专利名称：荧光图像获取装置、荧光图像获取方法和荧光图像获取程序的制作方法
技术领域：
总体上，本发明涉及荧光图像获取装置、荧光图像获取装置所采用的荧光图像获 取方法和实现荧光图像获取方法的荧光图像获取程序。例如，本发明可很好地应用于观察 荧光染色组织切片的领域。
背景技术：
牢固地支持在载玻板上的组织切片是典型的生物样本。如果需要的话，在保存到 某处之前将组织切片染色。通常，当组织切片保存时间变长时，组织切片变质和/或组织切 片褪色。通常，用显微镜观察用作生物样本的组织切片。然而，如果组织切片已经变质和/ 或组织切片已经褪色，则作为组织切片的可见度的由显微镜提供的可见度变差。另外，在一 些情况下，在制作样本的医院外面的实验室诊断这种生物样本。在这种情况下，通常用邮件将 生物样本从医院发送至实验室。也就是说，需要花费时间将生物样本从医院发送至实验室。为了解决上述问题，已经提出一种用于将生物样本保存为图像数据的设备。对于 这种设备的进一步信息，建议读者参考诸如日本专利公开第2003-222801号的文献。

发明内容
顺便提及，在获得荧光染色组织切片的荧光图像的操作中，在荧光染色组织切片 的厚度方向上将焦点以预先确定的间隔从一个位置移动到另一个位置。然后，在每个焦点 获得的荧光图像用于产生图像数据。这样，可获取荧光图像并且不会失去(drop)荧光标 记，该荧光标记将分子标示为获取图像的操作对象。然而，在此情况下，一个生物样本的荧 光图像的数量显著增加。结果，每个生物样本的处理工作量和每个生物样本的图像数据量 也不可避免地增加。如果移动焦点的位置之间的间隔在生物样本的厚度方向上增加，那么，另一方面， 能够减小一个生物样本的荧光图像的数量。结果，每个生物样本的处理工作量和每个生物 样本的图像数据量也能够减少。然而，随着移动焦点的位置之间的间隔在生物样本的厚度 方向上增加，如果在获取荧光图像的操作中使用具有小焦点深度的物镜，那么，失去将分子 标示为获取图像的操作对象的荧光标记是完全有可能的。结果，测量荧光标记的操作的精 度变差。为了解决上述问题，本发明的发明人已创新出一种在减小处理工作量和图像数据 量的同时能够将测量荧光标记的操作的精度维持在一定水平的荧光图像获取装置，创新出 一种荧光图像获取装置所采用的荧光图像获取方法，以及创新出一种实现荧光图像获取方
4法的荧光图像获取程序。为了解决上述问题，本发明的实施方式提供了一种荧光图像获取装置，其采用激励光源，用于将激励光照射至生物样本上的荧光标记；暗视野照明系统；物镜，用于放大生物样本的部位的图像；摄像装置，用于形成由物镜放大的部位的图像，以作为该部位的荧光图像；焦点移动控制部，被配置为在生物样本的厚度方向上移动物镜的焦点；以及摄像控制部，被配置为在生物样本的厚度方向上移动物镜的焦点的同时，将摄像 装置曝光，并从摄像装置获取由物镜放大的部位的图像，以作为部位的荧光图像。另外，本发明的实施方式还提供一种荧光图像获取方法，其包括光照射步骤，对其上附有荧光标记的生物样本执行暗视野照明；焦点移动步骤，在其上附有荧光标记的生物样本的厚度方向上移动物镜的焦点；曝光步骤，在焦点移动步骤中在生物样本的厚度方向上移动物镜的焦点的同时， 将摄像装置曝光，该摄像装置上产生有由物镜放大以作为生物样本的部位的荧光图像的图 像；以及图像获取步骤，以在焦点移动步骤中物镜的焦点进行的移动的终点为契机(触发 点，trigger)，从摄像装置获取由物镜放大以作为生物样本的部位的荧光图像的图像。另外，本发明的实施方式还提供一种由计算机执行的以执行处理的荧光图像获取 程序，其包括光照射处理，对其上附有荧光标记的生物样本执行暗视野照明；焦点移动处理，在其上附有荧光标记的生物样本的厚度方向上移动物镜的焦点；曝光处理，在焦点移动处理中在生物样本的厚度方向上移动物镜的焦点的同时， 将摄像装置曝光，该摄像装置上产生有由物镜放大以作为生物样本的部位的荧光图像的图 像；以及图像获取处理，以物镜的焦点进行的在生物样本的厚度方向上的移动的终点为契 机，从摄像装置获取由物镜放大以作为生物样本的部位的荧光图像的图像。如上所述，根据本发明的实施方式，将在厚度方向上移动物镜焦点的期间作为曝 光期间，并且，在曝光期间结束时获取荧光图像。因此，与将物镜的焦点在生物样本的厚度 方向上以预先确定的间隔从一个位置移动到另一个位置的配置相比，获取荧光图像的次数 少。结果，可以减少每个生物样本的处理工作量和每个生物样本的图像数据量。另外，由于将在生物样本的厚度方向上移动物镜焦点的期间作为曝光期间，所以， 即使荧光标记存在于配置在生物样本的厚度方向上的任一个位置，也可将荧光标记察觉为 等同的光点。因此，不考虑所使用的物镜的焦点的深度，可以防止失去荧光标记。这样，可以实现能够在减小图像数据量的同时将测量荧光标记的操作的精度维持 在一定水平的荧光图像获取装置、实现荧光图像获取装置所采用的荧光图像获取方法、并 实现执行荧光图像获取方法的荧光图像获取程序。


图1是概略地示出了根据本发明的实施方式的生物样本图像获取装置的构造的示图；图2A和图2B是多个示出了荧光图像的示图；图3是示出了数据处理部的构造的框图；图4是示出了作为在获取生物样本的图像的操作中的主要构造的CPU的功能构造 的框图；图5是在对生物样本的每个区域获取图像的处理的描述中所参考的概略的示意 图；图6示出了表示对基因进行计数的处理过程的流程图；图7A至图7C是概略地示出了在生物样本图像获取装置中使用的物镜的焦点在生 物样本的厚度方向上的移动和基于样本上的荧光标记的光点之间的关系的多个示图；图8A至图8C是概略地示出了对于荧光标记的部位在厚度方向上彼此重叠的情 况，物镜的焦点在生物样本的厚度方向上的移动和各个基于样本上的荧光标记的光点之间 的关系的多个示图；图9A和图9B是多个示出了样本荧光图像的示图，其中，各个用作光照射对象的标 记的数量与指定数量不同。
具体实施例方式在按以下顺序排列的章节中说明本发明的优选实施方式1 实施方式1-1 生物样本图像获取装置的构造1-2:数据处理部的构造1-3 样本图像获取处理的具体过程1-4 效果及其他2 其他实施方式1 实施方式1-1 生物样本图像获取装置的构造图1是概略地示出了根据本发明的实施方式的生物样本图像获取装置1的构造的 示图。如图所示，将生物样本图像获取装置1构造为采用显微镜10、数据处理部20和摄像 装置30。显微镜10使用可移动台11、物镜12、照明系统13和激励光源14。显微镜10中使用的可移动台11具有生物样本SPL可置于其上的表面。另外，可 移动台11可在平行于该表面的方向上和垂直于该表面的方向上移动。也就是说，可移动台 11可在平行于x-y表面的方向上和平行于Z轴方向的方向上移动。通过采用预先确定的样本固定方法将组织切片或染色细胞坚固地支持在设置于 可移动台11的表面上的载玻板SG上，来提供生物样本SPL。典型地，由结合组织(例如， 一滴血)、上皮组织或者结合组织和上皮组织这两者来形成组织切片。如果需要，对组织切 片或染色细胞施加染色染料。染色染料决不限制于普通的染色染料(其以HE(苏木精-曙 红，Hematoxylin Eosin)染色染料、吉姆萨(giemsa)染色染料和巴氏染液(Papanicolaou) 染色染料为代表)，而是，染色染料也可以是通过采用FISH (荧光原位杂化)技术或酶抗体 技术来制备的荧光染色染料。
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在显微镜10中，在可移动台11的特定侧设置物镜12。另一方面，在与显微镜10 的特定侧相反的一侧设置照明系统13。照明系统13能够将光照射从亮视野照明处理切换 为暗视野照明处理，反之亦然。在亮视野窥镜模式中，在亮视野照明处理中从照明系统13发出的光通过设置在 可移动台11上的孔传播，并到达生物样本SPL，该生物样本SPL设置在可移动台11的特定 侧的表面上。物镜12包括第一物镜12A和第二物镜12B。由照明系统13照射的光的反射和散 射产生生物样本SPL的部位的图像。在显微镜10中采用的物镜12中，第一物镜12A和第 二物镜12B以预定的放大倍率放大生物样本SPL的部位的图像。将由第一物镜12A和第二 物镜12B放大的图像投射在摄像装置30的成像表面上。另一方面，在暗视野窥镜模式中，在暗视野照明处理中从照明系统13发出的光通 过设置在可移动台11上的孔传播，并到达生物样本SPL，如上所述，该生物样本SPL设置在 可移动台11的特定侧的表面上。然而，在暗视野窥镜模式中到达生物样本SPL的光是取代 生物样本SPL的背景光的照明光。另外，在暗视野窥镜模式中，在显微镜10中采用的激励光源14将激励光照射至用 于标示生物样本SPL的荧光染色染料的荧光标记。在以下描述中，简单地将由激励光源14 照射至荧光标记的激励光称为激励光。物镜12还包括设置在第一物镜12A和第二物镜12B 之间的分色镜(dichroic mirror) 12C。在显微镜10中，激励光在由分色镜12C反射之后传 播至第一物镜12A。第一物镜12A将激励光聚焦在设置于可移动台11的表面上的生物样本 SPL 上。由于施加至生物样本SPL的荧光颜色(其是由荧光标记表现的颜色)，所以附加至 生物样本SPL的目标部位的荧光标记由于聚焦于其上的激励光而发光。在以下描述中，由 生物样本SPL的目标部位发出的光被称为标记光。由生物样本SPL的目标部位发出的标记 光到达第一物镜12A。在显微镜10中，以由第一物镜12A和第二物镜12B确定的预定放大倍率放大从标 记光获得的图像，作为生物样本SPL的目标部位的图像。然后，显微镜10将由第一物镜12A 和第二物镜12B放大的部位的图像投射在摄像装置30的成像表面上。图2A和图2B是多个示出了生物样本SPL的荧光图像的示图。更具体地，图2A 是示出了从正常人取出的乳腺组织的典型的荧光图像的示图，而图2B是示出了患有乳腺 癌的患者的乳腺组织的另一典型的荧光图像的示图。通过根据FISH技术对乳腺组织中的 HER2(人类上皮生长因子受体型2)基因和探针(由Abbott制造的HER2DNA探针工具的 Path Vysion)执行杂化处理来获得在图2A和图2B的各个示图中示出的荧光图像。如图2A和图2B的示图所示，与正常的乳腺组织相比，恶性的乳腺组织具有许多均 为由箭头指向的标识物质的荧光标记。同样从图2A和图2B的示图中显而易见的，HER2基 因在恶性肿瘤(例如，乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、膀胱癌、小细胞肺癌或前列腺癌)中 大量繁殖地生长。因此，可将HER2基因可视地察觉为表示恶性肿瘤的发展程度的荧光标 记。在亮视野窥镜模式中，驱动照明系统13以执行亮视野照明处理，以在摄像装置30 的成像表面上形成处于亮视野状态的生物样本SPL的部位的图像。然后，数据处理部20从摄像装置30获取图像，并将图像存储为具有预先确定的格式的数据。在以下描述中，具有 预先确定的格式的所存储的数据被称为样本数据。另一方面，在暗视野窥镜模式中，驱动照明系统13以执行暗视野照明处理，并驱 动激励光源14以将激励光照射至生物样本SPL。然后，在摄像装置30的成像表面上形成处 于暗视野状态的生物样本SPL的图像。最后，数据处理部20从摄像装置30获取图像，并将 该图像存储为样本数据。这样，生物样本图像获取装置1能够将放在载玻板SG上的生物样本SPL的亮视野 和暗视野图像保存为样本数据。因此，与在其中保存载玻板SG本身的构造相比，生物样本 图像获取装置1能够将关于生物样本SPL的信息保持较长时间，而不会损害载玻板SG上的 生物样本SPL的固定状态、生物样本SPL的染色染料状态以及其他状态。1-2 数据处理部的构造图3是示出了在生物样本图像获取装置1中使用的上述数据处理部20的构造的 框图。通过在下面参照此图来说明数据处理部20。如此图所示，数据处理部20使用CPU(中 央处理单元)21、R0M(只读存储器)22、RAM(随机存取存储器)23、操作输入部24、接口 25、 显示部26、存储部27和总线28。用作执行各种控制的部件的CPU 21与各种硬件相连接。更具体地，CPU 21通过总线28与ROM 22,RAM 23、操作输入部24、接口 25、显示部 26和存储部27连接。RAM 23是CPU 21的工作存储器。操作输入部24是由用户执行的向 数据处理部20输入各种命令的部件。CPU 21是用于执行存储在ROM 22中的程序以执行各种类型的处理的部件。接口 25是用作与外部部件(例如，在图1的示图中示出的可移动台11、照明系统13、激励光源 14和摄像装置30)的接口的部件。显示部26通常是液晶显示部、EL(电致发光)显示部或等离子体显示部。存储部 27通常是磁盘、半导体存储器或光盘。磁盘的代表性实例是HD (硬盘)。存储部27也可以 是便携存储器，例如，USB (通用串行总线)存储器或CF(紧凑式闪存)存储器。CPU 21根据从操作输入部24接收的命令在存储于ROM 22中的程序中选择特定程 序，并将该特定程序装入RAM 23。然后，CPU21执行装载在RAM 23中的特定程序，以适当地 控制显示部26和存储部27。另外，CPU 21执行装载在RAM 23中的特定程序，以通过接口 25适当地控制可移 动台11、照明系统13、激励光源14和摄像装置30。1-3 样本图像获取处理的具体过程当从操作输入部24接收图像获取命令时，CPU 21将与来自ROM 22的命令相关的 程序装载至RAM 23。图像获取命令是请求在生物样本图像获取装置1中采用的数据处理 部20从摄像装置30获取已施加荧光染色处理的生物样本SPL的图像的命令。在以下描述 中，施加荧光染色处理的生物样本SPL的图像被称为样本荧光图像。然后，CPU 21执行与图像获取命令相关的程序，以如图4的框图所示，起到光源控 制部41、台移动控制部42、荧光图像获取部43、基因计数部44和数据记录部45的作用。图 4是示出了作为在获取生物样本SPL的样本荧光图像的操作中的主要构造的CPU 21的功能 构造的框图。光源控制部41是用于驱动照明系统13以执行暗视野照明处理并驱动激励光源14以照射激励光的功能部。台移动控制部42是用于连续移动可移动台11以将生物样本SPL的样本部位定位 在图像获取范围AR中的一个位置处的功能部。样本部位是要获取其样本荧光图像的部位。 图5是在对于生物样本SPL的每个区域获取图像的处理的描述中所参照的概略示意图。如 图5的示意图所示，台移动控制部42将生物样本SPL分配给图像获取范围AR。在图5中， 分配给图像获取范围AR的生物样本SPL的区域不彼此重叠。然而，应注意，分配给图像获 取范围AR的生物样本SPL的区域也可能彼此重叠。在每个将作为图像获取处理的对象的样本部位定位在图像获取范围AR中的位置 的操作中，台移动控制部42在Z轴方向上移动可移动台11，以在生物样本SPL的厚度方向 上对于样本部位移动第一物镜12A的焦点。Z轴方向是第一物镜12A的光轴方向。在每个由台移动控制部42执行的将作为图像获取处理的对象的样本部位定位在 图像获取范围AR中的位置的操作中，荧光图像获取部43在曝光期间使摄像装置30曝光， 该曝光期间在可移动台11在Z轴方向(即，第一物镜12A的光轴方向)上的移动开始的时 间点开始，并在可移动台11在Z轴方向上的移动结束的时间点终止。在可移动台11在Z轴方向(即，第一物镜12A的光轴方向)上的移动结束的时间 点，荧光图像获取部43获取样本部位的荧光图像。所获取的样本部位的荧光图像是在曝光 期间产生的图像，该曝光期间在可移动台11在Z轴方向上的移动开始的时间点开始，并在 可移动台11在Z轴方向上的移动结束的时间点终止。荧光图像获取部43是用于通过采用预先确定的连接算法连接分配给图像获取范 围AR的所获取的样本部位的荧光图像来产生样本荧光图像的功能部。样本荧光图像是整 个生物样本SPL的荧光图像。以由第一物镜12A和第二物镜12B确定的放大倍率放大样本 荧光图像。在荧光图像获取部43产生样本荧光图像之后，基于设置为用作计数操作所需的 信息的信息，基因计数部44对荧光标记进行计数，每个荧光标记对每个细胞核标识用作目 标的基因。在以下描述中，用作目标的基因被称为目标基因，而标识目标基因的荧光标记被 称为目标标记。设置为用作计数操作的信息的信息包括，由目标标记表现的颜色和由标识细胞核 的荧光标记表现的颜色。在以下描述中，标识细胞核的荧光标记被称为细胞核标记，由目 标标记表现的颜色被称为目标标记颜色，而由细胞核标记表现的颜色被称为细胞核标记颜 色。如果使用标识用光照射的基因的荧光标记，那么设定存在于正常细胞中的这种基 因的数量。在此情况下，还设置由标记基因的荧光标记表现的颜色。在以下描述中，标识用 光照射的基因的荧光标记被称为照射对象标记，并且，由照射对象标记表现的颜色被称为 照射对象标记颜色。被设置为用作计数操作的信息的信息由在施加荧光染色染料的处理中使用的探 针的制造商和使用条件(例如，荧光标记的类型)唯一地确定。更具体地，在由Abbott制 造的HER2 DNA探针工具用作产生图2A和图2B的示图所示的荧光图像的探针工具的情况 下，将HER2基因的目标标记颜色设置为红色，而将其细胞核标记颜色设置为蓝色。在此情 况下，将位于染色本体上的HER2基因附近位置的基因用作照射对象基因，并且，将此照射
9对象基因的照射对象标记颜色设置为黄绿色。此外，将这种基因的数量设置为2。另外，作为设置用于计数操作的信息的方法，可以采用请求用户输入使用条件的 技术。然后，通过此使用条件和将照射对象标记颜色与照射对象基因的数量相关联的数据 库，发现标记颜色和照射对象基因的数量。顺便提及，通过采用如下所述的使用条件输入技术来输入使用条件。例如，用户可 通过典型地操作键盘来输入使用条件，以指定代表探针的制造商的数字或代表荧光标记的 类型的数字。作为一种可选技术，探针的制造商或荧光标记的类型可下拉而显示在屏幕上， 然后，用户操作键盘以从屏幕上出现的显示内容选择期望制造商的探针或期望类型的荧光 标记。另外，可从网络(例如，因特网)获得前面提到的数据库，并将其存储在存储部27中。 然后，如果需要，经常更新数据库。图6示出了表示对基因进行计数的处理过程的流程图。通过参照图6所示的流程 图，来说明由基因计数部44执行的对基因进行计数的处理过程。如果荧光图像获取部43具有所产生的样本荧光图像，那么基因计数部44通过执 行表示该过程的流程图的第一步骤SPl来启动对基因进行计数的处理过程。在第一步骤 SP1，基因计数部44检测细胞核，然后将对基因进行计数的处理过程继续至第二步骤SP2。 所检测的细胞核是这样的像素的区域，每个像素都具有被设置为由细胞核表现的颜色的细 胞核标记颜色，并且，每个像素的亮度都不小于预先确定的阈值。在第二步骤SP2，对于在第一步骤SPl检测的各个细胞核，基因计数部44对各个基 于存在于细胞核中的一个目标标记的光点进行计数。然后，处理过程的流程前进至第三步 马聚SP3 ο在暗视野窥镜模式中，通常将尺寸小于大约几十纳米的结构作为上述光点。因此， 目标标记或照射对象标记在图像获取操作中用作光点。在此实施方式中，摄像装置30在曝 光期间曝光，该曝光期间在可移动台11在Z轴方向(即，第一物镜12A的光轴方向)上的 移动开始的时间点开始，并在可移动台11在Z轴方向上的移动结束的时间点终止。因此， 摄像装置30的曝光导致散焦光点，其在下文中被称为扩散光点。下面将描述细节。图7A至图7C是概略地示出了第一物镜12A的焦点在生物样本 SPL的厚度方向上的移动与基于样本SPL上的荧光标记FM的光点之间的关系的多个示图。 更具体地，图7A是示出了第一物镜12A的焦点平面FP和荧光标记FM的匹配的变化状态的 示图。更具体地，图7A的示图中示出的匹配状态从第一物镜12A的焦点平面FP与荧光标 记FM不匹配的状态变化至焦点平面FP与荧光标记FM匹配的状态，最后，变化至焦点平面 FP与荧光标记FM再次不匹配的状态。另一方面，图7B是示出了扩散光点ESP的示图，而图 7C是示出了在图像获取操作中获取的光点SP的示图，该图像获取操作在第一物镜12A的焦 点平面FP与荧光标记FM匹配的状态下进行。上述改变状态的结果是，扩散光点ESP的图 像比光点SP的图像大，如从图7B和图7C的示图中显而易见。不过，扩散光点ESP本身的形状不从圆形发生变化。然而，在将两个以上荧光标记 FM置于彼此相邻的位置上的情况下，或在将两个以上荧光标记FM的部分彼此重叠(在厚度 方向上观看生物样本SPL)的情况下，点SP的形状不再是圆形。为了与图7A至图7C的示图进行比较的目的，图8A至图8C是概略地示出了对于荧 光标记FM的部分在厚度方向上彼此重叠的情况，第一物镜12A的焦点在生物样本SPL的厚度方向上的移动和每个基于样本SPL上的荧光标记FM的光点之间的关系的多个示图。更 具体地，图8A是示出了第一物镜12A的焦点平面FP和荧光标记FM的匹配的变化状态的示 图，而图8B是示出了扩散光点ESP的示图。图8C是示出了在图像获取操作中获取的光点 SP的示图，该操作在第一物镜12A的焦点平面FP与荧光标记FM匹配的状态下进行。如从 图8A至图8C的示图中显而易见的，在将两个以上荧光标记FM置于彼此相邻的位置处的情 况下，或在将两个以上荧光标记FM的部分彼此重叠(在厚度方向上观看生物样本SPL)的 情况下，变得难以确定用作光点SP的基础的目标标记的数量。由于上述原因，执行第二步骤SP2的处理，以对各个基于目标标记的特定光点进 行计数。特定光点是表现所设定的目标标记颜色且满足要求光点SP的形状是圆形的条件 的光点。应注意，要求光点SP的形状是圆形的条件可能意味着这样一种情况将包括相邻 像素(各自具有不小于预先确定的阈值的亮度)的区域视为光点SP，并且，该区域的长轴和 短轴的比率不小于预先确定的阈值比率。在第三步骤SP3，基因计数部44从在第一步骤SPl检测的细胞核中选择特定的细 胞核，以将所选择的特定的细胞核归类为特殊种类的细胞核。将特定的细胞核定义为这样 一种细胞核，其中，具有基于目标标记的光点，其作为不满足要求光点SP的形状是圆形的 条件的光点。特定的细胞核是这样一种细胞核，对于其，对每个细胞核中光点(每个光点都 基于目标标记)的计数操作的精度低。在以下描述中，特定的细胞核的类型被称为低计数 精度细胞核类型。然后，处理过程的流程前进至第四步骤SP4。在第四步骤SP4，基因计数部44确定是否已经设置照射对象基因和照射对象标记 颜色的数量。如果基因计数部44确定已经设置了照射对象基因和照射对象标记颜色的数 量，那么处理过程的流程前进至第五步骤SP5。另一方面，如果基因计数部44确定未设置 照射对象基因和/或照射对象标记颜色的数量，那么处理过程的流程前进至第六步骤SP6。 如之前描述的，照射对象基因是用作光照射的对象的基因。在第五步骤SP5，对于在第一步骤SPl检测的每个细胞核，基因计数部44对细胞核 中的各个基于照射对象标记的光点进行计数。顺便提及，与第二步骤SP2非常相似，执行第五步骤SP5的处理以对各个基于照射 对象标记的特定的光点进行计数。特定的光点是这样一种光点其表现所设定的照射对象 标记颜色并满足要求光点SP的形状是圆形的条件。应注意，对于照射对象标记，要求光点 SP的形状是圆形的条件可以是与对于目标标记的条件相同的条件，或是与对于目标标记的 条件不同的条件。如前所述，照射对象标记是用作光照射的对象的标记。图9A和图9B是各自示出了样本荧光图像的多个示图，其中，各个用作光照射对象 的标记的数量与表示各个用作光照射对象的基因的数量的指定数量不同。更具体地，图9A 是示出了这样一个样本荧光图像的示图，其中，各个用作光照射对象的标记的数量大于各 个用作光照射对象的基因的数量，而图9B是示出了这样一个样本荧光图像的示图，其中， 各个用作光照射对象的标记的数量小于各个用作光照射对象的基因的数量。如图9A的示图所示，在各个用作光照射对象的标记的数量大于各个用作光照射 对象的基因的数量的细胞核的情况下，因为多个细胞核在生物样本SPL的厚度方向上彼此 重叠，所以各个用作光照射对象的标记的数量大于各个用作光照射对象的基因的数量是完 全可能的。由于多个细胞核在生物样本SPL的厚度方向上彼此重叠，所以各个基于细胞核中的目标标记的光点的数量不是通过正确地假设目标标记存在于一个细胞核中来执行的 计数操作的结果。如图9B的示图所示，另一方面，在各个用作光照射对象的标记的数量小于各个用 作光照射对象的基因的数量的细胞核的情况下，因为部分细胞核由于癌症发展的结果或由 于外科手术的结果而损坏，所以各个用作光照射对象的标记的数量小于各个用作光照射对 象的基因的数量是完全可能的。而且，在此情况下，各个基于细胞核中的目标标记的光点的 数量不是通过正确地假设目标标记存在于一个细胞核中来执行的计数操作的结果。应注意，图9A和图9B示出了用于HER2DNA探针工具的样本荧光图像，该工具由 Abbott制造，以用作产生图2A和图2B的示图所示的样本荧光图像的探针工具。也就是说， 在正常细胞核的情况下，如图9A的示图所示，在细胞核中各个用作光照射对象的基因的数 量是2。由于上述原因，在第五步骤SP5，基因计数部44从在第一步骤SPl检测的细胞核中 选择特定的细胞核，以将所选择的特定的细胞核归类为特殊种类的细胞核。特定的细胞核 是这样一种细胞核，其中，与图9A和图9B的示图所示的情况一样，各个用作光照射对象的 标记的数量与各个用作光照射对象的基因的数量不同。特定的细胞核是这样一种细胞核， 对于其，对每个细胞核中各个基于标记的光点的进行计数的操作的精度低。在以下描述中， 特定的细胞核的类型被称为低计数精度细胞核类型。然后，处理过程的流程前进至第六步 骤 SP6。在第六步骤SP6，基因计数部44从在第一步骤SPl检测的细胞核中排除低计数精 度细胞核，以产生剩余的细胞核。然后，基因计数部44计算目标标记数(各自为一个剩余 的细胞核而获得)的平均值作为每个细胞核的平均值。如果基因计数部44已经在第四步骤 SP4确定尚未设定照射对象基因的数量和/或照射对象标记颜色，那么，从在第一步骤SPl 检测的细胞核中排除的低计数精度细胞核是在第三步骤SP3确定的低计数精度细胞核。另一方面，如果基因计数部44在第四步骤SP4确定已经设定了照射对象基因的数 量和照射对象标记颜色，那么，从在第一步骤SPl检测的细胞核中排除的低计数精度细胞 核是在第三步骤SP3确定的低计数精度细胞核、在第五步骤SP5确定的低计数精度细胞核， 或者在第三步骤SP3确定的低计数精度细胞核和在第五步骤SP5确定的低计数精度细胞核 这两者。在此情况下，基因计数部44计算目标标记数(各自为一个剩余的细胞核而获得) 的平均值作为每个细胞核的平均值；计算照射对象标记数(各自为一个剩余的细胞核而获 得)的平均值作为每个细胞核的平均值；并计算各自通过将任何一个特定的剩余的细胞核 的各个基于目标标记的光点的数量除以该特定的剩余的细胞核的各个基于照射对象标记 的光点的数量而获得的商的平均值。然后，处理过程的流程前进至第七步骤SP7。在第七步骤SP7,基因计数部44检测每个被归类为低计数精度细胞核的细胞核。 另外，基因计数部44还将低计数精度细胞核处理为实际可见并验证的部位。此外，基因计 数部44还确定低计数精度细胞核在生物样本SPL上的位置。最后，基因计数部44在第七 步骤SP7执行的过程结束时终止对基因进行计数的处理过程。如果荧光图像获取部43已经产生样本荧光图像，那么数据记录部45产生样本数 据并将数据记录在存储部27中。样本数据包括由荧光图像获取部43产生的整个样本荧光 图像的图像信息或样本荧光图像的一部分的图像信息。然而，由荧光图像获取部43产生的
12样本荧光图像的部分可用来再现原始的样本荧光图像。另外，数据记录部45还产生附加数据，并通过将附加数据与上述样本数据相关联 而将附加数据记录在存储部27中。附加数据是表示在第六步骤SP6基因计数部44计算的 平均值的平均值信息、表示在第七步骤SP7基因计数部44发现的位置的位置信息以及识别 样本荧光图像的识别信息的数据。识别信息是典型地包括以下内容的信息提供生物样本SPL的人的姓名、此人的 性别、此人的年龄以及得到该生物样本SPL的图像的日期。应注意，数据记录部45通知生 物样本图像获取装置1的操作者由操作者输入识别信息的预定时刻。如果当数据记录部 45产生样本数据时，未获得识别信息，那么数据记录部45发出警告，以催促操作员马上输 入识别信息。1-4 效果及其他在上述构造中，每当生物样本图像获取装置1将用作图像获取处理的对象的样本 部位移动至图像获取范围AR时，生物样本图像获取装置1也在Z轴方向(即，第一物镜12A 的光轴方向)上移动可移动台11，以在生物样本SPL的厚度方向上对于样本部位移动第一 物镜12A的焦点。在每个由生物样本图像获取装置1执行的将用作图像获取处理的对象的样本部 位定位在图像获取范围AR中的位置的操作中，生物样本图像获取装置1使摄像装置30在 曝光期间曝光，该曝光期间在可移动台11在Z轴方向(即，第一物镜12A的光轴方向)上 的移动开始的时间点开始，并在可移动台11在Z轴方向上的移动结束的时间点终止。在可 移动台11在Z轴方向(即，第一物镜12A的光轴方向)上的移动结束的时间点，生物样本 图像获取装置1将样本部位的图像从摄像装置30转移至数据处理部20。在生物样本图像获取装置1中，将可移动台11在Z轴方向(即，第一物镜12A的 光轴方向)上移动的期间作为荧光图像的曝光期间。因此，与将物镜的焦点在生物样本的 厚度方向上以预先确定的间隔从一个位置移动至另一个位置以在各个位置获取荧光图像 的构造相比，将样本部位的荧光图像从摄像装置30转移至数据处理部20的次数少。结果， 可以减少每个生物样本的处理工作量和每个生物样本的图像数据量。另外，由于将物镜的焦点在厚度方向上移动的期间作为曝光期间，所以，即使荧光 标记(即，目标标记)存在于任一个配置在生物样本的厚度方向上的位置，也可认为荧光标 记是等同的光点。因此，在生物样本图像获取装置1中，不考虑使用的物镜的焦点的深度，可防止失 去荧光标记。结果，可以使生物样本图像获取装置1能够将测量荧光标记的操作的精度维 持在一定水平。顺便提及，如果将荧光图像获取为可移动台11在Z轴方向(即，第一物镜12A的 光轴方向)上移动的曝光期间的图像，那么，基于荧光标记的光点变成扩散光点，如图7A的 示图所示。在此情况下，计数操作本身没有问题。然而，如从图8A至图8C的示图显而易见 的，在将两个以上荧光标记FM置于彼此相邻的位置处的情况下，或在两个以上荧光标记 FM的部分彼此重叠(在厚度方向上观看生物样本SPL)的情况下，变得难以确定各个用作光 点SP的基础的目标标记的数量。然而，生物样本图像获取装置1对光点(各个满足要求光点SP的形状是圆形的条
13件以用作基于荧光标记的光点)进行计数，排除任何包括不满足要求光点SP的形状是圆形 的条件的光点的细胞核，并且，所述生物样本图像获取装置1计算各自为一个细胞核而获 得的光点数的平均值作为每个细胞核的平均值。因此，即使将荧光图像获取为可移动台11在Z轴方向(即，第一物镜12A的光轴 方向)上移动的曝光期间的图像，生物样本图像获取装置1也能够准确地计算各自为一个 细胞核而获得的光点数的平均值作为每个细胞核的平均值。另外，如果利用各个用于标识照射对象基因的照射对象标记，那么生物样本图像 获取装置1能够设定照射对象基因的数量和照射对象标记颜色。如之前描述，照射对象基 因是用光照射的基因，照射对象标记是用于标识照射对象基因的荧光标记，并且，照射对象 标记颜色是照射对象标记表现的颜色。在此情况下，生物样本图像获取装置1不仅排除包括不满足要求光点SP的形状是 圆形的条件的光点的细胞核，而且排除具有与照射对象基因的设定数量不同的照射对象标 记数的细胞核。然后，生物样本图像获取装置1计算各自为一个细胞核而获得的光点数的 平均值作为每个细胞核的平均值。如之前通过参照图9A和图9B的示图所说明的，在各个用作光照射对象的标记的 数量大于或小于各个用作光照射对象的基因的数量的细胞核的情况下，在假设目标标记存 在于一个细胞核中的情况下，对细胞核中各个基于一个目标标记的光点进行计数是完全 可能的。由于上述原因，生物样本图像获取装置1不仅排除包括不满足要求光点SP的形状 是圆形的条件的光点的细胞核，而且排除具有与照射对象基因的设定数量不同的照射对象 标记计数的细胞核。因此，由于精度更高，所以生物样本图像获取装置1能够准确地计算各 自为一个细胞核而获得的光点数的平均值作为每个细胞核的平均值。另外，生物样本图像获取装置1还产生表示在计算各自为一个细胞核而获得的光 点数的平均值作为每个细胞核的平均值的处理中已被排除的每个细胞核的位置的位置信 息。然后，生物样本图像获取装置1通过将位置信息与样本数据相关联来在存储部27中记 录位置信息。因此，生物样本图像获取装置1能够立即在显示部26上显示在计算各自为一个细 胞核而获得的光点数的平均值作为每个细胞核的平均值的处理中所排除的每个细胞核。从 以下两种观点来看，生物样本图像获取装置1的此能力是有用的。两种观点中的一种是生 物样本图像获取装置1的用户友好性，而另一种观点是测量荧光标记的操作精度的更高的
可靠性。根据上述构造，在曝光期间结束时，将荧光图像获取为曝光期间中的图像，在该曝 光期间可移动台11在Z轴方向(即，第一物镜12A的光轴方向)上移动。结果，可以实现 能够减小每个生物样本的处理工作量和每个生物样本的图像数据量的同时将荧光标记的 测量精度维持在一定水平的生物样本图像获取装置1。2:其他实施方式如上所述，生物样本图像获取装置1使摄像装置30在曝光期间曝光，该曝光期间 在可移动台11在ζ轴方向(即，第一物镜12A的光轴方向)上的移动开始的时间点开始， 并在可移动台11在Z轴方向上的移动结束的时间点终止。在这种构造中，由于摄像装置30
14的特性，在一些情况下可能在特定的点处产生噪声。由于这些固定的噪声变成具有基本类 似圆形的形状的光点，所以无法将噪声与基于目标标记的光点彼此区分开。结果，在一些情 况下，由基因计数部44执行的计数操作的精度变差。为了解决上述问题，代替仅对由荧光图像获取部43产生的样本荧光图像上的各 个基于目标标记的光点进行计数的构造，可以提供用于对无噪声的样本荧光图像上的各个 基于目标标记的光点进行计数的构造，所述无噪声的样本荧光图像通过从由荧光图像获取 部43产生的样本荧光图像消除固定噪声而获得。更具体地，在荧光图像获取部43和基因计数部44之间设置用于从由荧光图像获 取部43产生的样本荧光图像消除固定噪声的噪声消除部。当荧光图像获取部43产生了样 本荧光图像或用作光照射对象的样本部位的荧光图像时，噪声消除部执行匹配过程，以将 样本荧光图像或用作光照射对象的样本部位的荧光图像与由摄像装置30产生的固定噪声 的图案化图像进行比较。在匹配过程的结果的基础上，噪声消除部识别固定噪声的位置，并 从样本荧光图像或用作光照射对象的样本部位的荧光图像消除固定噪声。图案化图像是在暗视野窥镜模式中，在曝光期间不将生物样本SPL放在可移动台 11上而曝光的图像。在暗视野窥镜模式中不将生物样本SPL放在可移动台11上而将图案 化图像曝光的曝光期间与之前描述的将生物样本SPL曝光的曝光期间是相同的期间。应注意，通过采用下面描述的两种典型技术可获取图案化图像。根据一种技术，在 启动每个所执行以用来获得生物样本SPL的样本荧光图像的操作之前，在校准处理中获取 图案化图像。根据另一种技术，从连接至网络的外部源或从具有预先确定的定时的存储介 质获取图案化图像，然后，将图像存储在存储部27中。通过在如上所述的构造中使用噪声消除部，可防止由基因计数部44执行的计数 操作的精度变差，该计数操作对各个基于目标标记的光点进行计数，以作为通过采用之前 描述的曝光期间而产生的点。如前面说明的，将曝光期间定义为在可移动台11在Z轴方向 (即，第一物镜12A的光轴方向)上的移动开始的时间点开始，并在可移动台11在Z轴方向 上的移动结束的时间点终止的移动期间。另外，在上述实施方式的情况下，基因计数部44从所有检测的细胞核中排除低计 数精度细胞核，以产生剩余的细胞核。然后，基因计数部44计算各自为一个剩余的细胞核 而获得的目标标记数的平均值作为每个细胞核的平均值。在此情况下，如果基因计数部44 已在之前确定尚未设置照射对象基因的数量和/或照射对象标记颜色，那么，从所有检测 的细胞核中排除的低计数精度细胞核是各个被归类为其中存在基于目标标记的不满足要 求光点SP的形状是圆形的条件的光点的细胞核的低计数精度细胞核。因此，在此情况下， 基因计数部44不从所有检测的细胞核中选择特定的细胞核，以将所选择的特定的细胞核 归类为特殊类别的细胞核。特定的细胞核是其中各个用作光照射对象的标记的数量与各个 用作光照射对象的基因的数量不同的细胞核，与图9A和图9B的示图示出的情况一样。结 果，如之前参照图9A和图9B的示图所说明的，难以确定细胞核中各个基于目标标记的光点 的数量是否是通过正确地假设目标标记存在于一个细胞核中来执行计数操作的结果。因此，为了特别实现噪声消除部的功能，典型地，必须在第一步骤SPl和第二步骤 SP2之间提供噪声消除步骤。执行噪声消除步骤，以将可能异常的细胞核归类为低计数精度 细胞核，并从所有检测的细胞核中排除低计数精度细胞核以产生剩余的细胞核。可能异常的细胞核为异常的细胞核完全在可能性的范围内。因此，即使基因计数部44之前已经确定 尚未设置照射对象基因的数量和/或照射对象标记颜色，生物样本图像获取装置1也能够 准确地计算各自为一个剩余的细胞核而获得的目标标记数的平均值作为每个细胞核的平 均值。更具体地，将既不满足要求细胞核的周边边缘是平滑的条件也不满足要求细胞核 的形状在从圆形到椭圆形的形状范围中的条件的细胞核确定为可能异常的细胞核，因此， 将其归类为属于低计数精度细胞核的类别。要求细胞核的周边边缘是平滑的条件通常会意味着这样一种情况难以检测包括 以下相邻像素的区域的边缘处的角上的细胞核。各个相邻像素与被设定为由细胞核表现的 颜色的细胞核标记颜色相对应，并具有不小于预先确定的阈值的亮度。另一方面，要求细胞核的形状在从圆形到椭圆形的形状范围中的条件通常会意味 着这样一种情况下述区域的长轴与该区域的短轴的比率不小于预先确定的阈值比例。该 区域包括各自与被设定为由细胞核表现的颜色的细胞核标记颜色相对应的相邻像素，并各 自具有不小于预先确定的阈值的亮度。另外，根据上述实施方式，生物样本图像获取装置1计算各自为一个细胞核而获 得的目标标记数的平均值作为每个细胞核的平均值。然而，可用下述另一实施方式代替该 实施方式，或提供其他实施方式作为附加的实施方式。根据另一实施方式，生物样本图像获 取装置对各个细胞核计算目标标记的最大或最小值，或对样本荧光图像中的目标标记进行 计数。此外，根据上述实施方式，各个基因用作生物样本SPL上的目标。然而，生物样本 SPL上的目标并非与此实施方式的情况一样而必须是基因。例如，可以提供另一实施方式， 其中，在各种分子如细胞膜管道的蛋白质分子、血糖蛋白质分子或糖链分子中选择生物样 本SPL上的目标。另外，根据上述实施方式，对样本荧光图像上的目标标记进行计数。然而，可以提 供另一实施方式，其中，将作为对样本荧光图像上的目标标记进行计数的结果而获得的目 标标记数用作癌症发展程度的指标。更具体地，在此另一实施方式中，在基因计数部44和 数据记录部45之间设置癌症判定部，以用作判定在癌症患者身上执行的诊断的结果是阳 性还是阴性的部件。癌症判定部将之前对细胞核计算的平均值与用作判定在癌症患者身上执行的诊 断的结果是阳性的还是阴性的标准的阈值进行比较。之前对细胞核计算的平均值是各自为 一个细胞核而获得的目标标记数的平均值，或是各自通过将任一个特定的细胞核的目标标 记的数量除以该特定的细胞核的照射对象标记的数量而获得的商的平均值。这样，癌症判 定部能够根据生物样本SPL判定在癌症患者身上执行的诊断的结果是阳性还是阴性的。注 意，如果在癌症患者身上执行的诊断的结果是阳性的，那么，基于各自为一个细胞核而获得 的目标标记数的平均值，或各自通过将任一个特定的细胞核的目标标记的数量除以该特定 的细胞核的照射对象标记的数量而获得的商的平均值，可判定癌症疾病的发展程度。此外，根据上述实施方式，在对于每个细胞核、生物样本图像获取装置1对各个基 于细胞核中的目标标记的光点进行计数之后，生物样本图像获取装置1将一些细胞核归 类为属于低计数精度细胞核(每个都具有目标标记，基于目标标记的光点的数量可能无法高精度地来计数)的类别的细胞核。然而，代替此实施方式，可提供另一实施方式，其中，在 对于每个细胞核、生物样本图像获取装置1对各个基于细胞核中的目标标记的光点进行计 数之前，生物样本图像获取装置1将一些细胞核归类为属于低计数精度细胞核的类别的细 胞核。另外，根据上述实施方式，在Z轴方向(即，固定在某一位置的第一物镜12A的光 轴方向)上移动可移动台11。然而，代替此实施方式，可提供另一实施方式，其中，生物样本 图像获取装置1将可移动台11牢固地支持在某一位置，并在ζ轴方向(即，第一物镜12A 的光轴方向)上移动第一物镜12A。本发明的实施方式可应用于生物工业，包括基因实验、药物制备和对患者的病情 发展的观察。另外，本领域技术人员应该理解，根据设计需求和其他因素，可以有各种修改、组 合、子组合和变形，只要其在所附权利要求或其等同物的范围之内。
权利要求
一种荧光图像获取装置，包括激励光源，用于将激励光照射至生物样本上的荧光标记；暗视野照明系统；物镜，用于放大所述生物样本的部位的图像；摄像装置，用于形成由所述物镜放大的所述部位的图像，以作为所述部位的荧光图像；焦点移动控制装置，用于在所述生物样本的厚度方向上移动所述物镜的焦点；以及摄像控制装置，用于在所述生物样本的厚度方向上移动所述物镜的焦点的同时，将所述摄像装置曝光，并从所述摄像装置获取由所述物镜放大的所述部位的图像，以作为所述部位的所述荧光图像。
2.根据权利要求1所述的荧光图像获取装置，所述荧光图像获取装置还具有噪声消除 装置，所述噪声消除装置使用由于对所述图像拾取装置的曝光而在所述荧光图像上的特定 点产生的噪声的图案化图像，从所述荧光图像上消除所述噪声。
3.根据权利要求1所述的荧光图像获取装置，所述荧光图像获取装置还具有计算装 置，其用于对于所述荧光图像上的每个细胞核，对满足圆形条件的光点进行计数； 排除包含不满足所述圆形条件的光点的各个细胞核，以产生剩余的细胞核；以及 对于每个所述剩余的细胞核，计算与光点相关的值。
4.根据权利要求1所述的荧光图像获取装置，所述荧光图像获取装置还具有计算装 置，其用于对于所述荧光图像上的每个细胞核，计算均满足圆形条件以用作基于所述荧光标记的 光点的第一光点的数量，所述荧光标记用于标记所述生物样本的目标分子；对于所述荧光图像上的每个细胞核，计算均满足所述圆形条件以用作基于所述荧光标 记的光点的第二光点的数量，所述荧光标记用于标记所述生物样本的照射对象分子；排除包含均不满足所述圆形条件的所述第一光点和所述第二光点的细胞核，并且排除 具有与设定数量不同的第二光点数的细胞核，以产生剩余的细胞核；以及计算任一个特定的剩余的细胞核的所述第一光点的数量除以该特定的剩余的细胞核 的所述第二光点的数量所得的商的平均值，每个所述第一光点均基于用于标记所述目标分 子的所述荧光标记，每个所述第二光点均基于用于标记所述照射对象分子的所述荧光标 记。
5.根据权利要求3所述的荧光图像获取装置，所述荧光图像获取装置还具有图像产生装置，用于使用由所述物镜放大的荧光图像来作为所述生物样本的所述部位 的荧光图像，以产生所述生物样本的荧光图像；以及信息记录装置，用于记录对于所述生物样本的所述荧光图像所产生的信息作为表示在 所述计算装置执行的计算处理过程中被排除的各个所述细胞核的位置的信息，所记录的所 述信息与所述生物样本的所述荧光图像相关联。
6.一种荧光图像获取方法，包括以下步骤 对其上附有荧光标记的生物样本执行暗视野照明；焦点移动步骤，在其上附有所述荧光标记的所述生物样本的厚度方向上移动物镜的焦点；在所述焦点移动步骤中移动所述物镜的焦点的同时，将摄像装置曝光，所述摄像装置 上产生有由所述物镜放大以作为所述生物样本的部位的荧光图像的图像；以及以所述焦点移动步骤中所述物镜的焦点进行的所述移动的终点为契机，从所述摄像装 置获取由所述物镜放大以作为所述生物样本的所述部位的荧光图像的所述图像。
7. 一种荧光图像获取程序，其由计算机来执行，以进行以下处理，包括 光照射处理，对其上附有荧光标记的生物样本执行暗视野照明； 焦点移动处理，在其上附有所述荧光标记的所述生物样本的厚度方向上移动物镜的焦点；曝光处理，在所述生物样本的厚度方向上移动所述物镜的焦点的同时，将摄像装置曝 光，所述摄像装置上产生有由所述物镜放大以作为所述生物样本的部位的荧光图像的图 像；以及图像获取处理，以所述物镜的焦点进行的在所述生物样本的厚度方向上的所述移动的 终点为契机，从所述摄像装置获取由所述物镜放大以作为所述生物样本的所述部位的荧光 图像的所述图像。
全文摘要
本发明公开了一种荧光图像获取装置、荧光图像获取方法以及荧光图像获取程序。其中，该荧光图像获取装置包括激励光源、物镜、摄像装置、焦点移动控制装置和摄像控制装置。
文档编号G01N21/64GK101950076SQ201010223228
公开日2011年1月19日 申请日期2010年7月2日 优先权日2009年7月10日
发明者木岛公一朗 申请人:索尼公司