专利名称：一种检测弓形虫抗体的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术和诊断试剂领域。具体涉及一种弓形虫重组蛋白和合成 肽抗原混合包被检测弓形虫抗体的方法。
背景技术：
弓形虫病又称弓形体病，是一种人兽共患寄生虫病，弓形虫病它的病原体是一种 球虫，弓形虫的整个生活发育过程需要两个宿主，猫科动物，如家猫为终末宿主，但它对中 间宿主的选择极不严格，无论哺乳类动物或鸟类都可以作为其中间宿主。若家中的宠物(如 猫、狗鸟等)感染了弓形虫，或者食用了感染了弓形虫却没有煮熟的食物，就有可能得弓形 虫病，全世界大约有1/3的人感染了弓形虫。正常人感染弓形虫后无明显的临床症状，多 数可能是没有症状的弓形虫携带者，仅少数人会发病。虫体可以侵犯人体的多个脏器和组 织，引起多个器官的严重损害，比如会引起弓形虫脑病、眼病、肾病、肝病、肺病及弓形虫心 肌炎等。另外，弓形虫对妊娠有很重要的影响，被弓形虫感染的孕妇，不论其有无临床症状， 常可以通过母婴垂直传播传给胎儿，从而造成胎儿畸形、神经系统发育障碍、脉络膜视网膜 炎等，严重的可以致胎儿畸形、死亡，也会造成孕妇流产、死产、早产，增加孕妇发生妊娠合 并症的发生几率。感染发生得越早、胎儿受损越严重。感染发生在妊娠头三个月，多会引 起流产、死产或生下无生活能力的和发育有缺陷的婴儿；在妊娠中三个月感染，多会出现死 胎、早产和严重的脑眼疾患；在妊娠晚期，因胎儿已逐渐成熟，此时母体如受到感染，胎儿可 发育正常，亦可出现早产或出生后才出现症状，表现为各系统不同程度的损坏，也有报道， 孕期感染弓形虫的胎儿在出生后数年甚至成人后才出现弓形虫病。近来的研究显示，弓形 虫与不孕不育也有一定的关系。建立弓形虫感染的快速检测方法对育龄妇女进行检测，对 优生优育有重要意义。目前弓形虫病诊断方法主要包括(1)活体组织检查和动物接种，该 法成功率低、耗时长，不适合用于大规模筛查。(2)PCR检测弓形虫基因。该法虽然有较高 的敏感性，但是该法对技术和实验设备要求高，而且容易出现假阳性。(3) ELISA法检测人 血清中弓形虫特异的IgG与IgM，IgG阳性说明患者感染过弓形虫，所以产生了抗体，IgM阳 性说明近期感染了弓形虫。如果是孕妇，最好终止怀孕。ELISA间接法检测人血清中特异的抗弓形虫的IgG与IgM，在目前应用较多。优点 是方便快捷，技术操作简单，对实验设备要求较低，适合大规模检测。但国内至今尚无令人 十分满意的ELISA检测试剂盒。研制高质量的ELISA检测试剂盒，最重要的是选用抗原性 强、特异性好的抗原。我国目前使用的弓形虫抗原多是培养的弓形虫提取物，常混有其它蛋 白产物，所以抗原特异性不强，容易产生假阳性。应用基因工程技术大量制备高纯度重组抗 原是一种比较经济、实用的方法。随着分子生物学技术不断进展，越来越多的弓形虫主要 抗原编码基因相继被克隆。这些基因表达的重组蛋白，表达纯化后可作为抗原包被，用于 ELISA检测。但是要筛选出抗原性好，表达量较高易于纯化的抗原，有一定困难。多肽是一 种与生物体内各种细胞功能都相关的生物活性物质，它的分子结构介于氨基酸和蛋白质之 间，是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的化合物，用合成多肽做为血清检测抗原可以克服基因重组抗原制备复杂、非特异性强及难以纯化的缺点，价廉、安全、 快速且重复性好。国外的研究证实弓形虫的GRA6蛋白和SAGl蛋白具有较强的抗原性，在弓形虫感 染者的血清中抗体检出率较高，但是也有两个缺点，一个是假阳性较高，另外一个就是制备 过程较复杂。大量研究证明SAGl对应的B细胞表位属于空间构象特异性表位，GRA6蛋白 属于线性表位。我们实验室构建了 SAGlC端连接了一段GRA6抗原表位序列的嵌合抗原，但 是ELISA检测显示构建的嵌合抗原没有抗原活性，可能是C端连接的GRA6影响了 SAGl的 空间构象，从而影响了它的抗原性。

发明内容
为了解决现有ELISA检测抗原特异性不强，容易产生假阳性的问题，本发明公开 了一种以重组蛋白和多肽混合做为抗原来检测弓形虫抗体的方法。本发明通过B细胞表位分析软件BioSim分析了弓形虫SAGl蛋白氨基酸序列，筛 选出其可能的抗原性较强的一段蛋白序列，然后PCR方法扩增出包含这部分SAGl序列的基 因片段(45-198aa，135bp-594bp)，表达纯化出重组的SAGl蛋白，做为重组抗原。用B细胞 表位分析软件BioSim分析了 GRA6的蛋白序列，筛选出一个抗原决定簇，用固相合成多肽法 合成包含GRA6抗原决定簇的短肽，然后按一定比例混合做为检测弓形虫病人血清的抗原 来提高检测的灵敏度和特异性。本发明所采用的技术方案是
一种检测弓形虫抗体的方法，是将序列为SEQN0. 1的重组蛋白(弓形虫^蛋白)和序 列为SEQN0. 3的多肽(包含GRA6抗原决定簇的短肽)混合作为抗原进行ELISA检测。具体可以是将纯化的SAGl蛋白以每孔3 μ克和纯化的GRA6多肽以每孔0. 5 μ g 用50mmol/L的PH9. 6碳酸钠稀释成100 μ 1后4°C过夜包被酶联板，间接酶联免疫法检测 血清。上述所说的重组蛋白利用基因工程技术制备。所说的多肽由固相合成多肽法合 成。本发明选用了弓形虫SAGl中抗原性较强的蛋白片段，和GRA6蛋白抗原性较强的 部分序列，分别表达了 SAGl重组蛋白和GRA6抗原多肽，作为混合抗原，这种方法有以下优占.
1、最大化缩短了有较好抗原性的所必需的蛋白长度，增强了检测的特异性，避免了出 现假阳性。2、重组蛋白是可溶性表达的，较容易表达纯化和使用，过程简单；多肽制备和纯化 工艺现已非常成熟，而且成本低廉。3、用作抗原的多肽制备过程简单、非特异性少，而且安全、快速且重复性好。4、将重组蛋白和多肽混合后做抗原最大限度的提高了检测的敏感性，又最大限度 的简化了制备过程，节省了成本。


图1表达SAGl重组蛋白的质粒构建图。
图2表达弓形虫SAGl重组蛋白细菌的SDS-PAGE图对照菌E. coli BL21 (DE3) 不表达重组蛋白，重组菌表达相对分子量为约为18. 4kD的重组蛋白；
M =Marker ；W:表达蛋白细菌菌体；P 表达蛋白细菌裂解后沉淀；S:表达蛋白上清。图3表达弓形虫SAGl重组蛋白纯化后的SDS-PAGE图，M =Marker ；rSAGl 纯化后 蛋白。
具体实施例方式下面结合附图对本发明进行详细说明
实施例一 SAG1重组蛋白的表达与纯化和GRA6多肽的制备
主要试剂HiS-TrapFaStFl0W柱由Phamachia公司产品，其余试剂均为国产或进口分 析纯试剂。1)弓形虫SAG1蛋白和GRA6蛋白抗原表位的筛选
利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析弓形虫SAGl蛋白的全部氨基酸序列 (GeneBank，接通号S73634)和GRA6蛋白的全部氨基酸序列(GeneBank，接通号L33814)， 筛选出SAGl蛋白的包含抗原性的蛋白序列位于第45个氨基酸到198个氨基酸；筛选出 GRA6的强抗原表位位于第55到142个氨基酸。他们的氨基酸序列和DNA序列如下
筛选出的SAGl蛋白的包含抗原性的氨基酸序列(45-198aa)如SEQN0. 1所示；筛选出 的SAGl蛋白的包含抗原性的第45到198个氨基酸的DNA序列如SEQN0. 2所示。筛选出的GRA6的强抗原表第55到142个氨基酸的序列如SEQN0. 3所示。筛选出 的GRA6的强抗原表位第55到142个氨基酸的DNA序列如SEQN0. 4所示。2)在弓形虫SAGl蛋白的DNA序列两侧设计PCR引物，在上游引物 上增加了 Banm酶切位点，在下游引物上增加了 Nde\酶切位点(上游引物 5 -ttcatatggtaatggcgtctgatcc-3 ；下游弓I 物5 -ttggatccttacagggtggagtccgc-3 )， PCR扩增出该片段后，用定向克隆的方法反向接入PET-15b质粒(Clotech公司)，经酶切和 DNA测序证实，重组质粒PET-15b-rSAGl构建正确(见图1)，具体过程委托公司(金思瑞公 司)完成°3)表达SAGl蛋白工程菌的筛选、鉴定
将构建好而且鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)，将转化产物涂布 含氨苄青霉素的50μ g /ml的固体LB培养基上，置37°C培养过夜，次日随机挑选一个转 化子菌落和一个BL21细菌菌落，分别接种到5mlLB培养基(含氨苄青霉素50 μ g每毫升) 和不含氨苄青霉素的试管内，26 °C振荡培养过夜，次日加IPTG至终浓度0. lmmol/L，继续 振荡培养诱导4h，离心收集菌体，将菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解液(PBSPH7. 4、 200mmoINacl)内，冰浴超声破菌lOmin，离心(12000rpm、10min、4 °C )，收集上清。然后取 10 μ 1进行SDS-PAGE检测，可见重组子(图2S泳道)上清中表达分子量为大约18. 4kD的 重组蛋白，蛋白表达量约为21% (见图2)。4)表达重组蛋白的纯化
(1)挑选一个鉴定好的转化子菌落，分别接种到5mlLB培养基(含氨苄青霉素50 μ g 每毫升)内，26°C振荡培养12h，次日再转种到250mlLB培养基(含氨苄青霉素50μ g每毫 升)继续振荡培养2h左右，使细菌密度测0D600值在大约0. 6-0. 8之间，加IPTG至终浓度0. lmmol/L,继续振荡培养诱导4h，离心收集菌体，菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解 液(PBSPH7. 4、200mmolNacl)内，冰浴超声破菌 IOmin,离心(12000rpm、10min、4°C )，收集上清。(2) His-TrapFastFlow 柱纯化蛋白
将His-TrapFastFlow柱连接到蠕动泵，先用平衡液PBSPH7. 4、200mmolNacl冲洗平衡， 然后将上步获得的裂解缓冲液经0.45 μ m滤器过滤后上样，上样流速为lml/min。上样结 束后再用10倍柱床体积平衡液(PBSPH7. 4、200mmolNacl)平衡，流速为1. 5ml/min，最后用 5倍柱床体积洗脱缓冲液(5M咪唑、PBSPH7. 4,200mmolNaclPH8. 0)，每管Iml收集洗脱液，然 后每管取15 μ 1进行SDS-PAGE电泳(见图3)，取含分子量为18. 4kD目的蛋白量较多、较纯 的管，用Bradford法测定蛋白浓度后备用。5)GRA6多肽的合成
委托公司(金思瑞)用固相合成法合成GRA6的55到142个氨基酸，并纯化，使纯度达到 80%以上。取由公司合成并纯化好的GRA6多肽加一定量灭菌水溶解使浓度达到O . 5毫克 每毫升，备用。实施例二 SAG1重组蛋白和GRA6多肽的检测 主要试剂
1)抗弓形虫IgG血清由常州妇幼保健院提供。2)酶联反应材料酶联板为深圳产96孔板，辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人 (H+L)链抗体购自Jackson公司。其它材料为酶联反应的常规材料。ELISA试验采用间接ELISA法检测血清中的IgG抗体。基本步骤为
将抗原用50mmol/L的PH9. 6碳酸钠稀释成100 μ 1后分别包被酶联板，每孔100 μ 1， 4°C过夜。次日用封闭液(lOmmol/L的磷酸盐缓冲液PH7. 4，包含3%BSA)封闭，每孔100 μ 1，37°C，2h。将待测的抗弓形虫IgG阳性、阴性血清用样本稀释液(lOmmol/L的磷酸盐缓 冲液PH7. 4，3%BSA、0. 05%硫硫汞，0. 5mmol/LNaCDl 100稀释后，分别加至封闭后的酶联板 孔内，每孔100 μ 1，每个样本加2孔37°C反应30min，用PBST (lOmmol/L的磷酸盐缓冲液 PH7. 4,0. 5%吐温-20)洗五遍后，加1 :5000稀释的辣根过氧化物酶标记的鼠抗人(H+L)链 抗体，每孔100μ 1，371反应301^11，用？8311洗五遍，加底物11^溶液10(^ 1，37°C避光 显色lOmin，加50 μ 1 4Ν硫酸混勻终止反应，用酶联仪测定Α450值。1、纯化的SAGl蛋白用作抗原来检测弓形虫抗体
将纯化的SAGl蛋白以每孔3 μ 8的浓度用50讓01/1的？!19.6碳酸钠稀释成10(^ 1 后包被酶联板，间接酶联免疫法检测已知的十份抗弓形虫IgG血清及十份正常人血清，结 果(表1)显示纯化的SAGl蛋白能与大部分抗弓形虫IgG血清发生发应，但不能与正常人血 清反应。表1 重组SAGl蛋白ELISA实验结果(Α450)
2、纯化的GRA6多肽用作抗原来检测弓形虫抗体
将纯化的GRA6多肽以每孔0. 5 μ g的浓度用50mmol/L的PH9. 6碳酸钠稀释成100 μ 1后包被酶联板，间接酶联免疫法检测上面十份已测的抗弓形虫IgG血清及正常人血清。 结果(表2)显示GRA6多肽能与少部分抗弓形虫IgG血清发生发应，不能与正常人血清反应。
3、将SAGl蛋白和GRA6多肽混合用作抗原来检测弓形虫抗体
将纯化的SAGl蛋白以每孔3 μ g和纯化的GRA6多肽以每孔0. 5μ g用50mmol/L的 PH9. 6碳酸钠稀释成100 μ 1后包被酶联板，间接酶联免疫法检测上述十份已知的抗弓形 虫IgG血清及正常人血清，结果(表3)显示混合抗原能与抗弓形虫IgG血清发生发应，但不 能与正常人血清反应，混合包被蛋白比只包被一种蛋白或多肽有更高的敏感性。
权利要求
一种检测弓形虫抗体的方法，其特征在于是将序列为SEQ NO.1的蛋白和序列为SEQ NO.3的多肽混合作为抗原进行ELISA检测。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术和诊断试剂领域。具体涉及一种弓形虫重组蛋白和合成肽抗原混合包被检测弓形虫抗体的方法。该方法是将序列为SEQNO.1的蛋白和序列为SEQNO.3的多肽混合作为抗原进行ELISA检测。本发明最大化缩短了有较好抗原性的抗原所必需的蛋白长度，增强了检测的特异性，避免了出现假阳性；将重组蛋白和多肽混合后做抗原提高了检测的敏感性，又最大限度的简化了制备过程，节省了成本。
文档编号G01N33/569GK101865920SQ20101020441
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月21日 优先权日2010年6月21日
发明者曹利民, 杨永刚 申请人:常州二十一世纪生物技术研究所有限公司