专利名称：梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂，尤其是 涉及一种采用胶体金免疫层析技术(immunochromatography)进行的梅毒特异性IgM抗体 与特异性总抗体联合检测试剂条及其制备方法。
背景技术：
梅毒(Syphilis)是一种由梅毒螺旋体(Tr印onema pallidum, TP)引起的性传播 性疾病，其病原体是梅毒螺旋体，属螺旋体科。梅毒螺旋体主要通过性接触、输血、创口或 者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液，播散全身，使机体几乎 所有的组织及器官受累，临床表现为全身性，可分为不同临床阶段，包括一期、二期、三期和 潜伏期。世界卫生组织(WHO)曾乐观地预言“由于有高敏度检测方法和高效的治疗方案， 梅毒是一种能够通过公共卫生措施得到成功控制的性传播性疾病”。遗憾的是，至今梅毒 依然是世界范围的公共卫生问题，缺乏有效的行政控制措施，每年全球大约有1200万的患 #，胃中 60 力■^女gii#。 ( :He￡ilth Protection Agency Centre for Infections. International Encyclopediaof Public Health-Syphi1 is[M]. London, UK :Health Protection Agency Centre，2008，289-297)事实上，梅毒的感染现状可能要比想象中的更 让人悲观。调查发现，梅毒感染者已经较广泛地存在于普通人群中。梅毒螺旋体尚不能进行体外培养，梅毒诊断与流行病学调查主要依赖于血清学试 验，包括特异性抗体和反应素检测两大类型。梅毒特异性抗体IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG) 抗体分别于2周和4周后产生，即使患者经过足够治疗，其仍能长期存在，甚至终身不消失 (参见:Luis J F, Felipe U S, Santa G C, et al. Evaluation of a rapid strip and a particle agglutinationtests for syphilis diagnosis[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2007，59 :123_126)；而另一种抗体物质反应素产生较晚，一般 在受感染后5 7周产生(参见林月圆.TPPA和TRUST在梅毒诊断中的价值与临床相关 问题[J].放射免疫学杂志，2009，22 (3) :295-297.)，而且晚期梅毒、梅毒治疗后期以及潜 伏梅毒可能阴性。因此梅毒特异性抗体的阳性率、敏感性显著高于反应素。TP-IgM是梅 毒感染后，机体最先出现的特异性抗体。只要有活的梅毒螺旋体存在，其TP-IgM将会维持
胃白勺TfC。 Martina H ^ ( #JAL :Martina H, Daan W N, Mart Μ, et al. Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19S fluorescenttreponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis [J]. DiagnosticMicrobiology and Infectious Disease, 2007, 59 :61_66.)认为 TP-IgM 是 梅毒早期感染并活动的一项血清学标志，李步荣等(参见李步荣，贺军涛，张毅，等.梅 毒螺旋体IgM抗体检测的临床意义[J],第四军医大学学报，2007,28(16) :1495_1497) 认为TP-IgM与TP-DNA —样，代表着梅毒传染性指标。在排除近期抗梅毒治疗的前提下， TP-IgM若不转阴，提示体内可能残存梅毒螺旋体或治疗不彻底。TP-IgM阴转者随访时再转阳性，表明再次感染梅毒(参见Rawstron SA, Mehta S, Bromberg K, et al. Evaluation of a Treponema pallidum2specific IgMenzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in the diagnosisofmaternal and congenital syphilis [J], Sex Transm Dis，2004，31 (2) : 123-126)。尽管 TP-IgM 阴性不能完全排除传 染性，但TP-IgM阳性必定提示该患者具有传染性。早期的血清学方法使用完整梅毒螺旋体作为抗原，研究和诊断用的TP是以TP感 染兔睾丸获得，这种方法花费大、获得的TP量少、不纯(混有宿主蛋白)，与其他病原体存 在交叉反应，因此假阳性也时有发生。随着分子生物学技术的普及及梅毒螺旋体抗原的相 继克隆，将重组抗原应用于梅毒实验已经越来越多。目前研究比较多的TP抗原有TPW7、 TPN47、TPNl5, TPN44. 5、TPN36、TP0453、TP0684 及 TPr 家族。采用重组 DNA 技术制备的重 组抗原可以克服完整TP抗原的缺点，能快速、经济地制备无限量特异重组TP抗原。梅毒特 异性抗体检测是梅毒确证试验，包括TPHA，TPPA, ELISA，FTA-ABS及Western-blot等，其特 异性均较高。然而，面对严峻的防制形式，不但需要特异准确的检测手段，还需要一种更简 便快捷的试剂来筛查，以便为临床和疾病防控提供对策。
发明内容本实用新型的目的是提供一种梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试 剂条。本实用新型设有第1试剂条和第2试剂条；第1试剂条设有第1载体板、第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝酸纤维膜(NC膜)、 梅毒特异性IgM抗体检测线、第1对照线和第1吸收垫；第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝 酸纤维膜和第1吸收垫依次粘贴在第1载体板上表面，第1加样垫的一端设在第1胶体金 垫的一端上，第1胶体金垫的另一端设在第1硝酸纤维膜的一端上，第1吸收垫的一端设在 第1硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和第1对照线依次设在第1硝酸 纤维膜上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在 第1对照线处包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47的IgG抗体。第2试剂条设有第2载体板、第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维膜(NC膜)、 特异性总抗体检测线、第2对照线和第2吸收垫；第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维 膜和第2吸收垫依次粘贴在第2载体板上表面，第2加样垫的一端设在第2胶体金垫的一 端上，第2胶体金垫的另一端设在第2硝酸纤维膜的一端上，第2吸收垫的一端设在第2硝 酸纤维膜的另一端上，特异性总抗体检测线和第2对照线依次设在第2硝酸纤维膜上；在特 异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原ΤΡΝ17和/或梅毒特异性 抗原ΤΡΝ47，在第2对照线处包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和TPN47IgG抗体。第1试剂条的第1加样垫与第2试剂条的第2加样垫之间可用玻璃纤维膜连接， 再放入试剂盒中(称单孔加样)，也可以不经玻璃纤维膜连接或搭桥(称双孔加样)。所述第1载体板和第2载体板可采用PVC板。以下给出本实用新型的制备方法，包括以下步骤1)制备梅毒重组抗原TPm7、TPN47采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒重组抗原TPN17和TPN47 ；2)硝酸纤维素膜的点样在梅毒特异性IgM抗体检测线上包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在特 异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原ΤΡΝ17和/或梅毒特异性 抗原ΤΡΝ47，晾干，所述抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原ΤΡΝ17和/或梅毒特异性抗原 ΤΡΝ47的浓度可为1 4mg/mL，抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的浓度可为1 4mg/ mL,羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47IgG抗体由抗TPm7_IgG抗体与抗TPN47_IgG抗体按体积 比1 1混合，其终浓度为1 4mg/mL;三者点样量为lyL/cm;3)制备胶体金采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取氯金酸ImL加入到IOOmL去离 子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01%，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热 搅拌下加入柠檬酸三钠水溶液2. OmL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于 棕色瓶中4°C冰箱保存备用，所述柠檬酸三钠的浓度可为2% ；4)胶体金与TPm7、TPN47的标记胶体金与梅毒特异性抗原TPW7的标记取胶体金10mL，用0. lmol/L NaOH调至 ρΗ5· 4，加 100 μ g TPNl7,混勻，放置 5min,加入 5% BSA ImL 混勻，4°C、10000r/min 离心 lh, 弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10mL，4°C、10000r/min离心lh，弃上清，沉淀用TBS稀 释至lmL，得胶体金标记的TPN17抗原。胶体金与梅毒特异性抗原TPN47的标记同上操作，得胶体金标记的TPN47抗原；将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合后，均勻地涂于玻璃 纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫；所述将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合，最好胶体金标 记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原以体积比1 (0. 2 5)混合；所述烘干的温 度可为37°C ；5)制备免疫层析检测条第1试剂条设有第1载体板、第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝酸纤维膜(NC膜)、 梅毒特异性IgM抗体检测线、第1对照线和第1吸收垫；第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝 酸纤维膜和第1吸收垫依次粘贴在第1载体板上表面，第1加样垫的一端设在第1胶体金 垫的一端上，第1胶体金垫的另一端设在第1硝酸纤维膜的一端上，第1吸收垫的一端设在 第1硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和第1对照线依次设在第1硝酸 纤维膜上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在 第1对照线处包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47的IgG抗体，用切条机切成条状，得梅毒特 异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条的第1试剂条；将第2试剂条设有第2载体板、第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维膜(NC 膜)、特异性总抗体检测线、第2对照线和第2吸收垫；第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝 酸纤维膜和第2吸收垫依次粘贴在第2载体板上表面，第2加样垫的一端设在第2胶体金 垫的一端上，第2胶体金垫的另一端设在第2硝酸纤维膜的一端上，第2吸收垫的一端设在 第2硝酸纤维膜的另一端上，特异性总抗体检测线和第2对照线依次设在第2硝酸纤维膜 上；在特异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原ΤΡΝ17和/或梅毒特异性抗原TPN47，在第2对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47IgG抗体，用切条机切 成条状，得梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条的第2试剂条。在第1加样垫和第2加样垫上可用连接膜(可采用玻璃纤维膜)将第1试剂条和 第2试剂条连接(称单孔加样)，也可以不经连接膜连接或搭桥(称双孔加样)，可将梅毒 特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条放入盒内，做成检测卡，与干燥剂一起装 入铝箔袋中，机器封口，密封保存。本实用新型提供了一种采用胶体金免疫层析技术建立梅毒特异性IgM抗体与特 异性总抗体联合快速检测试剂，可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性IgM 抗体和特异性总抗体的检测。检测时所需的标本量极小，不需要特殊仪器，肉眼直接判读结 果，且检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠，成本低，应用广泛。

图1为本实用新型实施例的结构组成示意图；A为第1试剂条，B为第2试剂条，1 为连接膜(可采玻璃纤维膜)。图2为本实用新型实施例的组装示意图。在图2中，⑴为单孔加样组装图，(2) 为双孔加样组装图；A为第1试剂条，B为第2试剂条。图3为实验结果模式示意图。在图3中，(1)为使用前的示意图，(2) (4)为无 效试验(产品质量问题)，(5)为梅毒特异性总抗体，IgM抗体阳性，(6)为梅毒特异性总抗 体阳性，IgM抗体阴性；A为第1试剂条，B为第2试剂条；T为检测线，C为对照线。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本实用新型作进一步的说明。参见图1和2，本实用新型实施例设有第1试剂条A和第2试剂条B ；第1试剂条A设有第1载体板Al、第1加样垫A2、第1胶体金垫A3、第1硝酸纤 维膜(NC膜)A4、梅毒特异性IgM抗体检测线A6、第1对照线A7和第1吸收垫A8 ；第1加 样垫A2、第1胶体金垫A3、第1硝酸纤维膜A4和第1吸收垫A8依次粘贴在第1载体板Al 上表面，第1加样垫A2的一端设在第1胶体金垫A3的一端上，第1胶体金垫A3的另一端 设在第1硝酸纤维膜A4的一端上，第1吸收垫A8的一端设在第1硝酸纤维膜A4的另一端 上，梅毒特异性IgM抗体检测线A6和第1对照线A7依次设在第1硝酸纤维膜A4上；在梅 毒特异性IgM抗体检测线A6处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在第1对照线 Α7处包被羊抗梅毒抗原TPNl7和ΤΡΝ47的IgG抗体。第2试剂条B设有第2载体板Bi、第2加样垫Β2、第2胶体金垫Β3、第2硝酸纤维 膜(NC膜)Β4、特异性总抗体检测线Β6、第2对照线Β7和第2吸收垫Β8 ；第2加样垫Β2、第 2胶体金垫Β3、第2硝酸纤维膜Β4和第2吸收垫Β8依次粘贴在第2载体板Bl上表面，第 2加样垫Β2的一端设在第2胶体金垫Β3的一端上，第2胶体金垫Β3的另一端设在第2硝 酸纤维膜Β4的一端上，第2吸收垫Β8的一端设在第2硝酸纤维膜Β4的另一端上，特异性 总抗体检测线Β6和第2对照线Β7依次设在第2硝酸纤维膜Β4上；在特异性总抗体检测线 Β6处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原ΤΡΝ17和/或梅毒特异性抗原ΤΡΝ47，在第 2对照线Β7处包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和TPN47IgG抗体。[0036]第1试剂条A的第1加样垫A2与第2试剂条B的第2加样垫B2之间可用连接膜 (可采用玻璃纤维膜)连接，再放入试剂盒中(称单孔加样)，也可以不经连接膜连接或搭 桥(称双孔加样)。所述第1载体板Al和第2载体板Bl可采用PVC板。以下给出本实用新型实施例的制备方法，包括以下步骤1)制备梅毒重组抗原TPW7、TPN47采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其 表达，得梅毒重组抗原TPN17和TPN47。2)硝酸纤维素膜的点样在梅毒特异性IgM抗体检测线上包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在特 异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原ΤΡΝ17和/或梅毒特异性 抗原ΤΡΝ47，晾干，所述抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原ΤΡΝ17和/或梅毒特异性抗原 ΤΡΝ47的浓度可为1 4mg/mL，抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的浓度可为1 4mg/ mL,羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47IgG抗体由抗TPm7_IgG抗体与抗TPN47_IgG抗体按体积 比1 1混合，其终浓度为1 4mg/mL;三者点样量为lyL/cm。3)制备胶体金采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取1 %氯金酸ImL加入到IOOmL去离 子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01%，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热 搅拌下加入柠檬酸三钠水溶液2. OmL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于 棕色瓶中4°C冰箱保存备用，所述柠檬酸三钠的浓度可为2%。4)胶体金与TPm7、TPN47的标记胶体金与梅毒特异性抗原TPW7的标记取胶体金10mL，用0. lmol/L NaOH调至 ρΗ5· 4，加 100 μ g 丁卩附7，混勻，放置51^11，加入5%85八 ImL 混勻，4°C、10000r/min 离心 lh, 弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10mL，4°C、10000r/min离心lh，弃上清，沉淀用TBS稀 释至lmL，得胶体金标记的TPW7抗原。胶体金与梅毒特异性抗原TPN47的标记同上操作，得胶体金标记的TPN47抗原。将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合后，均勻地涂于玻璃 纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫。所述将胶体金标记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原混合，最好胶体金标 记的TPN17抗原和胶体金标记的TPN47抗原以体积比1 (0. 2 5)混合；所述烘干的温 度可为37°C。5)制备免疫层析检测条第1试剂条设有第1载体板、第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝酸纤维膜(NC膜)、 梅毒特异性IgM抗体检测线、第1对照线和第1吸收垫；第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝 酸纤维膜和第1吸收垫依次粘贴在第1载体板上表面，第1加样垫的一端设在第1胶体金 垫的一端上，第1胶体金垫的另一端设在第1硝酸纤维膜的一端上，第1吸收垫的一端设在 第1硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和第1对照线依次设在第1硝酸 纤维膜上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在 第1对照线处包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47的IgG抗体，用切条机切成条状，得梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条的第1试剂条；将第2试剂条设有第2载体板、第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维膜(NC 膜)、特异性总抗体检测线、第2对照线和第2吸收垫；第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝 酸纤维膜和第2吸收垫依次粘贴在第2载体板上表面，第2加样垫的一端设在第2胶体金 垫的一端上，第2胶体金垫的另一端设在第2硝酸纤维膜的一端上，第2吸收垫的一端设在 第2硝酸纤维膜的另一端上，特异性总抗体检测线和第2对照线依次设在第2硝酸纤维膜 上；在特异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原TPN17和/或梅毒 特异性抗原TPN47，在第2对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47IgG抗体，用切条机切 成条状，得梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条的第2试剂条。再用连接膜(可采用玻璃纤维膜)在第1加样垫和第2加样垫处将第1试剂条和 第2试剂条连接(称单孔加样)，也可以不经连接膜连接或搭桥(称双孔加样)，可将梅毒 特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条放入盒内，做成检测卡，与干燥剂一起装 入铝箔袋中，机器封口，密封保存。以下给出免疫层析法检测患者的临床标本取稀释待检标本(全血、血清、血浆、脑脊液)120 μ L，加样于免疫层析检测条样 品处(单孔加样)，静置20min观察结果；或各取稀释待检标本(全血、血清、血浆、脑脊 液)60yL，加样于梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条样品处(双孔加 样)，静置20min观察结果。只在两条梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条 对照区各有一紫红色条带出现，则判为阴性；在两梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联 合检测试剂条的检测区T及对照区C均有一紫红色条带出现，则判为阳性；加样检测后，检 测区和对照区均不出现紫红色条带，为无效结果(见图3)。其中，待检标本(全血、血清、血 浆、脑脊液)稀释液采用生理盐水，稀释倍数0 50倍。以下给出梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条性能检定1)外观检查白色包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，无切 斜现象。2)阳性标本符合率用TP-IgM和梅毒特异性总抗体的不同滴度的阳性参比血清 各50份采用梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条检定，计算阳性符合率。 梅毒特异性总抗体的阳性参比血清采用采用TPPA(日本富士株式会社)法确定，TP-IgM抗 体的阳性参比血清采用采用FTA-ABS(德国欧蒙公司)法确定。3)阴性标本符合率用50份阴性参比血清检定，计算阳性符合率。梅毒特异性总 抗体的阴性参比血清的确定采用TPPA(日本富士株式会社)法，TP-IgM抗体的阴性参比血 清采用采用FTA-ABS(德国欧蒙公司)法确定。4)灵敏度检测用卫生部室内质控血清检测，最低检出限度应小于或等于4NCU/ mL，与TPPA(日本富士株式会社)相当。5)批内差异同一批次梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条，用 特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果 阴性。6)批间差异不同批次梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条，用 特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。7)干扰试验检测结果不受标本溶血(η = 50)、脂血(η = 50)和黄疸(η = 50) 的干扰。血清(或血浆)来自本申请人临床标本。8)交叉反应采用梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条，进行系 统性红斑狼疮(η = 30)、类风湿病(η = 30)、免疫性肝炎(η = 30)等自身免疫系统疾病的 检测，未发现交叉反应。自身免疫系统疾病的血清来自本申请人临床确诊患者。9)稳定性检测应用Arrhenius法则，将梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联 合检测试剂条放置37°C 20天后检测，以上各项指标无显著变化，确保成品在室温干燥条件 下保存，有效期为18个月。以下给出具体实施例。实施例1第1试剂条A在硝酸纤维素膜(NC膜)IgM检测线上包被抗人IgM特异性片段μ 链单克隆抗体，第2试剂条B的特异性总抗体检测线上包被抗人Ig单克隆抗体，在对照线 处C包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47抗体，室温晾干，密封室温保存备用。其中，抗人IgM 特异性片段μ链单克隆抗体、抗人Ig单克隆抗体的浓度为lmg/mL，羊抗梅毒抗原(TPN17 和TPN47) IgG抗体由抗TPm7-IgG抗体与抗TPN47_IgG抗体按体积比1 1混合，其终浓 度为lmg/mL ；三者点样量为1 μ L/cm。将已纯化的金标记的梅毒重组抗原TPN17和TPN47以体积比1 1混合后，均勻 地涂于玻璃纤维纸上，在37°C烘干，制备成金胶体垫，密封备用。将固相化的纤维膜与胶体 金结合的玻璃纤维、吸水纸等按一定顺序，通过PVC不干胶底板组合在一起，用切条机切成 一定宽度检测条。再用玻璃纤维纸在加样垫处将第1试剂条和第2试剂条连接。或将第1 试剂条和第2试剂条放入相应规格的塑料盒内，做成检测卡。把梅毒特异性IgM抗体与特异 性总抗体联合检测试剂条或检测试剂盒与干燥剂一起装入铝箔袋中，机器封口，密封保存。取1 10稀释的待检标本血清120 μ L，加样于梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗 体联合检测试剂条加样区，静置20min观察结果。只在梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗 体联合检测试剂条对照区有一紫红色条带出现，则判为阴性；在检测区及对照区均有一紫 红色条带出现，则判为阳性；加样检测后，检测区T和对照区C均不出现紫红色条带，为无效 结果。(参见图3)实施例2与实施例1相似，区别在于金胶体垫、梅毒特异性总抗体检测线仅由TPW7组成， 不含有TPN47。结果判断与实施例1相同。实施例3与实施例1相似，区别在于金胶体垫、梅毒特异性总抗体检测线仅由TPN47组成， 不含有TPm7。结果判断与实施例ι相同。实施例4与实施例1相似，区别在于待检标本为脑脊液标本，结果判断与实施例1相同。实施例4性能验证试验按实施例1的方案制备梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合 快速检测试剂条，然后进行性能验证。[0079]1)外观检查白色包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，梅毒 特异性IgM抗体与特异性总抗体联合快速检测试剂条宽度在3士0. 1mm，无切斜现象。2)阳性标本符合率50份经FTA-ABS (德国欧蒙公司)检测确定的TP-IgM阳性参 比血清，采用梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合快速检测试剂条检出TP-IgM阳性50 份，阳性标本符合率100% ；而50份经梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)(日本 富士株式会社)检测确定的梅毒特异性总抗体阳性参比血清，采用梅毒特异性IgM抗体与 特异性总抗体联合快速检测试剂条检出梅毒特异性抗体49份，阳性标本符合率98%。3)阴性标本符合率50份经FTA-ABS (德国欧蒙公司)检测确定的TP-IgM阴性参 比血清，采用梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合快速检测试剂条检出TP-IgM阴性50 份，阴性标本符合率100% ；而50份经梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)(日本 富士株式会社)检测确定的梅毒特异性总抗体阴性参比血清，采用梅毒特异性IgM抗体与 特异性总抗体联合快速检测试剂条检出梅毒特异性抗体50份，阴性标本符合率100%。4)灵敏度检测用卫生部室内质控血清(批号200902001)检测，最低检出限度 4NCU/mL。5)批内差异同一批次梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合快速检测试剂 条，用特征性阳性血清(高、中、低血清)检测，相同滴度检测结果显示色带的颜色深浅一 致，阴性血清检测的结果阴性。6)批间差异不同批次梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合快速检测试剂 条，用特征性阳性血清(高、中、低血清)检测，相同滴度检测结果显示色带的颜色深浅一 致，阴性血清检测的结果阴性。7)干扰试验检测结果不受标本溶血(η = 50)、脂血(η = 50)和黄疸(η = 50) 的干扰。8)交叉反应采用梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合快速检测试剂条或检 测盒，进行系统性红斑狼疮(η = 30)、类风湿病(η = 38)、免疫性肝炎(η = 40)等自身免 疫系统疾病的检测，未发现交叉反应。9)稳定性检测将梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合快速检测试剂条放置 370C 20天后检测，以上各项指标无显著变化。
权利要求梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条，其特征在于设有第1试剂条和第2试剂条；第1试剂条设有第1载体板、第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝酸纤维膜、梅毒特异性IgM抗体检测线、第1对照线和第1吸收垫；第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝酸纤维膜和第1吸收垫依次粘贴在第1载体板上表面，第1加样垫的一端设在第1胶体金垫的一端上，第1胶体金垫的另一端设在第1硝酸纤维膜的一端上，第1吸收垫的一端设在第1硝酸纤维膜的另一端上，梅毒特异性IgM抗体检测线和第1对照线依次设在第1硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在第1对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗体；第2试剂条设有第2载体板、第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维膜、特异性总抗体检测线、第2对照线和第2吸收垫；第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维膜和第2吸收垫依次粘贴在第2载体板上表面，第2加样垫的一端设在第2胶体金垫的一端上，第2胶体金垫的另一端设在第2硝酸纤维膜的一端上，第2吸收垫的一端设在第2硝酸纤维膜的另一端上，特异性总抗体检测线和第2对照线依次设在第2硝酸纤维膜上；在特异性总抗体检测线处包被抗人Ig单克隆抗体或梅毒特异性抗原TPN17和/或梅毒特异性抗原TPN47，在第2对照线处包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47IgG抗体。
2.如权利要求1所述的梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条，其特征 在于第1试剂条的第1加样垫与第2试剂条的第2加样垫之间用玻璃纤维膜连接。
3.如权利要求1所述的梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条，其特征 在于所述第1载体板和第2载体板为PVC板。
专利摘要梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂条，涉及一种梅毒特异性IgM抗体与特异性总抗体联合检测试剂。设有2条试剂条，2条试剂条均设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜、对照线和吸收垫；第1、2条试剂条分别设有梅毒特异性IgM抗体检测线和特异性总抗体检测线。制备梅毒重组抗原TPN17、TPN47；硝酸纤维素膜的点样；制备胶体金；胶体金与TPN17、TPN47的标记；制备免疫层析检测条。可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性IgM抗体和特异性总抗体的检测。检测时标本量极小，不需特殊仪器，肉眼直接判读结果，检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠，成本低，应用广泛。
文档编号G01N33/532GK201697920SQ20102019888
公开日2011年1月5日 申请日期2010年5月19日 优先权日2010年5月19日
发明者张忠英, 张长弓, 杨天赐, 林丽蓉 申请人:厦门大学附属中山医院