专利名称：用于表面增强拉曼散射光谱分析的多孔微量反应板的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种检测特定核酸、蛋白质、病原体和细胞的多孔微量反应板。
背景技术：
近年来，由于纳米颗粒的有序阵列排布技术飞速发展，银或金纳米岛的二维生物基底片的制备工艺迅速提高和成熟。基于这类基底片的表面增强拉曼散射光谱检测技术(SERS)以及表面增强荧光检测技术的灵敏度和稳定性也因此得到大幅度的提高，其理论检测下限已经达到单分子和单细胞的检测水平，因此极大地刺激了它们在医学检测和诊断领域的应用性研究。与目前使用的DNA、蛋白质和细胞检测技术相结合后，这些物理学方法将有望成为高度特异、高度灵敏、多指标高通量、可定性和定量的新一代生物医学检测系统，从而替代或改进目前广泛使用的DNA、蛋白质和细胞检测方法，将对肿瘤、感染等多类疾病的临床早期诊断带来革命性影响。与目前常用来检测DNA、蛋白质和细胞的聚合酶链反应、酶标记、荧光标记、化学发光标记、量子点标记以及放射标记等技术相比，基于二维银生物纳米基片的拉曼分子标记的SERS技术具有如下明显优势(I)能将拉曼信号倍增IO6-1O14,从而达到单分子的检测灵敏度，如果检测人体体液或组织切片中稀有细胞的胞内或胞膜分子，则能达到单细胞的检测水平；(2)拉曼光谱的激发波远窄于荧光和化学光(<2nm)，因此在进行多种拉曼分子标记和多指标检测时光谱干扰现象大为减弱，从而使结果判断更加特异，使真正的多指标分析和高通量检测成为可能；(3)拉曼信号不会发生荧光特有的淬灭现象，；(4)有多种多样的可产生稳定拉曼光谱的拉曼标记分子可供选择，种类远多于荧光蛋白；(5)只需单波长激发光即可检测很多种拉曼标记分子的拉曼光谱；(6)拉曼光谱能很容易地与生物标本的自发背景荧光相区别。基于这些优点，近几年来SERS在生物医学检测中的应用研究日益增多。在DNA和RNA检测方面，用DNA探针固相化银生物纳米基片，同时用拉曼分子标记金或银纳米颗粒进行三明治夹心检测靶向DNA片段是常用方法。Yunwei Cao用DNA探针固相玻片，Cy3标记寡核苷酸链，并用银液增染玻片，到达20fM的DNA检测下限。Ho Pui Ho利用银纳米岛基片和金纳米颗粒将DNA检测下限进一步降为O. 4fM。Lan Sun报道了一种PCR-free的定量检测多种RNA目的片段的SERS三明治法，在肿瘤细胞裂解液中检测到2. 3pM的多种目的mRNA片段。这一结果真正提示了 SERS技术替代real-time PCR法定量检测核酸的潜力。在蛋白质检测方面，拉曼分子和蛋白探针(抗体)共标记金属纳米颗粒(如银核金壳、银核硅壳等)。目前已被报道的检测下限有高有低，在l-100fg/ml范围之内。在细胞检测方面，血液中的循环肿瘤细胞、抗原特异性T细胞以及干细胞等的频率都远低于O. 1%，目前最先进的检测方式是荧光染色加流式细胞仪分析。然而，当稀有靶细胞的频率低于O. 1%时，流式细胞分析就不够准确了，因此近年来人们开始探讨用SERS技术检测人体中的稀有细胞。MichadY.Sha利用自制的SERS检测装置对外周全血中的循环肿瘤细胞建立了 SERS—步检测法，检测下限达到10-50cellS/ml全血，从而可以有效提高临床对肿瘤转移的早期诊断率。这一检测灵敏度提示了 SERS技术在检测医学稀有细胞领域中的巨大应用潜力。尽管应用前景很好，但是目前SERS技术在生物医学领域中的应用仍处于模型研究阶段，还未进入真实的临床应用领域，主要原因有已商业化的纳米生物基片较少。在物理制作工艺上，缺乏具有高度灵敏性和高度均一性的高质量生物纳米基片，因此不少实验室正加紧致力于基片制作工艺的提升；在医学检测上，缺乏与生物医学领域专家的紧密合作，更缺乏与生物医学检测实验室的大批量标本处理相配套的SERS检测平台。迄今为止，未见有将SERS检测所用的生物纳米基片与生物医学检测中常用的多孔微量反应板相结合的实验报道，也未见本实用新型发明方案的知识产权情况。在拥有粗糙金属表面的金\银生物纳米基片上，利用拉曼活性分子标记技术和表面增强拉曼散射光谱技术对特定的生物分子和生物细胞进行痕量检测甚至单分子\单细胞检测是一种正处于探索和快速发展阶段的新一代生物检测技术，还未真正进入生物医学的广泛应用阶段，也缺乏与医学检测实验室的大批量标本处理相匹配的检测反应平台。

发明内容
技术问题本发明提供了一种使表面增强拉曼散射光谱分析(SERS检测)微量化和高通量化，能够减轻实验人员工作量的用于表面增强拉曼散射光谱分析的多孔微量反应板，可以改变目前将单块基片粘入单个反应盒中对单份标本进行单独操作的局面，从而有利于促进SERS检测技术在医学和生命科学检测领域的实际应用。技术方案本发明的用于表面增强拉曼散射光谱分析的多孔微量反应板，包括基板、生物纳米基片和微量反应孔，微量反应孔以阵列方式排列在基板上，生物纳米基片加载在微量反应孔的内底上，每个生物纳米基片的上表面以阵列方式排列有纳米级的凸起、小孔或条纹。本发明中，微量反应孔的截面可以为圆形或等边多边形。本发明中，生物纳米基片可以为用于表面增强拉曼散射光谱分析的生物纳米基片。本发明中，生物纳米基片可以是直接以微量反应孔的孔底表面为界面，有序排布金银纳米颗粒而制成的。本发明以目前在医学和生命科学检测领域广泛用于酶联免疫反应检测的多孔微量反应板为平台，在其孔底加载拥有粗糙金银表面特征的生物纳米基片，或者直接在微量反应孔的底面有序排布金银纳米颗粒而制成纳米基底孔。以本发明的用于表面增强拉曼散射光谱分析的多孔微量反应板为标本的批量检测平台，利用各种拉曼活性分子标记技术和表面增强拉曼散射光谱技术(或表面增强荧光检测技术)高度特异地、高度灵敏地检测特定的核酸分子、蛋白质分子、病原体、血细胞和组织细胞等。有益效果本发明与现有技术相比，具有以下优点(I)本发明提供了一种用于表面增强拉曼散射光谱分析的多孔微量反应板，使以金属生物纳米基片为反应界面的SERS检测能够做到标本用量的微量化和多标本同步检测的高通量化，适用于生物医学检测实验室对大批量标本的处理，能极大地降低实验操作的工作量。本发明将能改变目前将单块基片粘入单个反应盒中对单份标本进行单独操作的局面，从而可以促进SERS检测技术在医学和生命科学检测领域的实际应用。(2)本发明适用于利用SERS检测技术对各种核酸分子、蛋白质分子、病原体、肿瘤细胞或其他靶细胞进行高度特异、高度灵敏、多标本的批量化检测。应用范围遍及医学和生命科学的各个检测领域，有着广泛的应用前景。本发明通过纳米微阵列排布技术制备而成的生物基片拥有粗糙的金属表面，拉曼活性分子在其表面的特征性拉曼光谱能有效增强106—14，以此纳米基片为反应界面的拉曼活性分子标记技术则可以用来痕量检测甚至单分子/单细胞检测特定的生物分子(如蛋白、核酸等)和生物细胞(如病原体、肿瘤细胞等)，此即目前正处于探索和快速发展阶段的SERS检测技术，在生命科学和医学科学的检测和诊断领域有着广阔的应用前景；以此SERS多孔微量反应板为实验平台则可以使标本的检测微量化和批量化，从而大大减少实验操作·的工作量。


图1为用于表面增强拉曼散射光谱分析的多孔微量反应板的结构示意图。图2为生物纳米基片的表面结构剖视图。图中有基板1、生物纳米基片2、微量反应孔3、小孔21、凸起22、条纹23。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例，对本发明做进一步说明。本发明的用于表面增强拉曼散射光谱分析的多孔微量反应板，包括基板1、生物纳米基片2和微量反应孔3，微量反应孔3以阵列方式排列在基板I上，生物纳米基片2加载在微量反应孔3的内底上，每个生物纳米基片2的上表面以阵列方式排列有纳米级的小孔21、凸起22或条纹23。本发明的一个实施例中，微量反应孔3的截面为圆形或等边多边形。本发明的一个实施例中，生物纳米基片2为用于表面增强拉曼散射光谱分析的生物纳米基片。本发明的一个实施例中，生物纳米基片2是直接以微量反应孔3的孔底表面为界面，有序排布金银纳米颗粒而制成的。本发明的用于表面增强拉曼散射光谱分析的多孔微量反应板的具体制备工艺步骤为I)选用以下形式和特征的用于酶联免疫反应检测的多孔微量反应板，包括用聚丙乙烯、聚氯乙烯或其他材料制成的圆形孔或多边形孔的多孔微量反应板；每孔的容量为50 μ 1-350 μ I ;12孔/条、10孔/条、8孔/条、6孔/条等的微孔反应条板；24孔/块、48孔/块、96孔/块、384孔/块等的微孔反应板。2)利用常规的纳米微阵列排布技术制备用于表面增强拉曼散射光谱分析的金属生物纳米基片，包括以玻璃片、铝片、半导体或其他材料为载体，在其表面有序组装金或银纳米颗粒，使该金属表面呈二维的有序的粗糙特征，如呈微阵列方式排布的纳米级凸起(island)、小孔(bottle or cavidity)或条纹等。每块基片的面积大小和形状被裁剪成与微量反应孔的孔径和孔形一致。3)用化学粘附剂、硅胶等将上述SERS生物纳米基片加载固定在上述微量反应孔的孔底面即成SERS多孔微量反应板。在一个实施例中，步骤2)中制备金属纳米基底孔时，可以直接以微量反应孔的孔底面为载体，利用纳米微阵列排布技术在其表面有序排布金或银纳米颗粒，使该金属表面呈二维的有序的粗糙特征，如呈微阵列方式排布的纳米级凸起(i s I and )、小孔(bott I e orcavidity)或条纹等，制备呈金属纳米基底孔，即成另一种形式的SERS多孔微量反应板。在一个实施例中，制备SERS生物纳米基片或纳米基底孔时，在其金属表面进行化学基团的修饰，使之能与核酸、蛋白质等生物大分子共价结合而将该生物大分子固定于其金属表面，有利于生物检测。下面以利用SERS银生物纳米基片对乙型肝炎病毒DNA进行痕量检测为例，叙述本 发明的
具体实施例方式( I)制备二维结构的银生物纳米基片采用传统的两步氧化法制备高度有序的多孔氧化铝模板将铝箔在O. 5mol/L的草酸中以直流电压40V进行氧化2h，温度维持在10° C，然后浸于75° C的铬酸(1.8wt.%)和磷酸(6wt. %)的等体积比的混合溶液中两个小时以去除氧化层。然后在同条件下进行第二步氧化2h，得到有序的多孔氧化铝模板。通过普通的恒流磁控溅射方法将银溅射到多孔氧化铝模板上获得二维银岛膜。(2)选用医学检测用的96孔酶标反应板，将生物纳米基片裁剪成直径与96孔板孔径一致的圆形基片，利用硅胶将基片平铺于每个孔的孔底表面，待硅胶凝固后将微孔板置封口膜中抽真空封闭，保存备用。(3)商业化合成乙肝病毒DNA特异性的一对DNA探针在正向探针的5’端偶联上特定的拉曼活性分子，如荧光素6-FAM，而后HPLC纯化收集探针；另外在反向DNA探针的3’端连接上巯基(-SH)，HPLC纯化和收集探针。(4)将反向DNA探针固相化于银生物纳米基片表面用O. 15M Nacl-1OmM PBS(pH6. 5)稀释反向DNA探针至I μ M，在银生物纳米基片多孔微量反应板中每孔加入20 μ I的反向DNA探针，置湿盒中室温反应5-6h，使反向探针通过其3’端的巯基与基片上的银结合而固定在基片表面。用O. 75MNacl-10mM PBS-0. 02%Tween20缓冲液洗漆微孔板20min,再用ddH20洗漆IOmin,再在通风橱中抽干。(5)用MCH封闭银生物纳米基片用ddH20稀释MCH(6-mercapto-l_hexanol)至ImM，加入多孔微量反应板中，每孔200μ 1，至室温反应lh，然后同上用O. 75M Nacl-1OmM PBS-0. 02%Tween 20缓冲液洗涤微孔板20min,再用ddH20洗漆IOmin,再在通风橱中抽干。(6 )血清病毒DNA提取用血清病毒DNA小量提取试剂盒提取患者血清中DNA，用O. 75M Nacl-1OmMPBS(PH7.0)稀释保存待检。(7)在银生物纳米基片上进行三明治式DNA杂交检测取血清DNA样品，950C加热变性lOmin，然后点样于96孔微量反应板中的基片上，每孔20 μ 1，置湿盒中37° C孵育过夜，同上用O. 75Μ Nacl-1OmM PBS-0. 02%Tween 20缓冲液洗漆微孔板20min,再用ddH20洗漆lOmin,在通风橱中抽干。(8)用 0.75M Nacl-1OmM PBS (ρΗ7· O)稀释 FAM 标记的正向 DNA 探针至 I μ M，加入微量反应板中的基片上，每孔20 μ 1，置湿盒中37° C孵育4-6h。(9)按以下顺序洗涤多孔微量反应板用O. 75M Nacl-1OmM PBS-O. 02%Tween 20 洗板 2Omin ；用O. 75M NaNO3-1OmM PBS 洗板 2Omin ；用ddH20洗板IOmin ;置通风橱中抽干。(10)用拉曼光谱检测仪(如Renishaw MicroRaman system)于检测每孔中基片 表面的拉曼散射光谱，根据6-FAM所特有的拉曼散射光谱的有无来判断标本中有无乙肝病毒特异的 DNA。检测条件为514nm excitation wave, 5mff power, IOseconds, Ramanrange:200-2000cm 1。
权利要求
1.一种用于表面增强拉曼散射光谱分析的多孔微量反应板，其特征在于，该反应板包括基板(I)、生物纳米基片(2 )和微量反应孔(3 )，所述微量反应孔(3 )以阵列方式排列在基板(I)上，所述生物纳米基片(2 )加载在微量反应孔(3 )的内底上，每个所述生物纳米基片(2)的上表面以阵列方式排列有纳米级的小孔(21)、凸起(22)或条纹(23)。
2.根据权利要求1所述的用于表面增强拉曼散射光谱分析的多孔微量反应板，其特征在于，所述微量反应孔(3)的截面为圆形或等边多边形。
3.根据权利要求1所述的用于表面增强拉曼散射光谱分析的多孔微量反应板，其特征在于，所述生物纳米基片(2)为用于表面增强拉曼散射光谱分析的生物纳米基片。
4.根据权利要求1所述的用于表面增强拉曼散射光谱分析的多孔微量反应板，其特征在于，所述生物纳米基片(2)是直接以微量反应孔(3)的孔底表面为界面，有序排布金银纳米颗粒而制成的。
全文摘要
本发明公开了一种用于表面增强拉曼散射光谱分析的多孔微量反应板，以广泛用于酶联免疫反应检测的多孔微量反应板为平台，在其孔底加载拥有粗糙表面特征的金银纳米生物基片，或者直接在孔底表面有序排布金银纳米颗粒而制成纳米基底孔。本发明的反应板不但可以使被检标本的使用微量化，而且可以使多标本的高通量检测在一块板中同步完成，使操作步骤简单方便，工作量大为减轻，将能改变目前将单块基片粘入单块反应盒中对单份标本进行单独操作的局面，有利于SERS检测技术的实际应用。
文档编号G01N21/65GK102998297SQ201210532340
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者沈传来, 邱腾 申请人:东南大学