专利名称：一种检测地西泮的方法及其专用化学发光免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测地西泮的方法及其专用化学发光免疫试剂盒。
背景技术：
目前动物性食品安全已成为全世界关注的焦点，其中兽药残留问题是影响动物 性食品安全的最主要因素之一，由于动物样本成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取 样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的要求。化学发光免疫分析 (Chemiluminescence analysis,CL1A)技术将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反 应结合起来，具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、不需要十分昂贵的仪器设备 等特点。CLIA不需要外来光源，具有比荧光免疫分析更高的信噪比，比常规的酶联免疫吸附 检测方法的抗背景干扰能力强，其灵敏度比ELISA高1至2个数量级，检测范围可达6个数 量级，自动化程度高，提高了分析方法的精密度，CLIA已经成为一种先进的痕量或超痕量物 质的检测技术。CLIA在兽医学、医学、食品分析等方面将会有更广阔的应用前景。地西泮(Diaz印am，DIA)是一种苯二氮卓类镇静催眠药，兽医主要用于各种动物 镇静、保定、基础麻醉等方面畜牧生产中曾被用作猪抗运输应激及奶牛抗热应激的药物。近 年来，随着畜牧养殖业的迅速发展，一些不法分子在经济利益的驱动下，擅自在畜禽饲养中 添加使用。地西泮在饲料中的滥用，将最终导致畜产品中药物的残留，从而严重影响人们的 身体健康，威胁人们的生命安全。我国农业部2002年4月发布《食品动物禁用的兽药及其 他化合物清单》中，明令禁止将地西泮以抗应激、提高饲料报酬、促进动物生长为目的在食 用动物饲养过程中使用。动物组织中地西泮残留的检测方法主要采用气相色谱法、液相色 谱法、气相色谱_质谱法、液相色谱_联质谱法、酶联免疫法等。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测地西泮的方法及其专用化学发光免疫试剂盒。本发明所提供的检测地西泮的专用化学发光免疫试剂盒，包括地西泮特异性抗 体、包被原和标准品溶液；所述包被原为地西泮半抗原与载体蛋白的偶联物，其结构式如式
U /
hI^式 L
载体蛋白所述试剂盒还包括发光液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标 抗抗体；所述试剂盒由地西泮特异性抗体、包被原、标准品溶液、发光液、浓缩洗涤液、浓缩 复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体组成。所述地西泮特异性抗体为地西泮的多克隆抗体或地西泮的单克隆抗体；
I所示；
4
所述地西泮的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No. 3774的对地西泮的单克隆杂交瘤 细胞株DIA分泌的地西泮单克隆抗体。所述标准品溶液中标准品的浓度为0 μ g/L、0. 1 μ g/L、0. 5 μ g/L、1 μ g/L、10 μ g/L 或100 μ g/L，所述标准品为地西泮；所述发光液由C液和D液组成，发光液C液为过氧化氢；发光液D液为鲁米诺溶液。所述浓缩洗涤液是将0. 05g叠氮化钠和IOOmL浓度为0. 02mol/L、pH为7. 4的磷 酸盐缓冲液混合得到溶液；所述浓缩复溶液是将0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 05mol/L、pH为7. 4的 磷酸盐缓冲液混合得到的溶液；所述包被缓冲液是pH值为9. 6的浓度为0. 03mol/L的碳酸盐缓冲液。所述封闭液是将0. Olg叠氮化钠、IOg牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 03mol/L、 PH值为7. 4磷酸盐溶液混合得到的溶液。所述包被原是按照如下方法制备得到的a、将每60mg地西泮半抗原与ImL二甲基 甲酰胺、IOmg二环己基碳化二亚胺和5mg N-羟基琥珀酰亚胺混合，在25°C下搅拌30min，得 到的产物溶液称为A液；将载体蛋白30mg溶于3mL 0. 13M碳酸氢钠水溶液中，得到的溶液 称为B液；b、将A液加入到B液，25°C搅拌1. 5h，得到所述包被原；所述地西泮半抗原的结构式如式II所示
权利要求
一种检测地西泮的化学发光免疫试剂盒，包括地西泮特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为地西泮半抗原与载体蛋白的偶联物，其结构式如式I所示；式I。FSA00000216154800011.tif
2.根据权利要求1所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括发光 液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体；所述试剂盒由地西泮特异性抗体、包被原、标准品溶液、发光液、浓缩洗涤液、浓缩复溶 液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体组成。
3.根据权利要求1或2所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述地西泮特异性抗体为地西泮的多克隆抗体或地西泮的单克隆抗体；所述地西泮的单克隆抗体为由保藏号为CGMCC No. 3774的对地西泮的单克隆杂交瘤细 胞株DIA分泌的地西泮单克隆抗体。
4.根据权利要求1-3任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述标准品溶液中标准品的浓度为ο μ g/L、0. 1 μ g/L、0. 5 μ g/L、l μ g/LUO μ g/L或 100 μ g/L，所述标准品为地西泮；所述发光液由C液和D液组成，发光液C液为过氧化氢；发光液D液为鲁米诺溶液；所述浓缩洗涤液是将0. 05g叠氮化钠和IOOmL浓度为0. 02M、pH为7. 4的磷酸盐缓冲 液混合得到溶液；所述浓缩复溶液是将0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 05mol/L、pH为7. 4的磷酸 盐缓冲液混合得到的溶液；所述包被缓冲液是PH值为9. 6的浓度为0. 03mol/L的碳酸盐缓冲液。所述封闭液是将0. Olg叠氮化钠、IOg牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 03mol/L、pH值 为7. 4磷酸盐溶液混合得到的溶液。
5.根据权利要求1-4中任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述包被原是按照如下方法制备得到的a、将每60g地西泮半抗原与ImL 二甲基甲酰 胺、IOmg 二环己基碳化二亚胺和5mg N-羟基琥珀酰亚胺混合，在25°C下搅拌30min，得到的 产物溶液称为A液；将载体蛋白30mg溶于3mL 0. 13M碳酸氢钠水溶液中，得到的溶液称为 B液；b、将A液加入到B液，25°C搅拌1. 5h，得到所述包被原；
6.所述地西泮半抗原的结构式如式II所示
7.根据权利要求1-6任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于 所述酶标抗抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；所述载体蛋白为鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，优选为卵清蛋白。
8.一种检测地西泮的方法，包括以下步骤1)样品前处理将每Ig动物组织勻浆与5mL 0. IM氢氧化钠水溶液混勻5min，以3000g的速度离心 lOmin，取上清液；将每ImL所述上清液与IOmL正己烷混合5min，以3000g的速度离心5min， 取正己烷相；将每5mL正己烷相干燥，再用ImL复溶液溶解，再将溶解产物稀释10倍，即为 待测样本溶液；所述动物组织为猪肉或猪肝；所述复溶液为将所述浓缩复溶液用0. 05mol/ L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液稀释10倍得到的；2)利用权利要求1-7中任一所述的检测地西泮的化学发光免疫试剂盒检测步骤1)中 的样本溶液。
9.由保藏号为CGMCCNo. 3774的对地西泮的单克隆杂交瘤细胞株DIA分泌的地西泮单 克隆抗体。
10.保藏号为CGMCCNo. 3774的对地西泮的单克隆杂交瘤细胞株DIA。
全文摘要
本发明公开了一种检测地西泮的方法及其专用化学发光免疫试剂盒。本发明所提供的检测地西泮的专用化学发光免疫试剂盒，包括地西泮特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为地西泮半抗原与载体蛋白的偶联物；本发明的检测方法，具有样品前处理过程简单、操作简便、费用低廉、特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大量样本的筛查。
文档编号G01N33/531GK101936986SQ20101024430
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者史为民, 吴聪明, 张素霞, 曹兴元, 汤树生, 沈建忠, 王战辉, 程林丽 申请人:中国农业大学