专利名称：结合人TNFα的人抗体的制作方法
结合人TNF α的人抗体本申请是申请日为1997年2月10号，申请号为97193635. 8的发明名称为“结合 人TNFa的人抗体”的发明专利申请的分案申请。
背景技术：
肿瘤坏死因子α (TNFa)是由许多细胞类型(包括单核细胞和巨噬细胞)产生 的细胞因子，其原始鉴定是基于其诱导某些小鼠肿瘤坏死的能力(参见例如Old，L(1985) Science 230 =630-632) 0随后，一个与恶病质相关的名称为恶病质素的因子表明是与 TNFa相同的分子。据信TNF α参与介导休克(参见例如Beutler，B.和Cerami，Α. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57 :505-518 ；Beutler, B.禾口 Cerami, Α. (1988)Annu. Rev. Immumo 1. 7 625-65 。另外，据信TNFa参与各种各样的其它人类疾病和紊乱的病理生理学，包括脓毒 症、感染、自身免疫疾病、移植物排斥和移植物抗宿主病(参见例如Moeller，Α.等(1990) Cytokine 2 :162-169 ；Moeller 等的美国专利 5，231，024 号；Moeller, A.等的欧洲专利 公开洸0 610 Bl 号，Vasilli，P. (1992)Annu. Rev. Immunol. 10 :411-452 ；Tracey, K. J.和 Cerami, Α. (1994) Annu. Rev. Med. 45 :491-503)。由于人TNFa (hTNF α )在各种各样的人体紊乱中的有害作用，已设计治疗策略 以抑制或抵消hTNFa的活性。特别是，已寻找与hTNFa结合或中和hTNFa的抗体做为 抑制hTNFa活性的手段。一些最早的这种抗体是由用hTNFa免疫的小鼠的淋巴细胞 制备的杂交瘤分泌的小鼠单克隆抗体(mAbs)(参见例如Hahn T ；等，(1985)ft~OC Natl Acad SciUSA 82 :3814-3818 ；Liang, C-M.等(1986)Biochem. Biophys. Res. Commun. 137 847-854 ；Hirai, M.等(1987)J. Immunol. Methods 96 :57-62 ；Fendly, B .Μ.等(1987) Hybridoma 6 :359-370 ；Moeller, Α.等(1990) Cytokine 2 :162-169 ；授予 Moeller 等的美 国专禾Ij 5，231，024号；ffallach, D.的欧洲专利公开186 833 Bl号；Old等的欧洲专利申 请公开218 868A1号；Moeller，Α.等的欧洲专利公开沈0 610 Bl号)。虽然这些小鼠抗 hTNF α抗体经常展示与hTNF α的高亲和力(例如Kd彡I(T9M)并能够中和hTNF α活性， 但它们的体内使用受与给与人类小鼠抗体相关的问题所限制，所述问题例如为血清半衰期 短、不能触发某些人体效应物的功能和引出不想要的人体内抗该小鼠抗体的免疫应答(“人 抗鼠抗体”(HAMA)反应)。为试图克服与在人体内使用全鼠抗体相关的问题，已对鼠抗hTNFa抗体进行遗 传工程使其更“人类化”。例如，已制备嵌合抗体，其中抗体链的可变区为鼠源，而抗体链的 恒定区为人源(Knight，D. M 等(1993)Mol. Immunol. 30 1443-1453 ；Daddona, P. E.等的 PCT 公开W092/16553号)。另外，也已制备人化抗体，其中所述抗体可变区的超变域为鼠源，但 所述可变区的其余部分和所述抗体恒定区为人源(Adair，J.R.等的PCT公开WO 92/11383 号)。然而，因为这些嵌合抗体和人化抗体仍然保留一些鼠序列，因此它们仍然可能引出 不想要的免疫反应，即人抗嵌合抗体(HACA)反应，特别是当长期给药时，例如用于慢性适 应症，例如类风湿性关节炎(参见例如Elliott，M.J.等(1994)Lancet344 :1125-1127 ； Elliot, Μ.J.等(1994)Lancet 344 :1105-1110)。优于鼠mAbs或其衍生物(例如嵌合抗体或人化抗体)的hTNF α抑制剂可以是完全人类抗hTNFa抗体，因为这种药剂甚至在长期给与时也不会引起该HAMA反应。已使用人 类杂交瘤技术制备了抗hTNFa人单克隆自身抗体(Boyle，P.等(1993) Cell. Immunol. @ 556-568 ；Boyle, P.等(1993)Cell. Immunol. 152 :569-581 ；Boyle 等的欧洲专利申请公开 614 984 A2号)。然而，据报道这些杂交瘤来源的单克隆自身抗体对hTNFa的亲和性太低， 以致于不能用常规方法计算，不能结合可溶性hTNFa并且不能中和hTNFa诱导的细胞毒 性(参见Boyle等；见上述)。另外，人杂交瘤技术的成功取决于产生hTNFa特异性自身抗 体的淋巴细胞在人外周血中的自然存在。某些研究已在人类对象中检测到抗hTNFa血清 自身抗体(Fomsgaard,A.等(1989) Scand. J. Immunol. 30 :219-223 ；Bendtzen,K.等(1990) Prog. Leukocyte Biol. IOB :447-452)，而其它的研究未检测到(Leusch，H-G.等(1991) J. Immunol. Methods 139 145-147)。除自然发生的人抗hTNFa抗体之外的另一选择是重组hTNF α抗体。已描述了 以相对低亲和性(即Kd I(T7M)和快解离速率(即Koff 10_2秒-1)结合hTNF α的重组 人抗体(Griffiths，A.D.等(1993)EMBO J. 12 =725-734) 0然而，由于它们的相对快速解 离的动力学，这些抗体可能不适于治疗用途。另外，已描述了一种重组人抗hTNF α，它不中 和hTNF α活性，却增强hTNF α与细胞表面的结合并增强hTNF α内在化(Lidbury，Α.等 (1994) Biotechnol. Ther. 5 :27-45 ；Aston, R.等的 PCT 公开 W 92/03145 号)。因此，仍然需要以高亲和性和慢解离动力学地结合可溶性hTNF α并具有中和 hTNFa活性包括hTNF α诱导的细胞毒性(体外和体内)和hTNF α诱导的细胞激活的能力 的人抗体，诸如重组人抗体。
发明概要本发明提供特异性与人TNF α结合的人抗体，最好是重组人抗体。本发明抗体的 特征为高亲和性和慢解离动力学地与hTNF α结合和中和hTNF α的活性，包括hTNF α诱导 的细胞毒性(体外和体内)和hTNF α诱导的细胞激活。本发明抗体的其它特征为与hTNF a 而非hTNF β (淋巴细胞毒素)结合并具有与除人TNF α之外的其它灵长类TNF α和非灵长 类TNF α结合的能力。本发明的抗体可以是全长的(例如IgGl或IgG4抗体)或可以仅包含抗原结合部 分(例如i^b、F(ab，)2或scFv片段)。本发明最优选的重组抗体D2E7称为D2E7，有一包 含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的轻链⑶R3域和一包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列的重链 ⑶R3域。该D2E7抗体最好具有包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)和 包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)。在一个实施方案中，本发明提供分离的人抗体或其抗原结合部分，它以不高于 1 X IO-8M的Kd和不高于1 X IO-3S-1的K。ff速率常数(均由表面等离子体激元共振测定)与 人TNF α解离，并在标准体外检测中以不高于IX IO-7M的IC5tl中和人TNF α细胞毒性。 该分离的人抗体或其抗原结合部分更优选地以不高于5 X ΙΟΛΓ1、甚至更优选地以不高于 1 X ΙΟ、—1的K。ff与人TNF α解离。更优选的是，在标准体外检测中以不高于1 X 10_%、 甚至更优选地以不高于1X10_9M、甚至再更优选地以不高于5X10_1(IM的IC5tl中和人TNF a 细胞毒性。在另一实施例中，本发明提供具有以下特征的人抗体或其抗原结合部分
a)以不高于IX ΙΟ、—1的K。ff(由表面等离子体激元共振测定)与人TNF α解离；b)具有一轻链⑶R3域，该域包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列，或通过于位置1、4、 5、7或8的单丙氨酸置换或通过于位置1、3、4、6、7、8和/或9的1_5个保守氨基酸置换从 SEQ ID ID NO 3修饰的氨基酸序列；c)具有一重链⑶R3域，该域包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列，或通过于位置2、3、 4、5、6、8、9、10或11的单丙氨酸置换或通过于位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的1-5
个保守氨基酸置换从SEQ ID NO :4修饰的氨基酸序列。更优选的是，该抗体或其抗原结合部分以不高于5Χ10ΛΓ1的K。ff与人TNFa解 离。再更优选的是，该抗体或其抗原结合部分以不高于IX IO-4S-1的K。ff与人TNF α解离。在再一实施方案中，本发明提供人抗体或其抗原结合部分，其LCVR具有的CDR3域 包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列、或通过于位置1、4、5、7或8的单丙氨酸置换从SEQ ID NO: 3修饰的氨基酸序列，其HCVR具有的⑶R3域包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列、或通过于 位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的单丙氨酸置换从SEQ ID NO :4修饰的氨基酸序列。更优选 地，该LCVR另外具有包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列的⑶R2域，并且该HCVR另外具有包 含SEQ ID NO 6的氨基酸序列的⑶R2域。再更优选地，该LCVR另外具有包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列的⑶Rl域，并且该HCVR具有包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列的⑶Rl域。在再一实施方案中，本发明提供具有包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的LCVR和包 含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的HCVR的分离人抗体或其抗原结合部分。在某些实施方案 中，该抗体具有一 IgGl重链恒定区或一 IgG4重链恒定区。在其它实施方案中，该抗体是一 Fab片段、一 F(ab，)2片段或一单链Fv片段。在另一些实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合部分，其LCVR具有选自以下 氨基酸序列的一个 CDR3 域SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25, SEQ ID NO J6或其HCVR具有选自以下氨基酸序列的一个CDR3域SEQ ID NO :4、 SEQ ID NO 27,SEQ ID NO28,SEQ ID NO 29,SEQ ID NO 30,SEQ ID N0:31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :34 禾口 SEQ ID NO :35。在再一实施方案中，本发明提供中和人TNF α而非人TNF β (淋巴细胞毒素)活性 的分离人抗体或其抗原结合部分。在一最佳实施方案中，该人抗体或其抗原结合部分中和 人TNF α、黑猩猩TNF α和选自以下的至少一种其它的灵长类TNF α的活性狒狒TNF α、狨 TNF α、猕猴TNF α和恒河猴TNF α。最好是，该抗体亦中和至少一种非灵长类TNF α的活 性。例如，在一分实施方案(subembodiment)中，该分离人抗体或其抗原结合部分亦中和犬 TNFa的活性。在另一分实施方案中，该分离人抗体或其抗原结合部分亦中和猪TNFa的活 性。在再一分实施方案中，该分离人抗体或其抗原结合部分亦中和小鼠TNFa的活性。本发明的另一方面涉及编码本发明抗体或其抗原结合部分的核酸分子。本发明优 选的核酸分子编码D2E7LCVR，具有图7和SEQ IDNO :36所示的核苷酸序列。本发明的另一 优选核酸分子编码D2E7HCVR，具有图8和SEQ ID NO :37所示的核苷酸序列。本发明亦包 含携带本发明抗体编码核酸的重组表达载体、导入这种载体的宿主细胞，也包括通过培养 本发明的宿主细胞制备本发明的抗体的方法。
本发明的再一方面涉及使用本发明的抗体或其抗原结合部分抑制人TNFa活性 的方法。在一个实施方案中，该方法包括用本发明的抗体或其抗原结合部分接触人TNFa， 使得抑制人TNFa活性。在另一实施方案中，该方法包括将本发明的抗体或其抗原结合部 分给与患病(其中TNFa活性是有害的)的人类受治疗者，使得抑制该人类受治疗者中的 ATNFa活性。该疾病可以是例如脓毒症、自身免疫疾病(例如类风湿性关节炎，变态反应， 多发性硬化，自身免疫性糖尿病，自身免疫性眼色素层炎和肾病综合症)、传染性疾病、恶性 肿瘤、移植物排斥或移植物抗宿主病、肺功能紊乱、骨疾病、肠功能紊乱或心脏功能紊乱。附图简述图IA和IB展示了下述的氨基酸序列D2E7的轻链可变区(D2E7 VL ；亦示于SEQ ID NO :1)、D2E7 VL 的丙氨酸扫描突变体(LD2E7*. Al、LD2E7*. A3、LD2E7*. A4、LD2E7*. A5、 LD2E7*. A7 和 LD2E7*. A8)、D2E7 相关抗体 2SD4 的轻链可变区 QSD4VL ；亦示于 SEQ ID NO 9)和其它 D2E7 相关轻链可变区(EP B12、VL10E4、VL100A9、VL100D2、VL10F4、L0E5、VLL0F9、 VLL0F10、VLL0G7、VLL0G9、VLLOHl、VLL0H10、VL1B7、VLlCl、VL1C7、VLO. 1F4、VL0. 1H8、L0E7、 L0E7. A 和 L0E7. T)。图 IA 展示所述 FR1、CDR1、FR2 和 CDR2 域。图 IB 展示所述 FR3、CDR3 和 FR4 域。所述轻链 CDRl ( "CDR L1”)、CDR2( "CDR L2”)和 CDR3 ( "CDR L3”)域位于框 内。图2A和2B展示了下述的氨基酸序列D2E7的重链可变区(D2E7 VH ；亦示于SEQ ID N0:2)、D2E7 VH 的丙氨酸扫描突变体(HD2E7*. Al、HD2E7*. A2、HD2E7*. A3、HD2E7*. A4、 HD2E7*A5、HD2E7*. A6、HD2E7*. A7、HD2E7*. A8 和 HD2E7*. A9)、D2E7 相关抗体 2SD4 的重链 可变区QSD4 VH;亦示于SEQ ID NO :10)和其它D2E7相关重链可变区(VH1B11、VH1D8、 VHlAl 1、VH1B12、VH1-D2、VH1E4、VH1F6、VHlGl、3C_H2、VH1-D2. N 和 VH1-D2. Y)。图 2A 展示 所述FR1、CDR1、FR2和CDR2域。图2B展示所述FR3、CDR3和FR4域。所述重链CDRl ("CDR H1”)、CDR2( "CDR H2”)和 CDR3 ( "CDR H3”)域位于框内。图3是一曲线图，描述与鼠抗hTNFa抗体MAK 195相比，由人抗hTNF α抗体D2E7 对TNF α诱导的细胞毒性的抑制。图4是一曲线图，描述与鼠抗hTNFa抗体MAK 195相比，由人抗hTNF α抗体D2E7 对rh TNF α与U-937上的hTNF α受体结合的抑制。图5是一曲线图，描述与鼠抗hTNFa抗体MAK 195相比，由人抗hTNF α抗体D2E7 对TNF α诱导的ELAM-I在HUVEC上表达的抑制。图6是一柱状图表，描述与鼠抗hTNF α抗体MAK 195(空心柱)相比，通过给与人 抗hTNFa抗体D2E7(实心柱)保护D-半乳糖胺致敏小鼠免受TNF α诱导的致死性。图7展示D2E7的轻链可变区的核苷酸序列，在该核苷酸序列下是预期的氨基酸序 列。在所述CDR Li、CDR L2和CDR L3区下划线。图8展示D2E7的重链可变区的核苷酸序列，在该核苷酸序列下是预期的氨基酸序 列。在所述CDR HI、CDR H2和CDR H3区下划线。图9是一曲线图，描述D2E7抗体治疗对做为多关节炎模型的Tgl97转基因小鼠平 均关节尺寸的影响。发明详述本发明涉及以高亲和性、低解离速率和高中和能力地与人TNFa结合的分离人抗体或其抗原结合部分。本发明的各个方面涉及抗体和抗体片段以及其药用组合物、以及制 备这种抗体和片段的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本发明亦包括用本发明的抗体检测 人TNF α或在体外或体内抑制人TNF α活性。为更易理解本发明，首先定义某些术语。本文所用的术语“人TNF α ”(本文缩写为hTNFa或简单地写为hTNF)是指以17kD 分泌形式和^kD膜结合形式存在的人细胞因子，其生物学活性形式由非共价键连接的 17kD分子的三聚体组成。hTNF α的结构另外描述于例如Pennica，D.等(1984) Nature 312 724-729 ；Davis, J. Μ.等(1987)Biochemistry 巡1322-1326 ；和 Jones，Ε. Y.等(1989) Nature 2巡225-2 。术语人TNF α包括重组人TNF α (rhTNF α )，它可以通过标准重组表 达方法制备或购买得到(R&D Systems,目录号210-TA，Minneapolis, MN)。本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，它们由四条多肽链组成，即由二硫 键相互连接的二条重链(H)和二条轻链(L)。每条重链由重链可变区(本文简写为HCVR或 VH)和重链恒定区组成。该重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域组成。每条轻链由轻 链可变区(本文简写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。该轻链恒定区由一个结构域即CL 组成。VH和VL区可以进一步划分为超变区，称为互补性决定区(CDR)，其间散布着更为保 守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，它从氨基末端至 羧基末端的排布顺序如下FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本文所用的抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)指保留与抗原(例如 hTNF α)特异性结合能力的抗体的一个或多个片段。已发现可以由全长抗体的片段行使抗 体的抗原结合功能。在抗体的“抗原结合部分”术语中包括的结合片段的例子包括(i) 一 个Fab片段，由VL、VH、CL和CHl域组成的单价片段；(ii) 一个F(ab，)2片段，包含在铰链 区由二硫桥连接的二个Fab片段的二价片段；(iii) 一个Fd片段，由VH和CHl域组成；(iv) 一个Fv片段，由抗体单臂的VL和VH域组成；(ν) 一个dAb片段(Ward等，(1989)Nature Mi =544-546)，由一个VH域组成；和(vi) —个分离的互补性决定区(⑶R)。另外，尽管该 Fv片段的二个结构域VL和VH由独立的基因编码，但可以采用重组方法用能使它们成为 单蛋白链的合成接头将它们连接，在该单蛋白链中所述VL和VH区配对形成单价分子(已 知为单链 Fv(scFv)；参见例如 Bird 等(1988)kience 242 :423-426 和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)。这种单链抗体亦包含于术语抗体的“抗原结合 部分”之中。亦包括其它形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价的双特异性抗体，其 中VH和VL域表达于一个多肽单链上，但所用的接头太短使得同一链上的这二个结构域不 能配对，因此迫使这些结构域与另一链的互补结构域配对而创造出二个抗原结合位点(参 见例如 Holliger，P.等(1993)Proc. Natl. Acad. ki. USA 90 :6444-6448 ；Poljak, R. J.等 (1994)Structure 2 :1121-1123) 另外，抗体或其抗原结合部分可以是一个较大的免疫粘附分子的一部分，该分子 由该抗体或抗体部分与一个或多个其它蛋白或肽通过共价或非共价结合而形成。这种 免疫粘附分子的例子包括用抗生蛋白链菌素核心区制备四聚体scFv分子(Kipriyanov， S. Μ.等(1995) HumanAntibodies and Hybridomas 6:93-101)和使用半胱氨酸残基、标记 肽和C末端多组氨酸标记制备二价生物素化scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.等(1994)Mol. Immunol. 31 :1047-1058).可以采用常规技术例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分别消化完整抗体，从完整抗体制备诸如Fab和F(ab’)2片段的抗体部分。另外，可以按照本文描述的标 准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。本文使用的术语“人抗体”包括具有得自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区 的抗体。本发明的人抗体例如在CDR中和在CDR3中可以包括未被人种系免疫球蛋白序列 编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)。 然而，本文使用的术语“人抗体”不包括其中CDR序列得自其它哺乳动物种(例如小鼠)并 已被移植至人框架序列的抗体。本文使用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创造或分离的所有 人抗体，例如用转染至宿主细胞的重组表达载体表达的抗体(在以下第II节进一步描述)、 从重组、联合人抗体文库中分离的抗体(在以下第III节进一步描述)、从用人免疫球蛋白 基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor，L.D.等(1992) Nucl. Acids Res. 20 =6287-6295)或通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方 法制备、表达、创造或分离的抗体。这种重组人抗体具有得自人种系免疫球蛋白序列的可变 区和恒定区。然而，在某些实施方案中，对这种重组人抗体进行体外诱变(或使用人Ig序 列转基因动物时为体内体细胞诱变)，因此所述重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是那些 虽然得自人种系VH和VL序列并与之相关、但在体内的人抗体种系的所有组成部分中都不 天然存在+的序列。本文使用的“分离抗体”是指大致不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体 (例如特异性结合hTNFa的分离抗体大致不含有与hTNF α之外的抗原特异性结合的抗 体)。然而，与hTNFa特异性结合的分离抗体具有对其它抗原(例如来自其它种的hTNFa) 的交叉反应性(在以下详细讨论)。另外，分离抗体可以大致不含其它细胞物质和/或化学 物质。本文使用的“中和抗体”(或“中和hTNF α活性的抗体”)是指与hTNF α结合导 致hTNFa的生物学活性被抑制的抗体。这种对hTNF α生物学活性的抑制可以通过测定 hTNF α生物学活性的一个或多个指标进行评价，所述指标例如hTNF α诱导的细胞毒性(或 者体外或者体内)、hTNF α诱导的细胞激活和hTNF α与hTNF α受体的结合。可以通过本 领域已知的一种或多种标准体外或体内检测评价这些hTNF α生物学活性指标(参见实施 例4)。最好是，通过抑制hTNF α诱导的细胞的细胞毒性评价抗体中和hTNF α活性 的能力。做为另一个或者二者择一的hTNF α活性指标，可以评价抗体抑制hTNF α诱导的 ELAM-I在HUVEC上的表达的能力，做为hTNF α诱导的细胞激活的量度。本文使用的术语“表面等离子体激元共振”是指一光学现象，它允许通过例如使 用 BIAcore 系统(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala，Sweden 禾口 Piscataway，NJ)检狈Ij在 生物传感器基质中蛋白质浓度的改变进行实时生物特异性相互作用分析。有关进一步的 描述，参见实施例 1 和 J nsson, U.等(1993) Ann. Biol. Clin.坠19-26 ； Jonsson, U.等 (1991)Biotechniques 11:620-627 Johnsson, B.等(1995)J. Mol. Recognit. § 125-131 ； 和 Johnson，B.等(1991)Anal. Biochem. 198 :268_277。本文使用的术语“K。ff”是指抗体从所述抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。本文使用的术语“K/’是指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。本文使用的术语“核酸分子”包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链，但最好是双链DNA。本文使用的与编码结合hTNF α的抗体或抗体部分(例如VH、VL、⑶R3)的核酸有 关的术语“分离核酸分子”是指下述核酸分子，其中编码该抗体或抗体部分的核苷酸序列不 含其它编码与hTNFa之外的抗原结合的抗体或抗体部分的核苷酸序列，所述其它序列可 能在人基因组DNA中天然位于该核酸的侧翼。因此，例如编码抗TNF α抗体的VH区的本发 明的分离核酸分子不含任何其它编码与TNFa之外的抗原结合的其它VH区的序列。本文使用的术语“载体”是指有能力运送与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的 一种类型是“质粒”，是指其中可以连接其它DNA片段的环状双链DNA环。载体的另一类型 是病毒载体，其中在病毒基因组中可以连接其它DNA片段。某些载体能够在其导入的宿主 细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其它载体 (例如非附加体哺乳动物载体)可以在导入该宿主细胞时被整合入该宿主细胞的基因组， 由此可以与该宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的 表达。这种载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，在重 组DNA技术中使用的表达载体的常见形式为质粒。在本说明书中，可以将“质粒”和“载体” 互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明包括具有相同的功能的其它形式的 表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。本文使用的术语“重组宿主细胞”是指导入了重组表达载体的细胞。应理解这种 术语不仅指特定的对象细胞，而且指这种细胞的后代。因为在后续世代中由于或者突变或 者环境影响可能发生某些修饰，事实上这种后代可以与亲本细胞不同，但却仍然包含于本 文使用的术语“宿主细胞”的范围之内。 在下面的小节中更详细地描述本发明的各种方面。I.与人TNF α结合的人抗体本发明提供以高亲和性、低解离速率和高中和能力与人TNFa结合的分离人抗体 或其抗原结合部分。本发明的人抗体优选地是重组的、中和人抗TNFa抗体。最优选的本 发明重组中和抗体在本文中称为D2E7并具有

图1A、1B和图2A、2B分别展示的VL和VH序 列(D2E7 VL区的氨基酸序列亦示于SEQ ID NO 1 ；D2E7 VH区的氨基酸序列亦示于SEQ ID NO :2)。以下概述了与表现出高亲和性和低解离动力学的鼠抗hTNF α MAK 195mAb和另一个 与D2E7、2SD4有关的人抗hTNF α抗体相比的D2E7的结合特性
权利要求
1.分离的人抗体或其抗原结合部分，其以通过表面等离子体激元共振测定不高于 1 X IO-8M的Kd和不高于1 X ΙΟ、—1的K。ff速率常数与人TNF α解离、并在标准体外检 测中以不高于1 X IO-7M的IC50中和人TNF α细胞毒性。
2.权利要求1的分离的人抗体或其抗原结合部分，它以不高于5Χ10ΛΓ1的K。ff速率 常数与人TNF α解离。
3.权利要求1的分离的人抗体或其抗原结合部分，它以不高于1X IO-4S-1的K。ff速率 常数与人TNF α解离。
4.权利要求1的分离的人抗体或其抗原结合部分，它在标准体外检测中以不高于 1 X KT8M的IC50中和人TNF α细胞毒性。
5.权利要求1的分离的人抗体或其抗原结合部分，它在标准体外检测中以不高于 1 X IO-9M的IC50中和人TNF α细胞毒性。
6.权利要求1的分离的人抗体或其抗原结合部分，它在标准体外检测中以不高于 5 X IO-10M的IC50中和人TNF α细胞毒性。
7.权利要求1的分离的人抗体或其抗原结合部分，它是重组抗体或其抗原结合部分。
8.权利要求1的分离的人抗体或其抗原结合部分，它抑制人TNFα诱导的ELAM-I在人 脐静脉内皮细胞上的表达。
9.具有以下特征的分离的人抗体或其抗原结合部分a)以不高于1X ΙΟ—、—1的K。ff速率常数(由表面等离子体激元共振测定)与人TNF α 解离；b)具有轻链⑶R3域，该域包含SEQID NO :3的氨基酸序列，或通过于位置1、4、5、7或 8的单丙氨酸置换或通过于位置1、3、4、6、7、8和/或9的1至5个保守氨基酸置换从SEQ ID NO 3修饰的氨基酸序列；c)具有重链⑶R3域，该域包含SEQID N0:4的氨基酸序列，或通过于位置2、3、4、5、6、 8,9,10或11的单丙氨酸置换或通过于位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的1至5个保 守氨基酸置换从SEQ ID NO :4修饰的氨基酸序列。
10.权利要求1-9中任一项的人抗体或其抗原结合部分，其具有一IgGl重链恒定区。
11.权利要求1-9中任一项的人抗体或其抗原结合部分，其具有一IgG4重链恒定区。
12.权利要求1-9中任一项的人抗体或其抗原结合部分，它是一Fab片段。
13.权利要求1-9中任一项的人抗体或其抗原结合部分，它是一单链Fv片段。
14.包含权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的药 用组合物。
15.权利要求14的药用组合物，它还包含至少一种用于治疗TNFα活性有害的紊乱的 其它治疗剂。
16.一种抑制人TNFa活性的方法，包括用权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合 部分体外接触人TNF α使得人TNF α活性被抑制。
17.权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合部分用于制造治疗其中TNFa活性是 有害的紊乱的药物的用途。
18.权利要求17的用途，其中该紊乱是脓毒症。
19.权利要求18的用途，其中所述药物还含有细胞因子白介素_6。
20.权利要求17的用途，其中该紊乱是自身免疫疾病。
21.权利要求20的用途，其中该自身免疫疾病选自类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、 骨关节炎、痛风性关节炎、变态反应、多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、自身免疫性眼色素 层炎和肾病综合症。
22.权利要求17的用途，其中该紊乱是传染病。
23.权利要求22的用途，其中传染病选自恶病质、AIDS、细菌性脑膜炎。
24.权利要求17的用途，其中该紊乱是移植排斥或移植物抗宿主病。
25.权利要求17的用途，其中该紊乱是恶性肿瘤。
26.权利要求17的用途，其中该紊乱是肺功能紊乱。
27.权利要求沈的用途，其中肺功能紊乱选自成人呼吸窘迫综合征、休克肺、慢性肺炎 性疾病、肺结节病、肺纤维化和硅肺。
28.权利要求17的用途，其中该紊乱是肠功能紊乱。
29.权利要求观的用途，其中肠功能紊乱是局限性回肠炎或溃疡性结肠炎。
30.权利要求17的用途，其中该紊乱是心脏功能紊乱。
31.权利要求30的用途，其中心脏功能紊乱是心脏局部缺血或心脏功能不全。
32.权利要求17的用途，其中该紊乱选自炎症性骨病、骨吸收疾病、酒精性肝炎、病毒 性肝炎、暴发性肝炎、凝结紊乱、烧伤、再灌注损伤、瘢痕组织形成、发热、牙周病、肥胖、脓毒 症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓毒症、毒性休克综合征、脑型疟、AIDS相关复合征 ARC和放射毒性。
33.权利要求17的用途，其中该紊乱选自移植继发的巨细胞病毒感染、因感染引起的 发烧和肌痛、感染继发的恶病质和同种移植排斥。
34.权利要求17的用途，其中该紊乱是肿瘤生长或肿瘤转移。
35.权利要求17的用途，其中所述药物包含至少一种选自非类固醇抗炎药、细胞因子 抑制抗炎药、皮质类固醇、生长因子、抗生素、组织因子通道抑制剂、植物脂、抗氧化剂、氨水 杨酸、铁螯合剂、铁螯合物的其它治疗剂。
36.权利要求17的用途，其中所述药物包含至少一种其它治疗剂，该其它治疗剂选 自 CDP-571/BAY-10-3356、cA2、75kdTNFR-IgG、55kdTNFR_IgG、IDEC-CE9. 1/SB210396、DAB 486-IL-2、DAB 389-IL-2、抗 Tac、IL-4、IL-10、IL-4 激动剂、IL-10 激动剂、TNF-bp/s-TNFR、 R973401、MK-966、Iloprost、氨甲蝶呤、酞胺哌啶酮、Ieflunomide、凝血酸、T-614、前列腺 素El、Tenidap、萘普生、Meloxicam、吡罗昔康、双氯芬酸、消炎痛、柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、 ICE抑制剂、zap-70抑制剂、Ick抑制剂、VEGF抑制剂、VEGF-R抑制剂、TNF-转化酶抑制剂、 抗IL-12抗体、白介素-11、白介素-13、白介素-17抑制剂、青霉胺、氯喹、羟氯喹、苯丁酸氮 芥、环磷酰胺、环孢菌素、抗胸腺细胞球蛋白、抗CD4抗体、CD-5毒素、胶原蛋白、Iobenzarit disodium、细胞因子调节剂和HP466、ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸、强的松、 奥古蛋白、葡糖胺聚糖多硫酸盐、二甲胺四环素、抗IL2R抗体、金诺芬、保泰松、甲氯芬那 酸、氟芬那酸、静注用免疫球蛋白、Zileuton、霉酚酸、tacrolimus、sirolimus、amiprilose、 cladribine、阿扎立平、budenoside、表皮生长因子、氨基水杨酸盐、6-巯基嘌呤、甲硝唑、脂 氧合酶抑制剂、奥沙拉秦、balsalazide、凝血噁烷抑制剂、IL-I受体拮抗剂、弹性蛋白酶抑 制剂、吡啶基咪唑化合物、强的松龙的葡糖苷酸结合前体药物、地塞米松的葡糖苷酸结合前体药物或budesonide的葡糖苷酸结合前体药物、强的松龙的葡聚糖结合前体药物、地塞米 松的葡聚糖结合前体药物或布地奈德的葡聚糖结合前体药物、可溶性补体受体1、缓释氨水 杨酸、血小板激活因子PAF拮抗剂、环丙沙星、利多卡因、强的松龙、甲基强的松龙、4-氨基 口比口定、tizanidine、干扰素-β la、干扰素-β lb、Cop-l> clabribine、carbapenems、细胞因 子 TNF α、IL-1 β、IL_6 和 / 或 IL-8 的拮抗剂、SK&F107647、四价脒基腙 CNI_1493、PHP、五 乙酸二乙三胺-铁(III)络合物、lis0fylline、PGG-葡聚糖、用脂类重构的载脂蛋白A-1、 手性异羟肟酸、抗内毒素抗体、E5531、rBPI21、合成抗内毒素肽。
37.权利要求观的用途，其中所述肠功能紊乱是特发性炎症性肠病。
38.权利要求17的用途，其中所述紊乱是瘢痕疙瘩形成。
全文摘要
公开了特异性与人肿瘤坏死因子α(hTNFα)结合的人抗体，最好为重组人抗体。这些抗体对hTNFα具有高亲和性(例如，Kd不高于1x10-8M)和低解离速率(例如，Koff不高于1x10-3s-1)并在体外和体内中和hTNFα活性。本发明的抗体可以是全长抗体或是其抗原结合部分。本发明的抗体或抗体部分可以用于检测hTNFα并例如在患有其中hTNFα活性是有害的紊乱的人类受治疗者中抑制hTNFα活性。本发明亦包括表达本发明重组人抗体的核酸、载体和宿主细胞、以及合成所述重组人抗体的方法。
文档编号G01N33/576GK102070715SQ201010552509
公开日2011年5月25日 申请日期1997年2月10日 优先权日1996年2月9日
发明者A·J·维尔顿, A·J·罗伯茨, B·T·麦圭内斯, B·拉布科夫斯基, D·J·阿伦, D·舍恩豪特, H·R·J·M·霍根布姆, J·A·曼克维, J·G·萨菲尔德, M·怀特, P·萨克拉法斯, T·J·沃汉, Z·凯马克卡兰 申请人:艾博特生物技术有限公司