专利名称：改良的噬菌粒表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和抗体工程等领域。更具体地，涉及一种改良的用于噬菌体展示法筛选单链抗体中的噬菌粒表达载体。
背景技术：
抗体作为疾病预防、诊断和治疗的制剂已有上百年的发展历史。早期制备抗体的方法是将某种天然抗原经各种途径免疫动物，成熟的B细胞克隆受到抗原刺激后，将抗体分泌到血清和体液中。
实际上血清中的抗体是多种单克隆抗体的混合物，因此称之为多克隆抗体。多克隆抗体是人类有目的利用抗体第一步。多克隆抗体的不均一性，限制了对抗体结构和功能的进一步研究和应用。
杂交瘤技术的诞生被认为是抗体工程发展的第一次质的飞跃，也是现代生物技术发展的一个里程碑。利用这种技术制备的单克隆抗体在疾病诊断、治疗和科学研究中得到广泛的应用。这种单克隆抗体多是由鼠B细胞与鼠骨髓瘤细胞经细胞融合形成的杂交瘤细胞分泌的，具有鼠源性，进入人体会引起机体的排异反应；完整抗体分子的分子量较大，在体内穿透血管的能力较差；生产成本太高，不适合大规模工业化生产。在80年代初，抗体基因结构和功能的研究成果与重组DNA技术相结合，产生了基因工程抗体技术。
抗体工程技术的发展，即将鼠源单克隆抗体改造为人源化抗体，或者直接产生人源抗体，大大减少鼠源抗体带来的副作用如人抗鼠抗体反应等，有利于临床应用。目前，人源化或人源抗体的产生主要采用三种方法(1)鼠源抗体改造用人类抗体的Fc段和部分Fab替换鼠源抗体片段，减少小鼠来源的片段，以减轻人类对抗体的不良反应；(2)转基因方法将人类抗体基因转移至小鼠，免疫动物后产生人类抗体；(3)噬菌体展示技术是近年发展的新方法，利用噬菌体的特性筛选抗体可以直接筛选人源抗体，该方法利用人抗体基因构建含有VH和VL的组合文库，以噬菌体表面显示系统筛选抗原特异性人源抗体。它以细菌克隆取代了B细胞克隆，被誉为抗体技术的革命性进展。
上述三种方法各有利弊。前二种方法能筛选高亲和力抗体，但费用大，不易操作，第三种方法操作简便、花费少，但亲和力有时较低。
采用噬菌体抗体库技术筛选抗体不必进行动物免疫，易于制备稀有抗原的抗体、筛选全人源性抗体和高亲和力抗体。噬菌体抗体库技术是生命科学研究的突破性进展之一，同时也将抗体工程的研究推想了一个新的高潮。
噬菌体选择方法对于抗体或短肽的分离都不受限制，而且适用于其它具有生物活性的分子的研究，如细胞因子、受体、酶底物、酶抑制剂、抗体酶、DNA结合蛋白、构建具有特异性结合分子的受体域、以及纤维素结合域等。据报道，抗体的支架不同可形成用于各种类型分子的合适的结合配体，而且许多例子可说明，宿主支架可容纳许多有效的可调节一些合适的置换的区域，(可根据这点制备局部变化的库)，这些支架包括β-折叠蛋白、α-螺旋束蛋白、这两个蛋白的组合、以及绿色荧光蛋白(GFP)和纤维素结合域等。
目前常用于构建人源噬菌体展示单链抗体文库所用的噬菌粒表达载体为pHEN-2。然而，该载体在使用过程中常常会有相当比例的人免疫球蛋白的轻链基因编码产物因为种种未知因素而无法有效地插入单链抗体库。
因此，本领域迫切需要开发能够更有效地用于构建人源噬菌体展示单链抗体文库的新的噬菌粒表达载体。

发明内容
本发明的目的就是提供一种能够更有效地用于构建人源噬菌体展示单链抗体文库的新的噬菌粒表达载体。
在本发明的第一方面，提供了一种噬菌粒表达载体，它是改良的pHEN2载体，其中pHEN2中多酶切位点中的ApaL1酶切位点被去除或被BssH II酶切位点置换。
在另一优选例中，pHEN2中多酶切位点中的ApaL1酶切位点被BssH II酶切位点置换。其中，所述的ApaL1酶切位点是GTGCAC，所述的BssH II酶切位点是GCGCGC。
在另一优选例中，所述表达载体的多酶切位点的序列如SEQ ID NO1所示。
在本发明的第二方面，提供了一种本发明上述改良的pHEN2的噬菌粒表达载体的用途，它被用于通过噬菌体展示法筛选单链抗体。


图1显示了噬菌粒表达载体pHEN2多酶切位点图谱。
图2显示了将ApaL1酶切位点用BssH II酶切位点置换的示意图。
具体实施例方式
本发明人经过研究发现，pHEN-2噬菌粒载体在使用过程中常常会有相当比例的人免疫球蛋白的轻链基因编码产物无法有效地插入单链抗体库的一个主要原因是存在ApaL1酶切位点。通过消除ApaL1酶切位点，就可显著提高人免疫球蛋白的轻链基因编码产物插入单链抗体库的效率。
根据对已知免疫球蛋白可变区基因序列的统计结果，本发明人发现部分轻链可变区VL中存在限制性酶切位点ApaL I，该位点在群体中的出现频率4/162＝6.45％(表1)。
表1 被切割的功能片段数目

统计发现，而ApaL I又是有些人偏爱使用的一种酶。如果轻链文库的克隆过程中使用ApaL I酶便会不可避免的破坏部分VL基因序列的完整性，从而导致部分RT-PCR人免疫球蛋白轻链基因编码产物无法插入单链抗体库，使终库容有所下降。
一种对pHEN-2噬菌粒载体进行改造的方法是消除ApaL I酶。
在另一优选例中，对pHEN-2噬菌粒载体进行改造的方法是用限制性酶切位点BssH II替换ApaL I酶的酶切位点。本发明人对现有的用于构建噬菌体展示单链抗体文库的噬菌粒表达载体pHEN-2进行改造，利用第三位密码子的摆动性，在保证编码氨基酸不发生改变的前提下，通过PCR引物引入两个碱基的定点突变，从而将限制性酶切位点ApaL I更改为在免疫球蛋白数据库中未见出现的限制性酶切位点BssH II(图2)，从而进一步优化了轻链文库的克隆及鉴定条件，从而尽可能保证了所构建的单链抗体文库的多样性，提高了实际库容量。
可用于本发明的定点突变技术是本领域中很常规的一种技术，有许多文献对定点突变技术有描述。
本发明的主要优点在于，能够使更多的人免疫球蛋白的轻链基因编码产物有效地插入单链抗体库，从而尽可能保证了所构建的单链抗体文库的多样性，提高了实际库容量。本发明人成功地利用此改造质粒构建了滴度为109的非免疫人源单链抗体文库。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1对pHEN-2的酶切位点的改造噬菌粒表达载体pHEN2是本领域一种常用的噬菌粒表达载体(购自英国剑桥大学MRC中心)，其多酶切位点图谱如图1和SEQ ID NO1所示。
试验方法合成以下引物ForwardGCTGCAGGTCGACCTCGAGTG(SEQ ID NO3)
ReverseATCGAGCTCCTGCAGTTGGACCTGCGCGCTACCGCCAGAGCCACCTC(SEQ ID NO4)以pHEN2为模板，用以下方法将pHEN-2酶切位点改造为BssH II酶切位点。
利用上述引物进行PCR，将所获得的PCR产物及pHEN2质粒分别用限制性内切酶Sac I和Nco I进行酶切，将两者连接转化后，抽提质粒，经DNA测序验证原pHEN2质粒中的Apa I位点已改造成为BssH II位点。
结果通过定点突变的方法，获得了pHEN-2的酶切位点(GTGCAC)改造为BssH II酶切位点(GCGCGC)的改良的噬菌粒表达载体，其中酶切位点的改造对编码的氨基酸序列无影响。改造的多酶切位点的序列如SEQ ID NO2所示。
实施例2构建人源单链抗体文库用常规方法合成了五十多条可用于扩增人抗体重链和轻链可变区的PCR引物，提取了四个人胎肝和胎脾以及一份人骨髓细胞和15个健康成人的外周血淋巴细胞的mRNA；采用RT-PCR方法，分别以针对免疫球蛋白不同家族的引物，从中扩增抗体重链和轻链可变区基因；先后克隆入改造的噬菌粒表达载体中，经数百次电转化，构建了人源单链抗体文库，其中分别采用pHEN-2(对照)和实施例1中制备的改良的pHEN-2。然后，梯度稀释噬菌体抗体库并感染对数生长期的E.coli TG1菌液，涂LB氨苄平板，37℃过夜，利用菌落记数法测定文库的滴度。
结果表明，用改造的pHEN-2质粒构建的非免疫人源单链抗体文库的滴度为109，而对照(未改造的pHEN-2)是5×106。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海人类基因组研究中心<120>改良的噬菌粒表达载体<130>036339<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>369<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>pHEN-2的多酶切位点<400>1ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagct tgcatgcaaa ttctatttca 60aggagacagt cataatgaaa tacctattgc ctacggcagc cgctggattg ttattactcg120cggcccagcc ggccatggcc caggtgcagc tgcaggtcga cctcgagtgg tggaggcggt180tcaggcggag gtggctctgg cggtagtgca caggtccaac tgcaggagct cgatatcaaa240cgggcggccg cacatcatca tcaccatcac ggggccgcag aacaaaaact catctcagaa300gaggatctga atggggccgc atagactgtt gaaagttgtt tagcaaaacc tcatacagaa360aattcattt369<210>2<211>369<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>4atcgagctcc tgcagttgga cctgcgcgct accgccagag ccacctc 4权利要求
1.一种噬菌粒表达载体，其特征在于，它是改良的pHEN2载体，其中pHEN2中多酶切位点中的ApaL1酶切位点被去除或被BssH II酶切位点置换。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，pHEN2中多酶切位点中的ApaL1酶切位点被BssH II酶切位点置换，其中所述的ApaL1酶切位点是GTGCAC，所述的BssH II酶切位点是GCGCGC。
3.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的多酶切位点的序列如SEQ ID NO1所示。
4.如权利要求1所述的噬菌粒表达载体的用途，其特征在于，用于通过噬菌体展示法筛选单链抗体。
全文摘要
本发明公开了一种改良的用于噬菌体展示法筛选单链抗体中的噬菌粒表达载体，它是改良的pHEN2载体，其中pHEN2中多酶切位点中的ApaL1酶切位点被去除或被BssH II酶切位点置换。改良的pHEN2噬菌粒表达能够使更多的人免疫球蛋白的轻链基因编码产物有效地插入单链抗体库，从而尽可能保证了所构建的单链抗体文库的多样性，提高了库容量。
文档编号G01N33/577GK1618974SQ200310108759
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月21日 优先权日2003年11月21日
发明者张新, 韩泽广 申请人:上海人类基因组研究中心