色变化。(4)比色判定A1、B1、C1、D1、E1、F1显色为蓝绿色且色差的偏差范围在30%以内， 阳性；al为蓝绿色，且色差落在真蜂胶的测定范围内，阳性，为真蜂胶；bl为天蓝色，色差大于60%，阴性，假蜂胶。结果al样为真蜂胶，bl样为假蜂胶。对比例一总黄酮的碱性铝离子络合鉴别反应甘草黄酮与铝离子先经亚硝酰化络合产生络合物，该络合物在碱性条件下经互变异构生成红色醌式结构，产物的吸光度和甘草黄酮浓度在一定范围内符合朗白-比尔定律。
OH
OH + NaNO2
NaNO2 +"
O + Al3+ + HNO2
谓O
亚硝酰化络合
2
醌式化
O + NaOH
O=N
"O—N
(红色)样品供试液的制备平行称取同重量的真胶样品6批，在超声波提取器上加相同体积的80 %乙醇超声提取15min，过滤，收集滤液，编号为A、B、C、D、E、F ；平行称取假胶样品6批，同真胶样品操作，得假胶供试液，编号为a、b、c、d、e、f。在上述两组批供试液中，平行用ImL吸量管吸取上述供试液0. 05mL,置入IOmL容量瓶中，先加入5%的NaNO2溶液0. 3mL，摇勻，放置2min，再加入10% Al (NO3) 3溶液0. 3mL， 摇勻，放置2min，再加入4%的NaOH溶液4mL，摇勻，最后用去离子水定容至刻度，摇勻。 20min后比较所生成红色的深浅。(注本实施例中的真假蜂胶均为通过色谱法确定的真假蜂胶样品)
结果6批真胶样品和6批假胶样品没有区别，个别假胶样品比真胶样品所显红色对比例二酸性KMnO4滴定法
高锰酸钾滴定测定茶多酚含量。其原理是茶叶中茶多酚易溶于热水中，在用靛红作指示剂的情况下，样液中能被KMnO4氧化的物质基本上都属于茶多酚类物质。根据KMnO4还深。和茶多酚间的当量关系计算出茶多酚的含量。在对比例1所述两组12批供试液中，平行用ImL吸量管吸取上述供试液0. 05mL, 置入IOmL容量瓶中，先加入15%硫酸1滴。用0. 01mol/L的KMnO4滴入样品溶液中1 后不褪色，认为蜂胶中的还原性物质与KMnO4反应完全，到达滴定终点。(注本实施例中的真假蜂胶均为通过色谱法确定的真假蜂胶样品)结果6批真胶样品和6批假胶样品没有区别，个别假胶样品比真胶样品所消耗 KMnO4还多。由对比例一和对比例二采用的是现有技术，与之相比，实施例一所采用的本发明方法操作简单且准确度高。对比例三薄层色谱(TLC)法(1)取实施例一中配制的6批真蜂胶和6批假蜂胶进行实验。(2)薄层色谱条件硅胶G薄层板；流动相展开剂苯乙酸乙酯=3 7 ；上行法展至距板上端5cm ；紫外分析灯UV366nm下检测荧光斑点以及经流动相展开剂展开后的点板。(3)结果6批真蜂胶原点荧光强且均勻一致；6批假蜂胶荧光有两批特强(判定为掺假蜂胶)，其余四批皆非常弱(判定为假蜂胶)。图4、图5为真假蜂胶TLC法的测定结^ ο对比例四薄层色谱(TLC)法(1)取实施例一中配制的6批真蜂胶和6批假蜂胶进行实验。(2)薄层色谱条件硅胶G薄层板；流动相展开剂甲苯乙酸乙酯冰醋酸= 11 2 0.2 ；上行法展至距板上端5cm;紫外分析灯UV366nm下检测荧光斑点以及经流动相展开剂展开后的点板。(3)结果6批真蜂胶原点荧光强且均勻一致；6批假蜂胶荧光有两批特强(判定为掺假蜂胶)，其余四批有强有弱且不均勻(判定为假蜂胶)。图6为真假蜂胶TLC法的测
定结果。对比例三和对比例四为现有技术，原理是通过测定蜂胶中的黄酮来对真假蜂胶进行辨别，与之相比，实施例一所得结论与之一致。但对比例一的实验过程用到苯等有机溶剂，并且所用紫外灯对人皮肤伤害极大，而本发明的试验方法所用溶剂仅为水和乙醇，并不用紫外灯，对人体伤害极小。由此，采用本发明安全，并且结果可靠真实。申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程， 但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进， 对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
权利要求
1.一种真假蜂胶的鉴别方法，其特征在于，所述鉴别方法通过鉴定生物酶蛋白的含量来进行。
2.如权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，所述生物酶蛋白的含量鉴定通过蛋白显色反应进行，优选缩二脲反应、茚三酮反应、考马斯亮蓝反应中的1种或至少2种的组合进行，优选缩二脲反应/茚三酮反应/考马斯亮蓝G250反应的组合。
3.如权利要求1或2所述的鉴别方法，其特征在于，所述的鉴别方法的步骤包括(1) 配制蜂胶溶液；(2)配制显色液；(3)进行显色反应；(4)比色判定。
4.如权利要求1-3任一项所述的鉴别方法，其特征在于，所述的鉴别方法的步骤包括 (1)将蜂胶溶于水得到蜂胶的水溶液；( 配制蛋白显色液；C3)将步骤( 得到的显色液滴加到步骤(1)得到的蜂胶水溶液中，进行显色反应；(4)观察显色反应，比色判定蜂胶的真假。
5.如权利要求1-4任一项所述的鉴别方法，其特征在于，步骤(1)所述蜂胶溶液为6-10批真蜂胶和1-6批待测蜂胶；所述蜂胶溶液的配置步骤为准确称取1. 8000 2. 2000g的各批蜂胶，分别置于IOOml烧杯中，向各烧杯中准确加入去离子水10. 00ml，得到蜂胶和去离子水的混合液；将所得混合液在功率为200W-500W，温度为40°C _80°C条件下超声20-50min，过滤得到蜂胶的去离子水溶液。
6.如权利要求1-5任一项所述的鉴别方法，其特征在于，步骤(2)所述显色液为缩二脲显色液、茚三酮显色液、考马斯亮蓝G250显色液中的1种或至少2种的组合。
7.如权利要求1-6任一项所述的鉴别方法，其特征在于，步骤(3)所述显示反应操作步骤为吸取步骤(1)得到的蜂胶的去离子水溶液2. 0ml，移入纳氏比色管中，滴加步骤(2) 配置的显色液8-12滴，观测颜色变化。
8.如权利要求1-7任一项所述的鉴别方法，其特征在于，步骤(4)所述的比色判定为缩二脲比色反应、茚三酮比色反应、考马斯亮蓝G250比色反应中的1种或至少2种的组合。
9.如权利要求1-8任一项所述的鉴别方法，其特征在于，所述缩二脲比色反应中，真蜂胶的显色为黄绿色，显色不是黄绿色判定为假蜂胶，显色与黄绿色深浅不一致的蜂胶判定为掺假蜂胶；优选地，所述茚三酮比色反应中，真蜂胶的显色为紫红色，显色不是紫红色判定为假蜂胶，显色与紫红色深浅不一致判定为掺假蜂胶；优选地，所述考马斯亮蓝G250比色反应中，真蜂胶的显色为墨绿色，显色不是墨绿色判定为假蜂胶，显色与墨绿色深浅不一致判定为掺假蜂胶。
全文摘要
本发明涉及一种真假蜂胶的鉴别方法，所述鉴别方法是通过鉴定生物酶蛋白的含量来进行的，具体步骤包括(1)配制蜂胶溶液；(2)配制显色液；(3)进行显色反应；(4)比色判定，所述鉴定方法是通过蛋白显色反应进行的。本方法是一种灵敏、简易、低成本、准确可信的真假蜂胶的鉴别方法，可以广泛推广。
文档编号G01N21/78GK102565048SQ20121000134
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月4日 优先权日2012年1月4日
发明者何丽琼, 刘俊熙, 李强, 李楠, 李育强, 沃丽娜, 黄冀东 申请人:北京知蜂堂蜂产品有限公司