专利名称：水果可溶性糖快速测定方法
技术领域：
本发明涉及一种糖类的定性定量测定方法。
背景技术：
水果可溶性固形物指能溶于水的糖、酸、维生素、矿物质等。利用折射仪可以大致估计可溶性固形物含量，但是糖组分即不同糖的组成比例无法通过该方法检测出，而糖组成比例是种植者和科研人员共同关心的问题，因其直接关系到水果的食用品质及商品品质。果实可溶性糖主要为己糖和双糖，提取方法一直沿用有机溶剂法利用甲醇/氯仿提取果实中的糖，然后用萃取法去除氯仿，用旋转蒸发仪使甲醇挥发，定容后用再将提取液中的色素等杂质去除。虽然这种方法分离到的糖溶液中杂质较少，纯度较高，适用于高效液相色谱即HPLC分析，但是该方法步骤繁多，不仅试验耗时耗力，最终的试验数据重复间变异度也较大，试验效率及精确度均不高。利用HPLC测定糖组分是近年来一直沿用的方法，不同糖及不同仪器检出限有一定差异。HPLC已在医学、化学等领域广泛应用，但是在利用HPLC·测定糖时耗时较长，通常单个样品的测定时间约需20分钟，I小时一般至多只能测3个样品；而且需要使用乙腈、甲醇等有毒有害试剂作流动相，对操作人员会造成潜在健康威胁。质谱法是将样品离子化，变为气态离子混合物，并按质荷比即m/z分离的分析技术，现已广泛用于蛋白质、核酸、糖结构等的分析。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种水果可溶性糖快速测定方法。解决上述技术问题采用如下技术方案，本水果可溶性糖快速测定方法按如下步骤进行(I)样品可溶性糖的提取用不锈钢小样品勺挖取少量待测水果的果肉，放入试管中，每个样品准确称取50 150mg，记录所取样品名及其重量；用移液枪吸取500 IOOOyL纯净水加入到试管中，用试管研磨棒将样品迅速充分匀浆，然后将装有匀浆液的试管置于微波炉中，低火加热10 40s至其沸腾即停止加热；或用水浴锅100°C加热5 IOmin使糖代谢酶完全失活；试管稍冷却后涡旋混匀，5000rpm常温离心3 5min，将上清液即含有可溶性糖的溶液移入新试管中，用移液枪取上清液时尽量避免碰到沉淀物；在离心后的沉淀物中加入500 1000 μ L纯净水,涡旋、离心后移取上清液至新试管,如此重复2 3次以充分提取样品中的糖；合并所有上清液；样品经糖代谢酶灭活处理后相对稳定，若提取多个样品，可先将样品逐一处理完成后再进行批量离心及提取等工作；(2)样品提取物预处理步骤(I)提取的液体中若含有少量固体物质，则先用滤纸过滤，无固体物质就直接用固相萃取柱吸附技术进行去除果实中花青素、叶黄素诸杂质的预处理；不同水果成分差异较大，需进行预备实验以确定最佳吸附条件；(3)高纯度的标准溶液制备准确称取单糖、双糖、三糖标样各I. 00g，用纯水定容至50mL，摇匀得20mg/mL的糖标准母液；再用纯水将糖标准母液分别稀释成2. 00,4. 00，6. 00,8. 00，10. OOmg/mL的系列糖标准溶液，分装于各试管中；(4)用电喷雾质谱即ESI-MS进行提取物的纯净度检测=ESI-MS检测条件为负极电喷雾状态，正离子扫描，扫描范围为100 2000质量/电荷比，进样流速为20iiL/min ;若检测到杂质较多，则需要将样品用固相萃取柱进行再次或多次过柱去杂；(5)样品的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱即MALDI-TOFMS检测将标准样品和经过预处理的样品提取物分别与上样基质即matrix各I y L等量混合，点样于靶板即Target Plate上，室温下自然结晶后开启MALDI-TOF MS进行质谱扫描，扫描范围为100 2000质量/电荷比，读取并记录峰面积；(6)糖标准曲线制作根据一系列糖标准样品的质谱扫描结果以标准工作液的浓 度为横坐标、峰面积为纵坐标，制作糖标准曲线，用于样品中糖含量的定量分析；(7)样品糖的定性和定量分析将样品提取物质谱扫描结果与标准品质谱扫描结果进行比对，确定样品中的糖成分，实现定性分析；根据标准品测定结果制作的标准曲线和样品质谱扫描结果对样品中的糖进行定量分析。本发明的有益效果是对水果中的己糖、双糖、三糖等可溶性糖进行定性、定量检测，步骤少，灵敏度高，样品消耗少，重复性好。本方法不仅可以利用极少量样品检测成熟水果中的糖组分及含量，同时也可以用于水果发育过程中糖的动态监测。


图I蔗糖的电喷雾质谱图。图2单糖的电喷雾质谱图。图3单糖和蔗糖的飞行时间质谱图。图4香蕉果实提取物的电喷雾质谱图(实例)。图5蔗糖标准曲线。
具体实施例方式本发明下面结合实施例并参照附图作进一步详述(I)样品可溶性糖的提取用不锈钢小样品勺挖取少量待测水果的果肉，放入试管中，每个样品称取约50 lOOmg，记录所取样品名及其重量；用移液枪吸取500 1000 y L纯净水加入到试管中，用试管研磨棒将样品迅速充分匀浆，然后将装有匀浆液的试管置于微波炉中，低火加热10 40s至其沸腾即停止加热；或用水浴锅100°C加热5 IOmin使糖代谢酶完全失活；试管稍冷却后涡旋混匀，5000rpm常温离心3 5min，将上清液即含有可溶性糖的溶液移入新试管中，用移液枪取上清液时尽量避免碰到沉淀物；在离心后的沉淀物中加入500 1000 ii L纯净水，涡旋、离心后移取上清液至新试管,如此重复2 3次以充分提取样品中的糖；合并所有上清液；样品经糖代谢酶灭活处理后相对稳定，若提取多个样品，可先将样品逐一处理完成后再进行批量离心及提取等工作；(2)样品提取物预处理步骤(I)提取的液体中若含有少量固体物质，则先用滤纸过滤，无固体物质就直接用固相萃取柱吸附技术进行去除果实中花青素、叶黄素诸杂质的预处理；不同水果成分差异较大，需进行预备实验以确定最佳吸附条件；(3)高纯度的标准溶液制备准确称取单糖、双糖、三糖标样各I. 00g，用纯水定容至50mL，摇匀得20mg/mL的糖标准母液；再用纯水将糖标准母液分别稀释成2. 00,4. 00，6. 00,8. 00，10. 00mg/mL的系列糖标准溶液，分装于各试管中；(4)用电喷雾质谱即ESI-MS进行提取物的纯净度检测ESI_MS检测条件为负极电喷雾状态，正离子扫描，扫描范围为100 2000质量/电荷比，进样流速为20iiL/min ;若检测到杂质较多，则需要将样品用固相萃取柱进行再次或多次过柱去杂；(5)样品的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱即MALDI-TOFMS检测将标准样品和经过预处理的样品提取物分别与上样基质即matrix各I y L等量混合，点样于靶板即Target Plate上，室温下自然结晶后开启MALDI-TOF MS进行质谱扫描，扫描范围为100 2000质量/电荷比，读取并记录峰面积；(6)糖标准曲线制作根据一系列糖标准样品的质谱扫描结果以标准工作液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，制作糖标准曲线，用于样品中糖含量的定量分析；
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(7)样品糖的定性和定量分析将样品提取物质谱扫描结果与标准品质谱扫描结果进行比对，确定样品中的糖成分，实现定性分析；根据标准品测定结果制作的标准曲线和样品质谱扫描结果对样品中的糖进行定量分析。参见图1，该蔗糖样品电喷雾质谱图中显示了蔗糖与钾离子相结合，在电喷雾质谱图中为单峰，信噪比即S/N较高，检测效果较好。图2显示了己糖与钠离子相结合，在电喷雾质谱图中为单峰，信噪比即S/N较高，检测效果较好。图3显示了己糖和蔗糖样品的飞行时间质谱图，在质谱扫描结果中可见己糖和蔗糖表现为各自的独立峰，区分效果较好。图4显示了香蕉果实提取物的电喷雾质谱扫描结果，在质谱扫描结果中可见香蕉果实中的己糖、双糖、三糖分离效果较好，杂峰少。图5显示了以标准工作液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制的标准曲线。需要说明的是不同仪器、不同上样板及不同批次样品间差别较大，每批样品均需单独绘制标准曲线。利用简便快捷的热水-微波法提取了苹果、草莓、枇杷、葡萄、猕猴桃、香蕉果实中的可溶性糖，利用ESI-MS联合MALDI-TOF MS分析了这些果实中的单糖、多糖组成及动态变化。结果表明，ESI-MS联合MALDI-TOF MS可以检测到样品中微量多种糖含量，灵敏度极高，样品消耗少，本方法还可用于果实发育过程中的糖动态监测。下表为上述六种水果提取物质谱扫描结果
权利要求
1.一种水果可溶性糖快速測定方法，其特征是按如下步骤进行 (1)样品可溶性糖的提取用不锈钢小样品勺挖取少量待测水果的果肉，放入试管中，每个样品准确称取50 150mg，记录所取样品名及其重量；用移液枪吸取500 1000 y L纯水加入到试管中，用试管研磨棒将样品迅速充分匀浆，然后将装有匀浆液的试管置于微波炉中，低火加热10 40s至其沸腾即停止加热；或用水浴锅100°C加热5 IOmin使糖代谢酶完全失活；试管稍冷却后涡旋混匀，5000rpm常温离心3 5min，将上清液即含有可溶性糖的溶液移入新试管中，用移液枪取上清液时尽量避免碰到沉淀物；在离心后的沉淀物中加入500 1000 u L纯水,涡旋、离心后移取上清液至新试管,如此重复2 3次以充分提取样品中的糖；合并所有上清液； (2)样品提取物预处理步骤(I)提取的液体中若含有少量固体物质，则先用滤纸过滤，无固体物质就直接用固相萃取柱吸附技术进行去除果实中花青素、叶黄素诸杂质的预处理； (3)高纯度的标准溶液制备准确称取单糖、双糖、三糖标样各l.OOg，用纯水定容至50mL，摇匀得20mg/mL的糖标准母液；再用纯水将糖标准母液分别稀释成2. 00，4. 00，6. 00，.8.00，10. 00mg/mL的系列糖标准溶液，分装于各试管中； (4)用电喷雾质谱即ESI-MS进行提取物的纯净度检测=ESI-MS检测条件为负极电喷雾状态，正离子扫描，扫描范围为100 2000质量/电荷比，进样流速为20iiL/min ;若检测到杂质较多，则需要将样品用固相萃取柱进行再次或多次过柱去杂； (5)样品的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱即MALDI-TOFMS检测将标准样品和经过预处理的样品提取物分别与上样基质即matrix各I y L等量混合，点样于靶板即Target Plate上，室温下自然结晶后开启MALDI-TOF MS进行质谱扫描，扫描范围为100 2000质量/电荷比，读取并记录峰面积； (6)糖标准曲线制作根据一系列糖标准样品的质谱扫描结果以标准工作液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，制作糖标准曲线，用于样品中糖含量的定量分析； (7)样品糖的定性和定量分析将样品提取物质谱扫描结果与标准品质谱扫描结果进行比对，确定样品中的糖成分，实现定性分析；根据标准品測定结果制作的标准曲线和样品质谱扫描结果对样品中的糖进行定量分析。
全文摘要
一种可溶性糖快速测定方法，按如下七个步骤进行一是样品可溶性糖提取，用水果50～150mg果肉，加入500～1000μL纯水研磨成匀浆，加热杀灭糖代谢酶活性，离心后取上清液。二是样品提取物预处理，用固相萃取柱吸附去除果实中的花青素和叶黄素等杂质。三是高纯度标准溶液的制备，称取单糖、双糖、三糖标样，制成不同浓度系列糖标准溶液。四是用ESI-MS进行提取物纯净度测定，必要时需再次去杂。五是MALDI-TOF检测，进行质谱扫描，读取并记录峰面积。六是糖标准曲线制作，用于糖定量分析。七是样品糖定性定量分析。采用本方法测定水果可溶性糖的组分与含量，步骤少、灵敏、快速，还可用于水果发育过程中糖动态监测。
文档编号G01N27/64GK102788834SQ20121031222
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月29日 优先权日2012年8月29日
发明者杨兴, 秦巧平 申请人:浙江农林大学