专利名称：：一种纳米微球免疫比浊法检测β₂-微球蛋白试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于测定血清成份的试剂盒，特别是测定血清中的02-微球蛋白(02-MG)的试剂盒，可广泛应用在医学及生物化学
技术领域：
。
背景技术：
：日2-微球蛋白(@2-MG)是一种低分子量(11800)的蛋白质，最先在肾小管性肾炎的病人尿中分离邛2_MG存在于几乎所有有核细胞表面，是人类白细胞抗原(HLA)分子轻链的组成部分。作为HLA代谢和分解的产物，02-MG以低浓度的游离形式出现在血清、尿液和其他体液中。游离h-MG通过肾小球滤过肾小管重吸收排出和降解。因为02-MG每天在体内生成率较为恒定，且只被肾脏排泄，测定血02-MG可作为肾小球滤过率的指标。已知测定-微球蛋白(02-MG)的方法有免疫扩散法、免疫电泳法、放射免疫分析法、酶联免疫法(ELISA法)。这些方法存在着操作繁琐，需要特殊的设备，样本需要预处理，不能进行批量样本分析和不能直接上全自动生化分析仪检测等缺点。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服上述
背景技术：
的不足，提供一种02-微球蛋白检测试剂的改进，所提供的试剂应具有样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好，适用于各种类型的全自动生化分析仪的纳米微球免疫比浊法检测32-微球蛋白试剂盒。本发明提供的技术方案是一种纳米微球免疫比浊法检测02-微球蛋白试剂盒，包括试剂礼、试剂R2以及参考校准品；其中a、试剂礼一种使样本中微球蛋白抗原位点充分暴露，有利于与抗日2-微球蛋白抗体试剂充分结合的微球蛋白溶液，包括5-200mmol/L缓冲液、0.l-5mmol/L防腐剂、0.5-5mmol/L的稳定剂、50-200mmol/L电解质、0.l-4mmol/L表面活性剂，其余为纯化水；b、试剂R2—种结合有抗人02-微球蛋白抗体的纳米微球溶液，包括5-200mmol/L缓冲液、0.-5%重量比的结合有抗人02-微球蛋白抗体的纳米微球、适量的防腐剂，纳米微球直径为50-150nm；c、参考校准品一种用来与样本比较，进行结果计算的02-微球蛋白溶液，包括缓冲液100-200mmol/L，稳定剂166-180mmol/，适量防腐剂以及根据浓度需要确定的一定量的重组人32-微球蛋白纯品，其余为纯化水。将重组人32-微球蛋白纯品加入上述溶液中，获得所需浓度的h-MG参考校准品(该02-微球蛋白参考校准品为添加重组人32-微球蛋白纯品的人血清或其它类似血清基质的液体)。02-MG参考校准品的浓度可以是高浓度单点参考校准品，在使用时用生理盐水稀释成多个不同浓度的参考校准品；也可以直接制备成多个不同浓度的参考校准品。这里没有特别的限制，只要制得的02-MG参考校准品能够与样本比较，能够测定样本中02-MG的含量即可。所述微球蛋白试剂R1中还加入反应加速剂，浓度为3-lOmmol/L。所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白以及氯化钠中的一种或多种的混口o所述缓冲液是三羟甲基氨基甲烷或CAPS0。所述防腐剂是广谱杀菌剂。所述结合有抗人02-微球蛋白抗体的纳米微球溶液的制备方法是用缓冲液在室温下稀释重量比例为11的抗人02-MG抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混勻后室温振荡吸附2小时(即常规的物理吸附法)，加入含0.1%BSA的缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入适量防腐剂。抗人02-MG抗体多克隆抗体包括羊抗抗人02-MG抗体多克隆抗体或兔抗抗人32-MG抗体多克隆抗体或鼠抗抗人02-MG抗体多克隆抗体。本发明所需主要原料1、羊抗人02_微球蛋白多克隆抗体；可外购或委托浙江伊利康生物技术研发中心按常规方法制备，该抗体仅与人02"微球蛋白反应，与其它抗原无免疫交叉反应，效价能够满足本试剂要求。2、纳米微球；市场上有许多商品化的纳米微球可供选择，包括美国Sigma公司、德国默克公司、日本UNF公司；可选择多种直径的纳米微球，本发明采用了直径为80120nm的微球，相应的试剂检测主波长为600nm。3、重组02-微球蛋白纯品；可外购，或由浙江伊利康生物技术研发中心制备，用于制备本试剂所需参考校准品。其余生化原料均可外购。本发明测定样本的原理是利用抗原抗体反应，先加入试剂R1(样本稀释液)，解除样本中抗原周围的电子层和水化层，使抗原位点充分暴露；然后加入试剂&(抗人02-MG抗体的纳米微球溶液)，使h-MG抗体的纳米微球与样本中相应的h-MG抗原反应，形成不溶性的抗原-抗体复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的h-MG含量成正比；在规定波长下测定该不溶性抗原_抗体复合物的吸光度值，与已知浓度的02-MG参考校准品进行比较，则可计算出样本中02-MG的含量。试剂R2中纳米微球与抗人02-微球蛋白抗体的结合可以采用物理吸附法或化学交联法制备，优选物理吸附法。本发明提供的试剂为液体双试剂，具有特异性好，灵敏度高，准确性好及抗干扰能力强等优点，而且测定时操作简单、样本不用预稀释，可用于检测体液中日2-微球蛋白的浓度，适用于临床全自动生化分析仪。图1为采用本发明实施例1进行测定所得02-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的02-MG测得值的相互关系示意图。图2为采用本发明实施例2进行测定所得02-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的02-MG测得值的相互关系示意图。图3为采用本发明实施例3进行测定所得02-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的02_MG测得值的相互关系示意图。具体实施例方式02-MG检测试剂的制备实施例实施例一1、32_MG溶液(试剂队)三羟甲基氨基甲烷缓冲液吐温-20(表面活性剂)NaCL(电解质)PEG-6000(反应加速剂)广谱杀菌剂(防腐剂)乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)其余为纯化水2、抗人02-MG抗体溶液(试剂R2)用lOOmmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.4)在室温下稀释羊抗人02_MG抗体多克隆抗体和80nm纳米微球(抗体和微球的重量比例为11)，将两者混勻后室温振荡吸附2小时(即本领域技术人员已公知的物理吸附法)，加入封闭液(含0.1%BSA三羟甲基氨基四烷缓冲液)封闭1小时，离心去上清，用lOOmmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入适量的防腐剂；即获得日2-微球蛋白检测试剂盒试剂(R2)。3、血清型32-MG溶液(参考校准品)CAPS0(缓冲液)广谱杀菌剂(防腐剂)乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)牛血清白蛋白(稳定剂)氯化钠(稳定剂)其余为纯化水按照所需要的02-MG参考校准品浓度将相应量的重组02-MG纯品40mg/L加入上述溶液中，制备得40mg/L浓度的02-MG参考校准品。采用本实施例对样本进行测定，所得02-MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的h-MG测得值进行比较(参见图1，并进行回归分析)；获知相关性r=0.9995(y=1.007x+0.0236)；显示出本实施例与放射免疫分析法具有良好的相关性。实施例二1、32_MG溶液(试剂队)三羟甲基氨基甲烷(缓冲液)吐温-20(表面活性剂)NaCL(电解质)PEG-6000(反应促进剂)广谱杀菌剂(防腐剂)50mmol/L0.5mmol/LlOOmmol/L4mmol/L3mmol/L5mmol/LlOOmmol/L2mmol/L2mmol/L3mmol/L166mmol/L150mmol/L4mmol/L60mmol/L8mmol/L0.lmmol/L乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)0.5mmol/L其余为纯化水2、抗人β2-MG抗体溶液(试剂R2)用150mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.4)在室温下稀释羊抗人β2_MG抗体多克隆抗体和IOOnm纳米微球(抗体和微球的重量比例为11)，将两者混勻后室温振荡吸附2小时(即本领域技术人员已公知的物理吸附法)，加入含0.1%BSA的三羟甲基氨基四烷缓冲液封闭1小时，离心去上清，用lOOmmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为4%，并加入适量的防腐剂；即获得β2-微球蛋白检测试剂盒试剂(R2)。3、血清型β2-MG溶液(参考校准品)CAPSO(缓冲液)150mmol/L广谱杀菌剂(防腐剂)5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)3mmol/L牛血清白蛋白(稳定剂)3mmol/L氯化钠(稳定剂)166mmol/L其余为纯化水按照所需要的β2-MG参考校准品浓度将相应量的重组β2-MG纯品60mg/L加入上述溶液中，制备得60mg/L浓度的β2-MG参考校准品。采用本实施例对样本进行测定，所得i32_MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的P2-MG测得值进行比较(参见图2，并进行回归分析)；获知相关性r=0.9985(y=1.0264X+0.0149)；显示出本实施例与放射免疫分析法具有良好的相关性。实施例三1、^2-MG溶液(试剂R1)三羟甲基氨基甲烷缓冲液200mmol/L吐温-20(表面活性剂)2mmol/LNaCL(电解质)200mmol/LPEG-6000(反应促进剂)5mmol/L广谱杀菌剂(防腐剂)3mmol/L乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)2mmol/L其余为纯化水2、抗人β2-MG抗体溶液(试剂R2)用200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.4)在室温下稀释羊抗人β2_MG抗体多克隆抗体和120nm纳米微球(抗体和微球的重量比例为11)，将两者混勻后室温振荡吸附2小时(即本领域技术人员已公知的物理吸附法)，加入含0.1%BSA的三羟甲基氨基四烷缓冲液封闭1小时，离心去上清，用lOOmmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至浓度为2%，并加入适量的防腐剂；即获得β2-微球蛋白检测试剂盒试剂(R2)。3、血清型β2-MG溶液(参考校准品)CAPSO(缓冲液)200mmol/L广谱杀菌剂(防腐剂)2mmol/L乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)0.5mmol/L牛血清白蛋白(稳定剂)5mmol/L氯化钠(稳定剂)166mmol/L其余为纯化水按照所需要的β2-MG参考校准品浓度将相应量的重组β2-MG纯品80mg/L加入上述缓冲液中，制备得80mg/L浓度的β2-MG参考校准品。采用本实施例对样本进行测定，所得i32_MG的测定值与通过放射免疫分析法所得的P2-MG测得值进行比较(参见图3，并进行回归分析)；获知相关性r=0.9992(y=1.0062X+0.0285)；显示出本实施例与放射免疫分析法具有良好的相关性。本发明的测定条件及步骤<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>结果的计算式中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>ΔAT待测样品平均每分钟吸光度变化值ΔAS校准液平均每分钟吸光度变化值CS校准液中β2-MG的浓度尚需补充的是本文中凡未特别标明的比例均为重量比。权利要求一种纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒，包括试剂R1、试剂R2以及参考校准品；其中a、试剂R1一种使样本中β2-微球蛋白抗原位点充分暴露，有利于与抗β2-微球蛋白抗体试剂充分结合的β2-微球蛋白溶液，包括5-200mmol/L缓冲液、0.1-5mmol/L防腐剂、0.5-5mmol/L的稳定剂、50-200mmol/L电解质、0.1-4mmol/L表面活性剂，其余为纯化水；b、试剂R2一种结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球溶液，包括5-200mmol/L缓冲液、0.1％-5％重量比的结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球、适量的防腐剂，纳米微球直径为50-150nm；c、参考校准品一种用来与样本比较，进行结果计算的β2-微球蛋白溶液，包括缓冲液100-200mmol/L，稳定剂166-180mmol/，适量防腐剂2mmol/L以及根据浓度需要确定的一定量的重组人β2-微球蛋白纯品，其余为纯化水。2.根据权利要求1所述的一种纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒，其特征在于所述β2_微球蛋白试剂Rl中还加入反应加速剂，浓度为3-lOmmol/L。3.根据权利要求1或2所述的一种纳米微球免疫比浊法检测β2_微球蛋白试剂盒，其特征在于所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白以及氯化钠中的一种或多种的混I=IO4.根据权利要求1或2所述的一种纳米微球免疫比浊法检测β2_微球蛋白试剂盒，其特征在于所述缓冲液是三羟甲基氨基甲烷或CAPSO。5.权利要求1所述的一种纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒，其特征在于所述结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球溶液的制备方法是用缓冲液在室温下稀释重量比例为11的抗人P2-MG抗体多克隆抗体和纳米微球，将两者混勻后室温振荡吸附2小时，加入含0.BSA的缓冲液封闭1小时，离心去上清，再用缓冲液稀释至浓度为0.3%，并加入适量防腐剂。全文摘要本发明涉及一种测定血清中的β2-微球蛋白的试剂盒。所要解决的技术问题是克服上述
背景技术：
的不足，提供一种样本无需稀释、操作简单、准确度高、重复性好，适用于各种类型的全自动生化分析仪的纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒。技术方案是一种纳米微球免疫比浊法检测β2-微球蛋白试剂盒，包括；a、试剂R1缓冲液、防腐剂、稳定剂、电解质、表面活性剂，其余为纯化水；b、试剂R2缓冲液、结合有抗人β2-微球蛋白抗体的纳米微球、防腐剂，纳米微球直径为50-150nm；c、参考校准品缓冲液，稳定剂，防腐剂以及根据浓度需要确定的一定量的重组人β2-微球蛋白纯品，其余为纯化水。文档编号G01N21/31GK101813700SQ201010139410公开日2010年8月25日申请日期2010年3月31日优先权日2010年3月31日发明者王贤理,蒙凯,蔡其浩申请人:浙江伊利康生物技术有限公司