专利名称：一种磷酸根敏感膜及其制备、使用方法
技术领域：
本发明属于电化学生物传感器及其制备技术领域，特别是涉及一种磷酸根敏感膜及其制备、使用方法，即以硝酸纤维素膜为基体的麦芽糖磷酸化酶-葡萄糖氧化酶双酶磷酸根敏感膜，检测磷酸根。
背景技术：
磷酸根含量是影响发酵过程及其产品质量的重要因素，食品中磷酸根含量是食品营养卫生检验检疫的重要指标，因此快速、准确检测磷酸根在发酵及食品工业中具有重要意义。检测磷酸根的方法有多种，如比色法、比浊法、重量法、离子色谱法等，但比色法、比浊法、重量法等方法的检测精度、灵敏度不够高且操作过程繁琐，而离子色谱法需要昂贵的仪器设备。近年来，人们开始研究用酶电极检测磷酸根，具有简单、快速、选择性高等优点。研究人员已开发出多种可以应用于磷酸根检测的酶电极体系，其中较有代表性的是丙酮酸氧化酶体系和麦芽糖磷酸化酶体系。在文献(I)AnalyticalBiochemistry，2005，343 :263-267 中，Roger C. H. Kwan 等人采用Nafion溶液将丙酮酸氧化酶固定在丝网印刷电极上制备了磷酸根生物传感器，该传感器需要在测试缓冲溶液中添加黄素腺嘌呤二核苷酸、辅羧酶和MgCl2作为辅助因子，丙酮酸作为反应底物。研究表明，最佳测试条件下磷酸根线性响应范围为7. 5 625 μ mol/L, 检测限为3. 6 μ mol/L,灵敏度为523. 89nA/ (mmol/L)，响应时间为2秒，持续操作12小时电流保持85%。该磷酸根生物传感器的线性响应范围较宽，响应迅速，操作稳定性能良好，但由于测试缓冲溶液构成复杂，因此测试样品的种类受到限制，该传感器主要适用于人体唾液的检测。另外，丙酮酸氧化酶及反应辅助因子都是昂贵的生化药品，因此成本很高。麦芽糖磷酸化酶体系所使用的酶价格较低，在成本上具有一定优势。在文献(2) Analytica ChimicaActa, 1995，309 :47-52 中，N. Conrath 等人用戊二酸作为交联剂将麦芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、牛血清蛋白固定于铜纺膜上，在柠檬酸缓冲溶液中检测磷酸根未取得预期效果，只有再加入变旋酶或/与酸性磷酸酶，组装成三酶、四酶生物传感器，才实现了对磷酸根的检测。其中性能最佳的四酶传感器的线性响应范围为0. 1 1 μ mol/L。 该文献研制的磷酸根生物传感器灵敏度较高，达到4. 4 μ A/ (mmol/L)，但该体系使用酶的种类较多，基体膜较为昂贵，制备过程较繁琐，成本较高。在文献(3)Enzyme and Microbial Technology，1997，21 :413-420 中，Stephan HUwel等人用戊二醛作为交联剂将麦芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、牛血清蛋白固定在钼电极上构成了磷酸根生物传感器，该传感器在PH = 6. 5，36°C的最佳测试条件下的线性响应范围为0. 5 lOymol/L，检测限为0. 1 μ mol/L，响应时间为4分钟，6小时内酶活性不损失。但由于酶直接固定在电极上，导致电极不宜更换，测试成本高。在文献(4)Analytica Chimica Acta, 2001,443 1-8 中，Christine Mousty 等人采用戊二醛为交联剂将麦芽糖磷酸化酶、变旋酶、葡萄糖氧化酶固定在无机锂皂石黏土上，制备了磷酸根生物传感器。研究结果表明，PH = 6. 5，40°C的最佳测试条件下线性响应范围为1 50 μ mol/L,灵敏度为10. 3 μ A/ (mmol/L)，持续操作8小时电流保持90%，贮存2周后电流响应能够保持稳定。磷酸根生物传感器的线性响应范围较宽，储存性能良好，相对前人工作在性能上有较大的提升，但是酶直接固定在电极上，导致电极不宜更换，测试成本高。

发明内容
本发明的目的在于提供一种磷酸根敏感膜及其制备、使用方法，即以硝酸纤维素膜为基体的麦芽糖磷酸化酶-葡萄糖氧化酶双酶磷酸根敏感膜并检测磷酸根。利用硝酸纤维素膜良好的化学稳定性及热稳定性、较大的孔隙率、较均勻的孔径分布以及良好的生物相容性等性能优势，有效地保持麦芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶的活性，提高生物传感器的灵敏度、线性响应范围及稳定性等，从而提高生物传感器的综合性能指标。同时本发明采用在测试缓冲溶液中添加2-羟基吡啶的方法催化反应中间产物α -葡萄糖变旋，起到了替代变旋酶的作用，实现了二酶体系对于磷酸根的检测。本发明磷酸根敏感膜由硝酸纤维素膜基体、麦芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶及固定酶的高分子物质戊二醛构成。其中，硝酸纤维素膜为硝酸纤维素微孔滤膜，其平均孔径为 0. 20 1. 20 μ m,厚度为50 150 μ m ；麦芽糖磷酸化酶的负载量为9. 0 28. 0活力单位 (U)/cm2 ；葡萄糖氧化酶的负载量为7. 0 32. OU/cm2 ；戊二醛是由戊二醛水溶液蒸气交联引入的。本发明磷酸根敏感膜的制备方法是将硝酸纤维素膜浸入pH值为6. 5的 0. 05mol/L磷酸缓冲溶液中处理6 18小时后取出，用高纯氮气吹干；将处理后的硝酸纤维素膜粘在0形橡胶圈上，将麦芽糖磷酸化酶-葡萄糖氧化酶双酶混合溶液滴在该硝酸纤维素膜上，在温度为0 8°C的冰箱中干燥0. 5 2小时；随后用戊二醛水溶液蒸气在0 8°C的条件下交联6 12小时，再将酶膜浸入pH值为6. 5的0. 05mol/L磷酸缓冲溶液中， 以洗去结合不牢固的酶，制成磷酸根敏感膜，保存在温度为0 8°C的冰箱中备用。其中pH 值为6. 5的0. 05mol/L磷酸缓冲溶液的溶剂为二次蒸馏水；麦芽糖磷酸化酶_葡萄糖氧化酶双酶混合溶液的溶剂为pH = 6. 5的0. 05mol/L磷酸缓冲溶液，溶质为0. 1 0. 5U/ μ L 麦芽糖磷酸化酶和0. 1 0. 5U/y L葡萄糖氧化酶；用于产生戊二醛蒸气的是质量分数为 50%的戊二醛水溶液，溶剂为二次蒸馏水。本发明磷酸根敏感膜测试样品中磷酸根的方法为将磷酸根敏感膜套在钼电极顶端作为工作电极，钼丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，组成三电极体系；将该三电极体系置于PH值为6. 5的测试缓冲溶液中，将电位设定在0. 6V(vs. Ag/AgCl)，采用计时电流方法测试磷酸根敏感膜对磷酸根离子的响应电流，记录i_t曲线，根据i_t曲线绘制响应电流与磷酸根浓度关系的标准工作曲线，利用此标准工作曲线进行待测样品中磷酸根浓度的定量检测。其中测试缓冲溶液是在pH = 6. 5的0. lmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中添加反应底物麦芽糖及葡萄糖变旋催化剂2-羟基吡啶得到的，麦芽糖浓度为1 40mmol/L，2-羟基吡啶的浓度为100 500mmol/L。本发明的效果可以从使用本发明磷酸根敏感膜制作的电化学生物传感器看出采用i-t方法测试传感器对磷酸根的响应电流，结果如

图1所示，响应时间3分钟；由图2可以看出，磷酸根敏感膜对磷酸根的线性响应范围为0. 5 6. Ommol/L,响应灵敏度为4. 24nA/ (mmol/L)，对本发明的磷酸根敏感膜进行连续操作9小时，响应信号保持98. 3%。本发明磷酸根生物传感器与文献数据的对比如表1所示。表1.磷酸根传感器性能比较
权利要求
1.一种磷酸根敏感膜，其特征在于该磷酸根敏感膜由硝酸纤维素膜基体、麦芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶及固定酶的高分子物质戊二醛构成；其中，硝酸纤维素膜为硝酸纤维素微孔滤膜，其平均孔径为0. 20 1. 20 μ m，厚度为50 150 μ m ；麦芽糖磷酸化酶的负载量为9. 0 28. 0活力单位(U)/cm2 ；葡萄糖氧化酶的负载量为7. 0 32. OU/cm2 ；戊二醛是由戊二醛水溶液蒸气交联弓丨入的。
2.一种制备权利要求1所述的磷酸根敏感膜的方法，其特征在于，工艺步骤为将硝酸纤维素膜浸入PH值为6. 5的0. 05mol/L磷酸缓冲溶液中处理6 12小时后取出，用高纯氮气吹干；将处理后的硝酸纤维素膜粘在0形橡胶圈上，将麦芽糖磷酸化酶-葡萄糖氧化酶双酶混合溶液滴在该硝酸纤维素膜上，在温度为0 8°C的冰箱中干燥0. 5 2小时；随后用戊二醛水溶液蒸气在0 8°C的条件下交联6 18小时，再将酶膜浸入pH值为6. 5 的0. 05mol/L磷酸缓冲溶液中，以洗去结合不牢固的酶，制成磷酸根敏感膜，保存在温度为 0 8°C的冰箱中备用。所述的硝酸纤维素膜为硝酸纤维素微孔滤膜，其平均孔径为0. 20 1. 20 μ m,厚度为 50 150 μ m ；麦芽糖磷酸化酶的负载量为9. 0 观.0活力单位(U)/cm2 ；葡萄糖氧化酶的负载量为7.0 32. OU/cm2。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于pH值为6.5的0. 05mol/L磷酸缓冲溶液的溶剂为二次蒸馏水；麦芽糖磷酸化酶-葡萄糖氧化酶双酶混合溶液的溶剂为pH = 6. 5的 0. 05mol/L磷酸缓冲溶液，溶质为0. 1 0. 5U/ μ L麦芽糖磷酸化酶和0. 1 0. 5U/ μ L葡萄糖氧化酶；用于产生戊二醛蒸气的是质量分数为50%的戊二醛水溶液，溶剂为二次蒸馏水。
4.一种权利要求1所述磷酸根敏感膜的使用方法，其特征为用于样品中磷酸根的定量检测，测试方法为将磷酸根敏感膜套在钼电极顶端作为工作电极，钼丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，组成三电极体系；将该三电极体系置于pH值为6. 5的测试缓冲溶液中，将电位设定在0. 6V(vs. Ag/AgCl)，采用计时电流方法测试磷酸根敏感膜对磷酸根离子的响应电流，记录i_t曲线，根据i_t曲线绘制响应电流与磷酸根浓度关系的标准工作曲线，利用此标准工作曲线进行待测样品中磷酸根浓度的定量检测；其中测试缓冲溶液是在pH = 6. 5的0. lmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中添加反应底物麦芽糖及葡萄糖变旋催化剂2-羟基吡啶得到的，麦芽糖浓度为1 40mmol/L，2-羟基吡啶的浓度为100 500mmol/L。
全文摘要
一种磷酸根敏感膜及其制备、使用方法，属于电化学生物传感器及其制备技术领域。该磷酸根敏感膜由硝酸纤维素膜基体、麦芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶及固定酶的高分子物质戊二醛构成。测试缓冲溶液由反应底物麦芽糖、葡萄糖变旋催化剂2-羟基吡啶、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液组成。本发明磷酸根生物传感器只使用两种酶就实现了磷酸根的检测，便于制备和条件优化，同时又具有较宽的线性响应范围和较好的操作稳定性，尤其适合在发酵工业和食品检验等领域中使用。
文档编号G01N27/49GK102153772SQ20101057404
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月6日 优先权日2010年12月6日
发明者张楠喆, 杨文胜 申请人:北京化工大学