专利名称：一种基于多重上转换发光免疫层析技术的霍乱检测分型试纸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于多重上转换发光免疫层析技术的试纸，特别涉及一种可对霍乱弧菌01群与0139群进行同步检测与分型的基于多重上转换发光免疫层析技术的试纸。
背景技术：
霍乱(Cholera)是由01血清群和0139血清群霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的急性肠道传染病，是以发病急、传播快、波及范围广、能引起大流行为特征的国际检疫传染病之一，也是《中华人民共和国传染病防治法》规定的甲类传染病之一，《国内交通卫生检疫条例》也将其列为检疫传染病。它可以引起散发、流行、暴发、甚至世界性大流行，不仅危害人民健康，而且影响人民正常生活、生产、旅游、经贸、交通运输、甚至社会安定。根据菌体(0)抗原的不同，目前已将霍乱弧菌分出200个以上的0血清群 (Oserogroups)，但仅发现01和0139群霍乱弧菌能引发霍乱。1992年以前，仅01群霍乱弧菌(V. cholerae 01)的两个生物型，即古典生物型(Classical biotype)和埃尔托生物型 (El Tor biotype)引发了七次霍乱世界大流行。而对01群以外的其他血清群，统称为非01 群霍乱弧菌(V. cholerae non-01)。非01群霍乱弧菌广泛分布于自然界水体中，一般不致病或仅引起散发性腹泻病例和肠道外感染。但1992年10月，印度首次发生了由非01群霍乱弧菌引起的霍乱大暴发，其病原被鉴定为0139血清群霍乱弧菌(V. cholerae 0139)。这个新确认的0139群与其他非01群霍乱弧菌最大的不同点在于，它能产生与01群霍乱弧菌相同的霍乱毒素(Cholera toxin, CT)，所引起的霍乱在临床和流行病学上也与01群霍乱弧菌所致霍乱基本相同主要通过水引起暴发流行，人感染后，该菌在肠内大量繁殖，造成腹泻、呕吐、严重脱水，如不医治会造成死亡。此外，0139群霍乱由于抗原发生了变异，人群对其缺乏免疫力。发病以青壮年为主，男性病例明显多于女性，无明显季节性，冬春季也可引起暴发流行。由此可见，霍乱弧菌的快速检测，并在检测中对血清型(01群还是0139群) 进行同步的判断，将对霍乱的预防以及霍乱发生后及时有效的控制处理具有重要的意义。目前所使用的常规的霍乱弧菌检测分型技术包括诊断血清玻片凝集试验、PCR、 胶体金试纸等，这些方法有的只能在实验室进行，无法在野外现场使用；有的操作流程较为复杂历时较长；有的敏感性低、特异性差；有的一次操作只能对一种目标被检物进行检测， 无法检测与分型同步进行。因而急需操作简便、快速、敏感性高、特异性好、检测分型同步的现场技术。免疫层析技术是经典的现场快速检测技术，操作简便、快速；上转换发光材料 (Up-Converting Phosphor,UCP)是新型的稀土金属晶体光学材料，其独特的物理结构以及化学组成使其具有绝无仅有的上转换发光现象，即UCP颗粒可由红外光激发、发射可见光； 上转换发光技术(Up-converting Phosphor Technology，UPT)促成了免疫层析技术与上转换发光材料的结合，即通过一系列表面修饰与活化后将UCP颗粒作为标记物应用于免疫层析，在红外光照射下以独特的上转换发光现象揭示生物活性分子之间高灵敏度特异性的识别，进而光信号转换为电信号实现了目标被检物的准确定量。若能建立多重上转换发光免疫层析技术(UPT-based later-flow assay,UPT-LFassay)则可在保证简便、快速、敏感性、 特异性、定量能力的同时实现01群与0139群霍乱弧菌的检测与分型。发明技术本发明目的在于公开一种基于多重上转换发光免疫层析技术(基于多重UPT-LF) 的霍乱检测分型试纸。本发明基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸的结构组成为样品垫[1]、结合垫[2]、分析膜[3]、吸水垫[4]和粘性底衬[5](如附图1所示)。其中，样品垫[1]是具有较大床体积且微观结构均勻的物质吸水纸、纤维素膜、 玻璃纤维、无纺布或滤血膜。其中，结合垫[2]是具有较大床体积且微观结构均勻的物质玻璃纤维、聚酯膜或无纺布；结合垫[2]中固定有UCP结合物混合物[6]，UCP结合物混合物W]中包括两种检测结合物，即UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]与UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]，一种质控结合物，即UCP-羊IgG结合物[9]；其中，UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]由UCP颗粒和01群霍乱弧菌单抗A结合而成；UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物 [8]由UCP颗粒和0139群霍乱弧菌单抗A结合而成；UCP-羊IgG结合物[9]由UCP颗粒和羊IgG结合而成；UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]和UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]可分别高特异性地与01群霍乱弧菌[10]、0139群霍乱弧菌[11]结合；UCP-羊IgG 结合物[9]可质控层析过程正常与否。其中，分析膜[3]是微观结构均勻的物质硝酸纤维素膜或尼龙膜；其中，分析膜 [3]上设置有检测带Tl[12]、检测带T2[13]和质控带C[14]；检测带Tl[12]为01群霍乱弧菌单抗B，检测带Τ2 [13]为0139群霍乱弧菌单抗B，质控带C[14]为兔抗羊IgG ；检测带 Tl [12]即01群霍乱弧菌单抗B与UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]构成双抗体夹心模式可特异性的检测01群霍乱弧菌，检测带T2[13]即0139群霍乱弧菌单抗B与UCP-0139 群霍乱弧菌单抗A结合物[8]构成双抗体夹心模式可特异性的检测0139群霍乱弧菌，而质控带C[14]即兔抗羊IgG可与UCP-羊IgG结合物[9]直接结合用于质控整个层析流程是否正常。其中，吸水垫[4]是具有较大床体积的物质吸水纸或纤维素膜。其中，粘性底衬[5]是单面涂有压力敏感胶的硬体材质PVC板。其中，01群霍乱弧菌单抗A与01群霍乱弧菌单抗B，可为同一种特异性单抗，也可为两种特异性单抗；其中，0139群霍乱弧菌单抗A与0139群霍乱弧菌单抗B，可为同一种特异性单抗， 也可为两种特异性单抗；其中，UCP颗粒，可通过上转换发光现象对样品中01群霍乱弧菌[10]与0139群霍乱弧菌[11]的存在与否以及浓度予以指示。本发明基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸的制备方法为A.结合垫[2]的制备将UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7] ,UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]和UCP-羊IgG结合物[9]混合，得UCP结合物混合物[6]，用pH = 7. 2的0. 03M PB含1-10% BSA、0.海藻糖和0.蔗糖的混合液作为结合物稀释液将UCP结合物混合物[6]稀释至终浓度为0. 5-;3mg/ml，将UCP结合物混合物[6]加于玻璃纤维、聚酯膜或无纺布上，于37-50°C下烘干30min-;3h，得结合垫[2]，备用；B.分析膜[3]的制备将l-2mg/ml 01群霍乱弧菌单抗B、l_2mg/ml 0139群霍乱弧菌单抗B和l-2mg/ml兔抗羊IgG喷点于硝酸纤维素膜或尼龙膜上分别作为检测带 Tl[12]、检测带T2[13]和质控带C[14]，于35-40°C下烘干30min-lh，得分析膜[3]，备用；C.将样品垫[1]、结合垫[2]、分析膜[3]和吸水垫[4]依次粘帖于粘性底衬[5] 上，确保相互之间的重叠关系(如附图2所示)；将试纸剪切为2-4mm宽单独可用的成品， 得本发明基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸；成型的试纸可直接使用或置入塑料外壳中使用。本发明基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸的制备方法优选为A.结合垫[2]的制备将UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]、UCP_0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]和UCP-羊IgG结合物[9]混合，得UCP结合物混合物[6]，用pH = 7. 2的0. 03M PB含5% BSA、5%海藻糖和5%蔗糖的混合液作为结合物稀释液将UCP结合物混合物[6]稀释至终浓度为ang/ml，将UCP结合物混合物[6]加于玻璃纤维、聚酯膜或无纺布上，于40°C下烘干1. ，得结合垫[2]，备用；B.分析膜[3]的制备将1. 5mg/ml 01群霍乱弧菌单抗B、l. 5mg/ml 0139群霍乱弧菌单抗B和1. 5mg/ml兔抗羊IgG喷点于硝酸纤维素膜或尼龙膜上分别作为检测带 Tl[12]、检测带T2[13]和质控带C[14]，于37°C下烘干40分钟，得分析膜[3]，备用；C.将样品垫[1]、结合垫[2]、分析膜[3]和吸水垫[4]依次粘帖于粘性底衬[5] 上，确保相互之间的重叠关系(如附图2所示)；将试纸剪切为3mm宽单独可用的成品，得本发明基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸；成型的试纸可直接使用或置入塑料外壳中使用。一种用本发明基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸检测分型霍乱弧菌的方法A.样品预处理水样、食品、粪便等样品可直接检测或用碱性蛋白胨水增菌4h_5h 后再进行检测；B.样品处理将0. 5-2倍体积经过预处理的样品与1倍体积样品处理液 (0. 1-0. 3MpH = 7. 2PB 含 0. I-IM NaCl,0. 1-1% SDS)混合；C.添加样品将处理后的液体样品滴加至上述本发明多重UPT-LF试纸的样品垫 [1]上；D.层析反应静置数分钟待层析反应完成；E.结果判读用上转换发光生物传感器对试纸进行扫描；定性检测只有质控带C[14]有信号产生，则样品为01群与0139群霍乱弧菌阴性；检测带Tl [12]与质控带C[14]有信号产生，则样品为01群霍乱弧菌阳性；检测带 T2[13]与质控带C[14]有信号产生，则样品为0139群霍乱弧菌阳性；检测带Tl[12]、检测带Τ2[13]、质控带C[14]均有信号产生，则样品为01群与0139群霍乱弧菌阳性；检测带 Tl [12]、检测带T2 [13]、质控带C[14]均无信号产生，则层析系统异常检测失败，需进行再次检测；定量检测将检测带Tl[12]、检测带T2[13]、质控带C[14]的信号强度(即峰面积)依次赋值于Tl、T2、C，T1/C为01群霍乱弧菌的检测值，T2/C为0139群霍乱弧菌的检测值，经标准浓度菌液标定并绘制定量曲线后，通过任意样品的检测值即可获得该样品中01群与0139群霍乱弧菌的有无及具体浓度，从而实现定量检测。一种用本发明基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸检测分型霍乱弧菌的方法优选为A.样品预处理水样、食品、粪便等样品可直接检测或用碱性蛋白胨水增菌4. 5h 后再进行检测；B.样品处理将1倍体积经过预处理的样品与1倍体积样品处理液(0. 15M pH = 7. 2PB 含 0. 3M NaCl,0. 3% SDS)混合；C.添加样品将处理后的液体样品滴加至上述本发明多重UPT-LF试纸的样品垫上；D.层析反应静置数分钟待层析反应完成；E.结果判读用上转换发光生物传感器对试纸进行扫描；定性检测只有质控带C[14]有信号产生，则样品为01群与0139群霍乱弧菌阴性；检测带Tl [12]与质控带C[14]有信号产生，则样品为01群霍乱弧菌阳性；检测带 T2[13]与质控带C[14]有信号产生，则样品为0139群霍乱弧菌阳性；检测带Tl [12]、检测带T2[13]、质控带C[14]均有信号产生，则样品为01群与0139群霍乱弧菌阳性；检测带 Tl [12]、检测带T2 [13]、质控带C[14]均无信号产生，则层析系统异常检测失败，需进行再次检测；定量检测将检测带Tl[12]、检测带T2[13]、质控带C[14]的信号强度(即峰面积)依次赋值于Tl、T2、C，T1/C为01群霍乱弧菌的检测值，T2/C为0139群霍乱弧菌的检测值，经标准浓度菌液标定并绘制定量曲线后，通过任意样品的检测值即可获得该样品中 01群与0139群霍乱弧菌的有无及具体浓度，从而实现定量检测。本发明基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸的检测原理为检测中将液体样品添加至样品垫[1]上后，液体样品自样品垫[1]渗透入结合垫；在液体样品基质的作用下，结合垫[2]中固定的UCP结合物混合物[6]将重新溶解游离，并同样品一同离开结合垫[2]进入分析膜[3]，在毛细作用下，通过检测带Tl [12]、检测带T2[13]、质控带C[14]向吸水垫[4]的方向涌动；在这一过程中，检测带Tl[12]/检测带 Τ2[13]/质控带C[14]、UCP结合物混合物[6]、样品中的01群/0139群霍乱弧菌之间将发生特异性的免疫反应，从而产生可检测的信号，如附图3所示1、01群与0139群霍乱弧菌阴性样品(图3A)样品中既不含有01群霍乱弧菌[10]，也不含有0139群霍乱弧菌[11]，因而检测带Tl [12]即01群霍乱弧菌单抗B与 UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]之间、检测带T2[13]即0139群霍乱弧菌单抗B与 UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]之间，无法发生结合，UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]与UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]只能依次流过检测带Tl [12]、检测带 Τ2[13]、质控带C[14]；而质控结合物即UCP-羊IgG结合物[9]则在通过质控带C[14]即兔抗羊IgG时，通过免疫反应将UCP颗粒固定于质控带C[14]，从而产生可检测的信号；最终，对于01群与0139群霍乱弧菌阴性样品而言，只有质控带C[14]上有信号产生；2、01群霍乱弧菌阳性样品(图;3B)样品中含有01群霍乱弧菌[10]，但不含有 0139群霍乱弧菌[11]，因而检测带Tl [12]即01群霍乱弧菌单抗B/01群霍乱弧菌[10]/ UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]之间可通过双抗体夹心模式的免疫反应将UCP颗粒固定于检测带Tl [12]，从而产生可检测的信号；而UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]只能依次流过检测带Tl [12]、检测带T2 [13]、质控带C[14]，而无法结合于检测带T2 [13]；质控结合物即UCP-羊IgG结合物[9]则在通过质控带C[14]即兔抗羊IgG时，通过免疫反应将UCP颗粒固定于质控带C[14]，从而产生可检测的信号；最终，对于01群霍乱弧菌阳性样品而言，检测带Tl[12]与质控带C[14]上均有信号产生；3、0139群霍乱弧菌阳性样品(图3C)样品中不含有01群霍乱弧菌[10]，但含有0139群霍乱弧菌[11]，因而检测带T2[13]即0139群霍乱弧菌单抗Β/0139群霍乱弧菌[11]/UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]之间可通过双抗体夹心模式的免疫反应将UCP颗粒固定于检测带T2 [13]，从而产生可检测的信号；而UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]只能依次流过检测带Tl[12]、检测带T2[13]、质控带C[14]，而无法结合于检测带 Tl[12]；质控结合物即UCP-羊IgG结合物[9]则在通过质控带C[14]即兔抗羊IgG时，通过免疫反应将UCP颗粒固定于质控带C[14]，从而产生可检测的信号；最终，对于0139群霍乱弧菌阳性样品而言，检测带T2[13]与质控带C[14]上均有信号产生；4、01群与0139群霍乱弧菌阳性样品(图3D)样品中既含有01群霍乱弧菌[10]， 又含有0139群霍乱弧菌[11]，因而检测带Tl [12]即01群霍乱弧菌单抗B/01群霍乱弧菌 [10]/UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]之间、检测带T2[13]即0139群霍乱弧菌单抗 Β/0139群霍乱弧菌[11]/UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]之间，均可通过双抗体夹心模式的免疫反应将UCP颗粒分别固定于检测带Tl [12]与检测带T2 [13]，从而产生可检测的信号；质控结合物即UCP-羊IgG结合物[9]也在通过质控带C[14]即兔抗羊IgG时， 通过免疫反应将UCP颗粒固定于质控带C[14]，从而产生可检测的信号；最终，对于01群与 0139群霍乱弧菌阳性样品而言，检测带Tl[12]、检测带T2[13]与质控带C[14]上均有信号产生。本发明基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸通过将UCP颗粒作为标记物与免疫层析技术相结合，并将传统的单靶标检测免疫层析试纸拓展为多重检测，最终所建立的基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸，具有操作简便、快速、敏感性高、特异性好的特点，可在野外现场实现样品中01群与0139群霍乱弧菌的定量检测与分型。


图1 本发明基于多重上转换发光免疫层析技术(UPT-LF)的霍乱检测分型试纸结构图；图2 本发明基于多重上转换发光免疫层析技术(UPT-LF)的霍乱检测分型试纸粘帖示意图；图3 本发明基于多重上转换发光免疫层析技术(UPT-LF)的霍乱检测分型试纸检测原理图；图4 01群霍乱弧菌浓度响应曲线与定量检测曲线；图5 0139群霍乱弧菌浓度响应曲线与定量检测曲线；图6 01群与0139群霍乱弧菌混合样品检测；图7 01群霍乱弧菌特异检测性能评价；图8 0139群霍乱弧菌特异检测性能评价。
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。实验例1本发明基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸的灵敏度与定量能力评价实验1、标准菌液样品制备(1)用碱性蛋白胨水分别培养01群与0139群霍乱弧菌至对数中期；(2) 8000rpm, 5min 离心浓缩；(3)平板计数，确定准确的菌液浓度；(4)用碱性蛋白胨水将菌浓度分别调至Ocfu/ml (即碱性蛋白胨水)、104cfu/ml、 105cfu/ml、106cfu/ml、107cfu/ml，以此作为灵敏度以及定量能力评价的标准品。2、使用本发明实施例1方法制备得到的基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸对系列浓度标准品进行检测，操作流程如下(1)样品处理将1倍体积经过预处理的样品与1倍体积样品处理液(0. 15M pH = 7. 2PB 含 0. 3M NaCl,0. 3% SDS)混合；(2)添加样品将处理后的液体样品滴加140 μ 1至本发明多重UPT-LF试纸的样品垫上，每个样品重复检测3次；(3)层析反应静置15min待层析反应完成；(4)结果判读用上转换发光生物传感器对试纸进行扫描，检测结果以T1/C值(01 群)和T2/C值(0139群)表示；3、实验结果实验结果如附图4和附图5所示(1)判定值的确定以空白样品(碱性蛋白胨水)三次检测值T/C的均值+3倍标准差(5+3SD )作为判定值，01群与0139群检测的判定值均为0. 3，T1/C大于0. 3则为01 群阳性，T2/C大于0. 3则为0139群阳性；(2)灵敏度评价104CfU/ml 01群霍乱弧菌标准品的检测值(T1/C)与104cfu/ml 0139群霍乱弧菌标准品的检测值(T2/C)均大于0. 3，因而基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸其对01群与0139群霍乱弧菌的检测敏感性均可达到IO4CfuAil ；(3)定量能力评价以LOG (T/C值)作为X，以L0G(cfu/ml)作为y，绘制标准定量曲线并经统计拟合，即可获得01群与0139群的定量拟合公式01 群定量拟合公式:y = 2. 7148x+4. 9796，R2 = 0. 9972χ 为 LOG (T1/C 值)，y 为 LOG (cfu/ml)；0139 群定量拟合公式y = 3. 2923x+5. 5629, R2 = 0. 9917χ 为 LOG (T1/C 值)，y 为 LOG (cfu/ml)；其中01群与0139群霍乱弧菌定量拟合公式的决定系数(R2)分别达到了 0. 9972 与0. 9917，由此说明本发明多重UPT-LF具有很好的定量能力，经推导定量公式的最终形式
为
权利要求
1.一种基于多重上转换发光免疫层析技术的霍乱检测分型试纸，其特征在于该检测分型试纸的结构组成为样品垫[1]、结合垫[2]、分析膜[3]、吸水垫[4]和粘性底衬[5]。
2.如权利要求1所述的检测分型试纸，其特征在于其中所述的样品垫[1]是具有较大床体积且微观结构均勻的物质吸水纸、纤维素膜、玻璃纤维、无纺布或滤血膜。
3.如权利要求1所述的检测分型试纸，其特征在于其中所述的结合垫[2]是具有较大床体积且微观结构均勻的物质玻璃纤维、聚酯膜或无纺布；结合垫[2]中固定有UCP结合物混合物[6]，UCP结合物混合物W]中包括两种检测结合物，即UCP-Ol群霍乱弧菌单抗 A结合物[7]与UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]，一种质控结合物，即UCP-羊IgG 结合物[9]；其中，UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]由UCP颗粒和01群霍乱弧菌单抗 A结合而成；UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]由UCP颗粒和0139群霍乱弧菌单抗A 结合而成；UCP-羊IgG结合物[9]由UCP颗粒和羊IgG结合而成；UCP-Ol群霍乱弧菌单抗 A结合物[7]和UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]可分别高特异性地与01群霍乱弧菌[10]、0139群霍乱弧菌[11]结合；UCP-羊IgG结合物[9]可质控层析过程正常与否。
4.如权利要求1所述的检测分型试纸，其特征在于其中所述的分析膜[3]是微观结构均勻的物质硝酸纤维素膜或尼龙膜；其中，分析膜[3]上设置有检测带Tl [12]、检测带 T2[13]和质控带C[14]；检测带Tl[12]为01群霍乱弧菌单抗B，检测带Τ2 [13]为0139群霍乱弧菌单抗B，质控带C[14]为兔抗羊IgG ；检测带Tl [12]即01群霍乱弧菌单抗B与 UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]构成双抗体夹心模式可特异性的检测01群霍乱弧菌， 检测带T2[13]即0139群霍乱弧菌单抗B与UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]构成双抗体夹心模式可特异性的检测0139群霍乱弧菌，而质控带C[14]即兔抗羊IgG可与UCP-羊 IgG结合物[9]直接结合用于质控整个层析流程是否正常。
5.如权利要求1所述的检测分型试纸，其特征在于其中所述的吸水垫[4]是具有较大床体积的物质吸水纸或纤维素膜。
6.如权利要求1所述的检测分型试纸，其特征在于其中所述的粘性底衬[5]是单面涂有压力敏感胶的硬体材质PVC板。
7.如权利要求3或4所述的检测分型试纸，其特征在于其中所述的01群霍乱弧菌单抗 A与01群霍乱弧菌单抗B，可为同一种特异性单抗，也可为两种特异性单抗；
8.如权利要求3或4所述的检测分型试纸，其特征在于其中所述的0139群霍乱弧菌单抗A与0139群霍乱弧菌单抗B，可为同一种特异性单抗，也可为两种特异性单抗；
9.如权利要求3或4所述的检测分型试纸，其特征在于其中所述的UCP颗粒，可通过上转换发光现象对样品中01群霍乱弧菌[10]与0139群霍乱弧菌[11]的存在与否以及浓度予以指示。
10.如权利要求1-9任一所述的检测分型试纸的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤A.结合垫[2]的制备将UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]、UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]和UCP-羊IgG结合物[9]混合，得UCP结合物混合物[6]，用pH = 7. 2 的0. 03M PB含1-10%BSA、0. 海藻糖和0. 蔗糖的混合液作为结合物稀释液将 UCP结合物混合物[6]稀释至终浓度为0. 5-;3mg/ml JfUCP结合物混合物[6]加于玻璃纤维、聚酯膜或无纺布上，于37-50°C下烘干30min-;3h，得结合垫[2]，备用；B.分析膜[3]的制备将l-2mg/ml01群霍乱弧菌单抗B、l_2mg/ml 0139群霍乱弧菌单抗B和l-2mg/ml兔抗羊IgG喷点于硝酸纤维素膜或尼龙膜上分别作为检测带Tl [12]、检测带T2[13]和质控带C[14]，于35-40°C下烘干30min-lh，得分析膜[3]，备用；C.将样品垫[1]、结合垫[2]、分析膜[3]和吸水垫[4]依次粘帖于粘性底衬[5]上，确保相互之间的重叠关系(如附图2所示)；将试纸剪切为2-4mm宽单独可用的成品，得本发明基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸；成型的试纸可直接使用或置入塑料外壳中使用。
11.如权利要求10所述的检测分型试纸的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤A.结合垫[2]的制备将UCP-Ol群霍乱弧菌单抗A结合物[7]、UCP-0139群霍乱弧菌单抗A结合物[8]和UCP-羊IgG结合物[9]混合，得UCP结合物混合物[6]，用pH = 7. 2 的0. 03M PB含5% BSA、5%海藻糖和5%蔗糖的混合液作为结合物稀释液将UCP结合物混合物[6]稀释至终浓度为ang/ml，将UCP结合物混合物[6]加于玻璃纤维、聚酯膜或无纺布上，于40°C下烘干1. ，得结合垫[2]，备用；B.分析膜[3]的制备将1.5mg/ml 01群霍乱弧菌单抗B、1. 5mg/ml 0139群霍乱弧菌单抗B和1. 5mg/ml兔抗羊IgG喷点于硝酸纤维素膜或尼龙膜上分别作为检测带Tl [12]、检测带T2[13]和质控带C[14]，于37°C下烘干40分钟，得分析膜[3]，备用；C.将样品垫[1]、结合垫[2]、分析膜[3]和吸水垫[4]依次粘帖于粘性底衬[5]上，确保相互之间的重叠关系(如附图2所示)；将试纸剪切为3mm宽单独可用的成品，得本发明基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸；成型的试纸可直接使用或置入塑料外壳中使用。
12.—种霍乱弧菌的检测分型方法，其特征在于在检测过程中采用权利要求1-9任一所述的基于多重上转换发光免疫层析技术的霍乱检测分型试纸，检测流程为A.样品预处理水样、食品、粪便等样品可直接检测或用碱性蛋白胨水增菌4h4h后再进行检测；B.样品处理将0.5-2倍体积经过预处理的样品与1倍体积样品处理液(0. 1-0. 3MpH =7. 2PB 含 0. I-IM NaCl,0. 1-1% SDS)混合；C.添加样品将处理后的液体样品滴加至权利要求1-8所述的多重UPT-LF试纸的样品垫[1]上；D.层析反应静置数分钟待层析反应完成；E.结果判读用上转换发光生物传感器对试纸进行扫描；定性检测只有质控带C[14]有信号产生，则样品为01群与0139群霍乱弧菌阴性；检测带Tl[12]与质控带C[14]有信号产生，则样品为01群霍乱弧菌阳性；检测带T2[13]与质控带C[14]有信号产生，则样品为0139群霍乱弧菌阳性；检测带Tl [12]、检测带T2 [13]、 质控带C[14]均有信号产生，则样品为01群与0139群霍乱弧菌阳性；检测带Tl [12]、检测带T2[13]、质控带C[14]均无信号产生，则层析系统异常检测失败，需进行再次检测；定量检测将检测带Tl[12]、检测带T2[13]、质控带C[14]的信号强度(即峰面积)依次赋值于T1、T2、C，T1/C为01群霍乱弧菌的检测值，T2/C为0139群霍乱弧菌的检测值，经标准浓度菌液标定并绘制定量曲线后，通过任意样品的检测值即可获得该样品中01群与 0139群霍乱弧菌的有无及具体浓度，从而实现定量检测。
13.如权利要求12所述的霍乱弧菌的检测分型方法，其特征在于检测流程为A.样品预处理水样、食品、粪便等样品可直接检测或用碱性蛋白胨水增菌4.5h后再进行检测；B.样品处理将1倍体积经过预处理的样品与1倍体积样品处理液(0.15M pH = 7. 2PB 含 0. 3M NaCl,0. 3% SDS)混合；C.添加样品将处理后的液体样品滴加至上述本发明多重UPT-LF试纸的样品垫[1]上；D.层析反应静置数分钟待层析反应完成；E.结果判读用上转换发光生物传感器对试纸进行扫描；定性检测只有质控带C[14]有信号产生，则样品为01群与0139群霍乱弧菌阴性；检测带Tl [12]与质控带C[14]有信号产生，则样品为01群霍乱弧菌阳性；检测带T2[13]与质控带C[14]有信号产生，则样品为0139群霍乱弧菌阳性；检测带Tl[12]、检测带T2[13]、 质控带C[14]均有信号产生，则样品为01群与0139群霍乱弧菌阳性；检测带Tl [12]、检测带T2[13]、质控带C[14]均无信号产生，则层析系统异常检测失败，需进行再次检测；定量检测将检测带Tl[12]、检测带T2[13]、质控带C[14]的信号强度(即峰面积)依次赋值于T1、T2、C，T1/C为01群霍乱弧菌的检测值，T2/C为0139群霍乱弧菌的检测值，经标准浓度菌液标定并绘制定量曲线后，通过任意样品的检测值即可获得该样品中01群与 0139群霍乱弧菌的有无及具体浓度，从而实现定量检测。
全文摘要
本发明基于多重上转换发光免疫层析技术(UPT-LF)的霍乱检测分型试纸通过将UCP颗粒作为标记物与免疫层析技术相结合，并将传统的单靶标检测免疫层析试纸拓展为多重检测，最终所建立的基于多重UPT-LF的霍乱检测分型试纸，具有操作简便、快速、敏感性高、特异性好的特点，可在野外现场实现样品中O1群与O139群霍乱弧菌的定量检测与分型。
文档编号G01N33/569GK102375059SQ20101025768
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者周蕾, 杨瑞馥, 邱海燕, 郝民, 郭兆彪, 阚飙 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所