专利名称：棉花花粉管游离钙离子的荧光标记方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域中花粉管游离钙离子的荧光标记方法，属于生物技术领域。
背景技术：
细胞内的游离钙离子是细胞感受刺激的第二信使，它的浓度可以响应外界环境刺 激而迅速变化，进而引起钙离子下游的靶蛋白如CaM(钙调素)、CDPK (CaM依赖的蛋白激酶) 等活性的变化，调节细胞内许多生理生化反应，从而转导细胞感受的胞外刺激，以适应环 境。花粉的萌发与花粉管的伸长生长是一个复杂的生理生化反应过程，该体系已被越来越 多地用作研究细胞生长的分子调控机理，近年来的许多研究结果证明细胞内的游离钙离子 参与了这一过程。在此过程中，[Ca2+Ji的时空变化表现了复杂多样的调控作用，因而[Ca2+] i的测定显得极为重要。目前荧光测定植物细胞[&2+]/变化的方法虽然已经有很多成功报道，但由于植物 细胞具有细胞壁、叶绿体和大液泡，当把应用于动物细胞的荧光指示剂应用于植物细胞时， 在引入荧光指示剂问题上遇到极大的局限。显微注射法对细胞伤害较大，且对仪器要求较 高；近年来虽然有报道用低PH渗透法把荧光指示剂引入植物细胞中，但低pH同样对细胞造 成一定程度的伤害，且负载成功率低。植物细胞的细胞壁中还存在着非特异性酯酶，会迅速 将酯化型探针分解为离子型，使之很难进入细胞，如果细胞内染料过少，则不能在细胞内钙 离子发生变化时显示出相应的荧光强度变化，将会影响测定的准确性。已广泛使用的游离Ca2+荧光指示剂有游离酸和乙酰甲基(acetoxy methyl, AM) 酯化两种形式。游离酸形式的指示剂不能透过细胞膜却能与Ca2+结合，并在与Ca2+结合时 荧光峰值发生变化。AM酯化形式的Ca2+指示剂能通过细胞膜进入细胞浆内，而不能与Ca2+ 结合。当活细胞与AM形式指示剂孵育时，因为酯类物质具有较高的亲脂性，可以穿透细胞 膜进人胞浆，而后又能被细胞内特定的酯酶水解成游离酸形式，而这些游离酸形式的指示 剂可与细胞内游离钙结合形成复合物，使这些染料的荧光光谱发生量的变化，且因为荧光 染料与钙解离容易，随着游离钙的增加或减少，其荧光强度随之变化。所以经洗涤，去除细 胞外染料和校正细胞的自动荧光后，负载有染料的细胞的荧光强度可反映细胞内钙离子浓 度。但植物细胞的细胞壁中存在着非特异性酯酶，会迅速将酯化型探针分解为离子型，使之 很难进入细胞，如果细胞内染料过少，则不能在细胞内钙离子发生变化时显示出相应的荧 光强度变化，将会影响测定的准确性。为了消除细胞壁对装载的影响，多数试验中人们都采 用原生质体作材料以解决这一问题。但以原生质体为材料不能真实反映植物细胞的变化， 且制备有活性的原生质体的要求苛刻。迄今为止，由于实验材料自身的局限性和检测方法 的局限性，对陆地棉花粉管中游离钙离子进行标记的有效方法和技术还未见报道。本方法 探索了用4°C低温孵育装载的方法将荧光探针F1UO-3AM导入棉花花粉管中，使花粉管细胞 壁酯酶保持较低的活性，保证有足够数量的Fluo-3进入细胞内，以便更准确地反映细胞内 游离钙离子的变化。
本方法操作步骤简单；荧光探针易导入细胞，为非损伤性测量法；荧光图像分析 技术可提供细胞内钙离子分布的二维或三维图像，可实时显示，空间分辨率优于其他方法； 试验效果稳定、清晰，因此无论是在科研、检测以及学生试验中都能得到很好的应用。

发明内容
技术问题本发明的目的在于提供一种较快速、有效的的棉花花粉管游离钙离子的 荧光标记方法。技术方案一种棉花花粉管游离钙离子的荧光标记方法，包括以下步骤1)载玻片打孔将25. 5X76. 2mm，lmm-1. 2mm厚的载玻片中间用电钻打出直径为Icm的圆孔，其中 将孔一边用盖玻片封住，形成小室，粘附剂为指甲油； 2)荧光探针F1UO-3AM的溶解50μ g 的 Fluo-3AM，用 44ml 含有质量比 20% surfactant pluoronic F-127 的无 水二甲亚砜溶解，配制成lmmol/L的母液；3)培养花粉管晴天上午收集刚开放花朵上的花粉，使其充分混合；每Iml培养液中加入5mg花粉 粒将花粉和培养液混合；培养液质量比成分0. 01%硼酸+0. 03%四水硝酸钙+0. 02%七水 硫酸镁+15%聚乙二醇8000+20%蔗糖，pH6. 2，装入离心管内，使花粉粒充分混入培养液， 28°C光照培养l_2h ；4)低温孵育法装载荧光探针F1UO-3AM取IyL Flu0-3AM母液，加入到50yL培养过的花粉悬浮液中，振荡混勻至 Fluo-3AM终浓度为20 μ mmol/L,置于4°C冰箱中低温孵育l_2h，然后用原培养基低速离心 洗涤3次，以去除未装载进细胞内的F1UO-3AM，最后在温度25°C静置l_2h，使已进入细胞内 的F1UO-3AM在胞内酯酶的作用下充分水解为能与游离钙离子结合的离子形态；5)激光共聚焦显微镜观察将装载有荧光探针F1UO-3AM的陆地棉花粉细胞悬浮液滴加在载玻片上的小池 中，上面盖盖玻片。将载玻片放在配备50mV氩激光器的Zeiss LSM Leica TCS-SP2型激 光共聚焦显微镜的载物台上，以Kr/Ar激光为激发光源，激发波长488nm，发射波长522nm， Nikon物镜20 X /0. 5，Nikon目镜10 X /25，调节焦距选取视野内一个完整的花粉管，调节微 调直至花粉管图像清晰，通过计算机控制扫描和数据采集系统Timecourse，对该层面上钙 离子荧光强度和分布随时间的变化情况进行观察，图像采集采用256X256像素，循环次数 为73次，间隔5s，共计6min，采集的图象和数据记录于计算机中。6)图像处理储存于计算机中的图象文件，用与共聚焦激光扫描显微镜配套的Laser Pix分析 软件Version 4. 0对所获得的Timecourse扫描图进行分析分别圈定一个顶端0_30 μ m的 花粉管顶端区域A，顶端> 30 μ m的近顶端区域B和背景区C，经此软件读出花粉管顶端A， 近顶端B和背景区C的钙离子荧光强度相对值，此荧光强度相对值的变化反映花粉管内游 离Ca2+的浓度变化；用Excel软件导出此花粉管顶端和近顶端选定区域的相对荧光强度的变化值，以时间为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，即可作图，此花粉管顶端和近顶端选定 区域的荧光强度值即代表相应区域游离Ca2+的浓度相对值。上述的方法中所述棉花为陆地棉。有益效果
本发明提供了一种对棉花花粉管游离钙离子进行荧光标记的方法。本发明的标记 方法具有以下优点1)简单，快速省略了植物细胞常规标记方法需要先制备原生质体的步骤；2)采用酯化形式的荧光探针F1UO-3AM，易导入花粉管细胞；3)Fluo-3AM用可见光(488nm)激发，减少了需紫外光激发时对活细胞造成的损 伤；4)Fluo-3AM与Ca2+亲和力低，易于解离，因而提高了时间分辨率；5)荧光图像分析技术可实时显示花粉管内钙离子的动态分布，空间分辨率优于其 他方法。6)标记效果好，可在激光共聚焦扫描显微镜下清晰观测到花粉管呈现明亮的绿色 荧光。花粉管内的钙离子分布不均勻，在顶端(0-30μπι)钙离子水平较高，该区域内又以 靠近花粉管壁的区域钙离子浓度最高(0-10 μ m)，近顶端区域的钙离子浓度相对较低(> 30 μ m)。这种现象反映了花粉管内钙离子分布的极性现象，钙离子浓度高的区域进行着旺 盛的代谢反应，决定了花粉管的极性生长的顺利。研究的方法和结果为开展与棉花受精有 关的生殖生物学研究提供了新的途径和依据。本发明建立了利用激光共聚焦显微技术研究棉花花粉管Ca2+浓度变化的方法，操 作简单，标记效果好，将在棉花花粉管生长以及受精生殖研究中发挥重要作用，有重要的实 际应用价值。通过检测花粉管内钙离子分布对测定棉花的生殖发育能力提供方法。
四

图1棉花花粉管内游离钙离子的分布图激光共聚焦扫描显微镜下清晰观测到花粉管呈现明亮的绿色荧光，花粉管内的钙 离子分布不均勻，在顶端(Α:0-30μπι)钙离子水平较高，该区域内又以靠近花粉管壁的区 域钙离子浓度最高(0-10 μ m)，近顶端区域(B :> 30μπι)的钙离子浓度相对较低，Bar = 10 μ m ；图210keV氮离子处理的棉花花粉管内游离钙离子的分布320keV氮离子处理的棉花花粉管内游离钙离子的分布430keV氮离子处理的棉花花粉管内游离钙离子的分布版下侧的色柱是本图版所采用伪彩的色阶标尺，标尺旁的数字为该颜色所代表 的花粉管内游离钙离子的相对荧光强度值。A-花粉管顶端；B-花粉管近顶端；C-背景
五具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分含量如无特别说明 均为质量百分含量。实施例1、氮离子注入苏棉22花粉对其萌发花粉管内钙离子浓度的影响
首先用本发明的方法对氮离子注入苏棉22 (生产用种)花粉后对其萌发花粉管的游离Ca2+进行荧光标记，包括以下步骤1)氮离子注入离子束注入机是中国科学院等离子体物理研究所自制的LCD-1000多功能离子注 入机，离子源是氮离子。每年8月的晴天下午16:30左右，采摘第二天将要开放的花蕾，室温摊于桌上。第 二天上午9:00左右，将开放花朵雄蕊上的花粉混合后均勻地撒在直径为9cm的玻璃培养 皿中(避免个体植株和花药不同引起的花粉生活力差异)，再将培养皿放入注入机的靶室 中进行N+离子束注入，注入方式为垂直注入，靶室真空度为2. 0 X IO-2Pa,选定注入剂量为 0. 78X1016N+/cm2，注入能量分别为 10keV、20keV、30keV。2)载玻片打孔将载玻片(25. 5X76. 2mm，厚lmm-l· 2mm)中间用电钻打出直径为Icm的圆孔，其中 孔的一边用将盖玻片封住，粘附剂为指甲油，室温静置至指甲油风干，盖玻片与载玻片粘在 一起成一小室，备用；3)配制花粉管液体培养基分别称取0. Olg硼酸、0. 03g四水硝酸钙、0. 02g七水硫酸镁、15g聚乙二醇8000和
20g蔗糖，用去离子水溶解后调pH至6. 2，再定容至100ml。3)荧光探针Fluo-3AM的溶解50μ g 的Fluo-3AM (Moleculor Probe 产品)，用 44ml 的无水二甲亚砜(含有 20% 的surfactant pluoronic F-127)溶解，配制成lmmol/L的母液，放置于_20°C冰箱保存。4)花粉管培养将对照自然花粉和氮离子注入后的花粉分别和培养液混合(每Iml加入5mg的花 粉)，装入离心管内，用镊子将花粉在离心管壁上轻轻摩擦，使花粉粒充分混入培养液，280C 光照培养1. 5h。培养液质量比成分0. 01%硼酸+0. 03%四水硝酸钙+0. 02%七水硫酸镁 +15 %聚乙二醇8000+20 %蔗糖，pH6. 2，装入离心管内，使花粉粒充分混入培养液，28°C光照 培养l_2h ；5)低温孵育法装载荧光探针F1UO-3AM取IyL Flu0-3AM母液，加入到50yL培养过的花粉悬浮液中，振荡混勻至 Fluo-3AM终浓度为20 μ mol/L,置于4°C冰箱中低温孵育1. 5h，然后用原培养基低速离心洗 涤3次，以去除未装载进细胞内的F1UO-3AM，最后在温度25°C静置1. 5h，使已进入细胞内的 F1UO-3AM在胞内酯酶的作用下充分水解为能与游离钙离子结合的离子形态，每次染色至少 重复3次。6)激光共聚焦显微镜观察将装载有荧光探针F1UO-3AM的陆地棉花粉细胞悬浮液滴加在载玻片上的小池 中，上面盖盖玻片。将载玻片放在配备50mV氩激光器的Zeiss LSM Leica TCS-SP2型激 光共聚焦显微镜的载物台上，以Kr/Ar激光为激发光源，激发波长488nm，发射波长522nm， Nikon物镜20X/0. 5,Nikon目镜10X/25，调节焦距选取视野内一个完整的花粉管，调节微 调直至花粉管图像清晰，通过计算机控制扫描和数据采集系统Timecourse，对该层面上钙 离子荧光强度和分布随时间的变化情况进行观察，图像采集采用256X256像素，循环次数为73次，间隔5s，共计6min，采集的图象和数据记录于计算机中。7)图像处理储存于计算机中的图象文件，用与共聚焦激光扫描显微镜配套的Laser Pix分析 软件Version 4. 0对所获得的Timecourse扫描图进行分析分别圈定一个顶端0_30 y m的 花粉管顶端区域A，顶端> 30 y m的近顶端区域B和背景区C，经此软件再读出花粉管顶端 A，近顶端B和背景区C的钙离子荧光强度相对值，此荧光强度相对值的变化反映花粉管内 游离Ca2+的浓度变化；用Excel软件导出此花粉管顶端和近顶端选定区域的相对荧光强度 的变化值，以时间为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，即可作图，此花粉管顶端和近顶端选 定区域的荧光强度值即代表相应区域游离Ca2+的浓度相对值。8)结果和意义激光共聚焦扫描显微镜下清晰观测到对照花粉管呈现明亮的绿色荧光(图1)。花 粉管内的钙离子分布不均勻，在顶端钙离子浓度较高(A:0-30i!m)，该区域内又以靠近花 粉管壁的区域钙离子浓度最高(0-10 ym)，近顶端区域(> 30i!m)的钙离子浓度相对较低 (图1坐标图)。与对照相比，三种能量的氮离子处理后的花粉粒萌发后，花粉管内的钙离 子浓度受到不同程度的破坏。lOkeV的氮离子处理后的花粉管内Ca2+依然具有极性分布的 现象，但整体荧光是减弱的(图2)。20keV和30keV的氮离子处理后的Ca2+分布于花粉管 中，但极性分布现象消失(图3和图4)。花粉萌发和花粉管生长是植物有性生殖的重要生理过程。花粉管生长的开始与持 续是一个极性生长的建立与维持过程。这种极性生长过程受花粉管中Ca2+的极性分布所控 制，正常生长的花粉管中从顶端到基部存在着有高到低的Ca2+浓度梯度。花粉管的Ca2+梯 度对花粉管的生长至关重要。这种Ca2+梯度的存在有利于控制高尔基体小泡的定向分泌、 运转与融合，从而使合成花粉管壁和质膜的物质源源不断地运到花粉管顶端形成新的管壁 和质膜，使其顶端的极性生长得以进行。破坏这种Ca2+梯度即导致花粉管生长的异常和停 滞。本试验结果证实了花粉管内钙离子分布的极性现象，钙离子浓度高的区域进行着旺盛 的代谢反应，决定了花粉管的极性生长的顺利。三种能量的氮离子处理后的花粉萌发的花 粉管中的Ca2+浓度受到不同程度的破坏，相应地对花粉内部超微结构、活力、萌发花粉管的 微丝骨架系统均有一定的影响，被破坏程度与注入能量有关，注入能量越高，被破坏程度越 大。花粉内部结构破坏程度愈大，花粉的活力越弱，花粉萌发长出的花粉管的长度越短，花 粉管内微丝骨架系统变化越剧烈，花粉管Ca2+极性分布的消失。花粉管的极性生长受到抑 制，棉花的受精作用不能完成。因此，研究的方法和结果为开展与棉花受精有关的生殖生物 学研究，以及研究植物细胞的结构与功能之间的关系提供了新的途径和依据。通过检测花 粉管内钙离子分布对测定棉花的生殖发育能力提供方法。
权利要求
一种棉花花粉管游离钙离子的荧光标记方法，包括以下步骤1)载玻片打孔将25.5×76.2mm，1mm-1.2mm厚的载玻片中间用电钻打出直径为1cm的圆孔，其中将孔一边用盖玻片封住，形成小室，粘附剂为指甲油；2)荧光探针Fluo-3AM的溶解50μg的Fluo-3AM，用44ml含有质量比20％surfactant pluoronic F-127的无水二甲亚砜溶解，配制成1mmol/L的母液；3)培养花粉管晴天上午收集刚开放花朵上的花粉，使其充分混合；每1ml培养液中加入5mg花粉粒将花粉和培养液混合；培养液质量比成分0.01％硼酸+0.03％四水硝酸钙+0.02％七水硫酸镁+15％聚乙二醇8000+20％蔗糖，pH6.2，装入离心管内，使花粉粒充分混入培养液，28℃光照培养1-2h；4)低温孵育法装载荧光探针Fluo-3AM取1μL Fluo-3AM母液，加入到50μL培养过的花粉悬浮液中，振荡混匀至Fluo-3AM终浓度为20μmmol/L，置于4℃冰箱中低温孵育1-2h，然后用原培养基低速离心洗涤3次，以去除未装载进细胞内的Fluo-3AM，最后在温度25℃静置1-2h，使已进入细胞内的Fluo-3AM在胞内酯酶的作用下充分水解为能与游离钙离子结合的离子形态；5)激光共聚焦显微镜观察将装载有荧光探针Fluo-3AM的陆地棉花粉细胞悬浮液滴加在载玻片上的小池中，上面盖盖玻片；将载玻片放在配备50mV氩激光器的Zeiss LSM Leica TCS-SP2型激光共聚焦显微镜的载物台上，以Kr/Ar激光为激发光源，激发波长488nm，发射波长522nm，Nikon物镜20×/0.5，Nikon目镜10×/25，调节焦距选取视野内一个完整的花粉管，再调节微调直至花粉管图像清晰，通过计算机控制扫描和数据采集系统Timecourse，对该层面上钙离子荧光强度和分布随时间的变化情况进行观察，图像采集采用256×256像素，循环次数为73次，间隔5s，共计6min，采集的图象和数据记录于计算机中；6)图像处理储存于计算机中的图象文件，用与共聚焦激光扫描显微镜配套的Laser Pix分析软件Version 4.0对所获得的Timecourse扫描图进行分析分别圈定一个顶端0-30μm的花粉管顶端区域A，顶端＞30μm的近顶端区域B和背景区C，经此软件读出花粉管顶端A，近顶端B和背景区C的钙离子荧光强度相对值，此荧光强度相对值的变化反映花粉管内游离Ca2+的浓度变化；用Excel软件导出此花粉管顶端和近顶端选定区域的相对荧光强度的变化值，以时间为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，即可作图，此花粉管顶端和近顶端选定区域的荧光强度值即代表相应区域游离Ca2+的浓度相对值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述棉花为陆地棉。
全文摘要
本发明是棉花花粉管游离钙离子的荧光标记方法，属于生物技术领域。将载玻片打孔做成培养花粉管的小室；将花粉在小室中培养，萌发出花粉管；低温孵育法将Fluo-3AM载入培养好的花粉管中；激光共聚焦扫描显微下观察花粉管的Ca2+动态变化。本发明建立了利用激光共聚焦显微技术研究棉花花粉管Ca2+浓度变化的方法，操作简单，标记效果好，将在棉花花粉管生长以及受精生殖研究中发挥重要作用，有重要的实际应用价值。
文档编号G01N1/28GK101806736SQ20101014483
公开日2010年8月18日 申请日期2010年4月13日 优先权日2010年4月13日
发明者唐灿明, 岳洁瑜 申请人:南京农业大学