专利名称：高山冰缘植物抗冻蛋白分离与检测的方法及其装置的制作方法
技术领域：
本发明属于蛋白质工程技术，涉及一种高山冰缘植物抗冻蛋白初步分离与检测的方法及其装置。
背景技术：
抗冻蛋白最早在南极鱼类中发现，是一类能够抑制冰晶生长的特殊蛋白，可以抑制重结晶过程并降低溶液冰点，迄今已经从鱼类、昆虫、真菌和植物中发现抗冻蛋白，但这些蛋白之间同源性很低，证明这是一类新进化的蛋白，所以寻找的最佳方案是从低温环境的物种中根据抗冻蛋白的特性进行分离、检测。黑麦、黑麦草、胡萝卜中植物抗冻蛋白抑制重结晶的抗冻活性优于鱼类或其它来源的抗冻蛋白，并且越来越多的数据证明植物抗冻的主要机制是抑制重结晶，保护植物的膜结构，所以现行技术大多集中于冷诱导耐寒植物，提取质外体蛋白进行冰点降低测定和抑制重结晶测定。但由于抗冻蛋白分布的不普遍性，很难从特定几种植物中找到，并且传统的质外体提取技术难掌握。低温循环仪控温和倒置相差显微技术对仪器要求较高，一般实验室很难做到。所以建立简单高效分离和检测系统，在低温适应植物中进行大规模筛选才是最佳方案。

发明内容
本发明的目的旨在根据抗冻蛋白能够吸附在冰晶表面的特性，建立高山冰缘植物抗冻蛋白初步分离与检测方法。
本发明的另一目的利用自行设计的冰晶吸附装置，采用冻冰探头进行抗冻蛋白的富集分离，并以简单易行的重结晶观测装置来检测抗冻活性。
本发明的目的可通过如下措施来实现1、将液氮冻存的高山冰缘植物进行总可溶性蛋白提取后，利用本发明的冰晶吸附装置进行两次抗冻蛋白的富集；2、将富集后的蛋白通过透析袋脱盐，并利用PEG8000浓缩，用考马斯亮蓝G250定量。详细内容如下
(1)利用本发明建立的抗冻蛋白冰晶吸附系统进行高山冰缘植物抗冻蛋白的初步分离。首先将液氮保存的高山冰缘植物叶片进行研磨，粉末用pH8.0磷酸缓冲液混匀，并12000g离心10分钟，取上清，此为可溶性蛋白粗提液，将45毫升粗提液放入50毫升小烧杯4℃保存待用。用10米铜质导管一端与高压氮气罐出口连接，导管中部约8米缠绕浸没于液氮罐内液氮中，导管另一端约1米导出液氮罐外，在出液氮罐小于50厘米远处将导管折回180°，并将双线下弯90°，作为冻冰探头。高压氮气通过减压阀门顺导管流经液氮进行预冷，并流经探头排到空气中，此探头浸入含蛋白粗提液的50毫升小烧杯进行冻冰吸附，内放转子进行磁力搅拌保持溶液均匀。当烧杯内液面下降5毫升后取出冻冰探头，室温融化冰晶，补加磷酸缓冲液至45毫升，重复用探头冻冰吸附一次。
(2)将第二次冻冰的冰晶室温，利用截流量5000道尔顿的透析袋在无离子水中脱盐12小时，每隔2小时换水，脱盐后透析袋埋入PEG8000的粉末中浓缩。浓缩后的蛋白溶液用用考马斯亮蓝G250比色法测定浓度，用BSA做标准曲线。
高 冰缘植物抗冻蛋白1、利用本发明的抑制重结晶观测系统对定量后的蛋白进行重结晶活性检测。2、将有抗冻活性的组份真空冻干。详细内容如下(1)利用本发明建立的抑制重结晶观测系统对定量后的蛋白进行重结晶活性检测。可控温冰柜去掉顶盖，内放置奥林帕斯BH/2光学显微镜，去掉显微镜顶置相机，用塑料泡沫板覆盖冰柜，并挖孔露出显微镜照相目镜，利用照相目镜预先调好视野亮度、焦距，并将冰柜温度设为摄氏温度-5℃。将定量后的蛋白用20％蔗糖溶液稀释成1mg/L和5mg/L浓度，滴加到一载玻片，覆盖一盖玻片压成均匀液膜。将制片放入-70℃低温冰箱30分钟冻冰后，通过塑料泡沫板操作入口迅速将制片放到显微镜载物台，通过操作观察口观察中向盖玻片上加一滴二甲苯，100倍油镜观察，调整视野，重结晶15分钟后放上照相机照相记录(2)有活性的高山冰缘植物抗冻蛋白粗提液采用真空冻干机进行冻干后放入-70℃冰箱保存。
本发明相比现有技术具有如下优点1.抗冻蛋白的现行技术大多集中于冷诱导耐寒植物，提取质外体蛋白进行抗冻蛋白分离。由于抗冻蛋白分布的不普遍性，很难从特定几种植物中找到目的蛋白。本系统利用高山冰缘植物许多物种具有低抗反复冻融的能力的特点，从高山冰缘植物可溶性蛋白粗提液中直接寻找，提高了得到抗冻蛋白可能性。
2.传统的质外体提取技术和柱层析系统分离的技术难掌握，本发明建立的冰晶吸附系统利用了抗冻蛋白特有的性质，并且一般实验室容易实现，是一种快速有效的分离手段。
3.传统的抑制重结晶的方法采用低温循环仪控温和倒置相差显微技术，对仪器要求较高，一般实验室很难做到。本发明建立的抑制重结晶观测装置对仪器要求低，并且比低温循环仪控温稳定，物镜可用100倍，远大于倒置显微的40倍镜物镜。


图1为本发明抗冻蛋白冰晶吸附装置剖面示意2为本发明抑制重结晶观测装置剖面示意3为本发明塑料泡沫板盖子示意4为本发明观察到蔗糖溶液的重结晶过程示意5为本发明左中为高山早熟禾，右中为高山离子芥，左下为珠芽蓼，右下为高山红景天与左上为蔗糖空白，右上为1mg/LBSA对照示意图具体实施方式
本发明还将结合附图作进一步详述首先将液氮保存的高山冰缘植物叶片高山红景天、高山早熟禾、高山离子芥、株芽蓼利用液氮进行研磨，研磨得到的粉末用pH8.0磷酸缓冲液混匀，并12000g离心10分钟，取上清，此为可溶性蛋白粗提液，将45毫升粗提液放入50毫升小烧杯5在4℃保存待用。用高压氮气通过减压阀门2以0.1兆帕压力顺导管3流经液氮进行探头7预冷，探头7浸入含蛋白粗提液的50毫升小烧杯5进行冻冰吸附，内放转子进行磁力搅拌保持溶液均匀(参见图1)。当烧杯内液面下降5毫升后取出冻冰探头7，室温融化冰晶，补加磷酸缓冲液至45毫升，重复用探头冻冰吸附一次。第二次冻冰的冰晶室温融化，利用截流量5000道尔顿的透析袋在无离子水中脱盐12小时，每隔2小时换水，脱盐后透析袋埋入PEG8000的粉末中浓缩。浓缩后的蛋白溶液用用考马斯亮蓝G250比色法测定浓度，用BSA做标准曲线。将定量后的蛋白用20％蔗糖溶液稀释成1mg/L和5mg/L浓度，滴加到一载玻片，覆盖一盖玻片压成均匀液膜。将制片放入-70℃低温冰箱8内30分钟冻冰后，通过塑料泡沫板13操作入口迅速将制片11放到显微镜9载物台，通过照相目镜子10操作观察口观察中向盖玻片上加一滴二甲苯(参见图2、4)，100倍油镜观察，调整视野，重结晶15分钟后放上照相机照相记录，发现高山离子芥和株芽蓼具有抑制重结晶的活性(参见图5)。
观察完毕，卸掉顶置相机12，盖上操作孔盖子17与观察孔盖子18。
权利要求
1.一种高山冰缘植物抗冻蛋白分离与检测的方法，包括下述步骤(1)将液氮冻存的高山冰缘植物叶片进行研磨，粉末用磷酸缓冲液混匀，并12000g离心10-15分钟，即为可溶性蛋白的粗提液；(2)将45毫升粗提液放入50毫升的小烧杯(5)在4℃保存，利用冰晶吸附装置进行两次抗冻蛋白的富集；(3)将第二次冻冰的冰晶室温，利用截流量5000道尔顿的透析袋在无离子水中脱盐12小时，每隔两小时换水，脱盐后透析袋埋入PEG8000的粉末中进行浓缩，用考马斯亮蓝G250定量；(4)将富集后的蛋白利用抑制重结晶装置将20％蔗糖溶液加入分离后的一定量的蛋白组份，滴加到一载玻片，覆盖一盖玻片压成均匀液膜，将制片(11)放入零下70低温(8)冰柜冰冻后，迅速将制片(11)放到显微镜(9)载物台上，盖玻片上加一滴二甲苯，进行抗冻蛋白的活性检测。
2.根据权利要求1所述的高山冰缘植物抗冻蛋白初步分离与检测的方法，其特征在于所述的抗冻蛋白冰晶吸附装置进行两次抗冻蛋白的富集，是将探头(7)浸入含蛋白粗提液的50毫升小烧杯(5)进行吸附，将烧杯(5)内液面下降5毫升后取出冰冻探头(7)，室温融化冰晶，补加磷酸缓冲液至45毫升，重复用探头(7)冰冻吸附一次。
3.根据权利要求1所述的高山冰缘植物抗冻蛋白分离与检测的方法，其特征在于高山冰缘植物叶片为高山红景天、高山早熟禾、高山离子芥、株芽蓼。
4.一种如权利要求1所述的高山冰缘植物抗冻蛋白冰晶吸附装置，其特征在于铜质导管(3)一端与高压氮气罐出口连接，导管(3)通过减压阀门(2)，其中部缠绕浸没于液氮罐内液氮(4)中，导管(3)另一端导出液氮罐(4)外；在出液氮罐(4)小于50厘米远处将导管(3)折回180°，并将双线下弯90°，作为冻冰探头(7)，并浸入含粗提液小烧杯(5)进行冰冻吸附；烧杯(5)内放转子(6)进行磁动搅拌。
5.如权利要求1所述的高山冰缘植物抗冻蛋白抑制重结晶观测装置，其特征在于可控温冰柜(8)内放置奥林帕斯BH/2光学显微镜(9)，制片(11)放置到显微镜(9)载物台，照相目镜(10)伸出上覆盖塑料泡沫板盖子(13)外，盖上设有照相目镜孔(14)、操作孔(15)、操作观察孔(16)，拍照时加上顶置相机(12)。
全文摘要
本发明涉及一种高山冰缘植物组织培养与冷诱导分泌蛋白生产的方法，将液氮冻存的高山冰缘植物叶片进行研磨、粉末用磷酸缓冲液混匀，并12000g离心一段时间后即为可溶性蛋白的粗提液；利用冰晶吸附装置进行两次抗冻蛋白的富集，将富集后的蛋白通过透析袋进行脱盐，并浓缩，再利用抑制冰晶观察装置对定量后蛋白进行重结晶活性检测。本发明利用高山冰缘植物具有抵抗反复冻融能力的特点，采用冰晶吸附装置和抑制重结晶装置，进行高山冰缘植物抗冻蛋白的分离检测。该方法快速有效、简单易行，成本低，是一条从高山冰缘植物可溶性蛋白粗提液中获得抗冻蛋白的捷径。
文档编号G01N1/28GK1627055SQ20031012195
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月8日 优先权日2003年12月8日
发明者安黎哲, 王建辉 申请人:安黎哲