专利名称：碱基序列的检测电极与装置及其检测方法
技术领域：
本发明涉及特别地检测试样中存在的特定基因的碱基序列的检测电极与装置及其检测方法。
背景技术：
由于近年来基因工程学的发展，在医疗领域通过基因诊断或预防疾病正在成为可能。利用基因工程学的诊断被称为基因诊断。在这种基因诊断中，通过检测引起疾病的人基因缺陷或改变，能够在疾病的发病前或其初期阶段进行诊断和预测。另外，通过检测感染的病毒或病原菌的基因，使准确的诊断成为可能。
以前采用的一般的基因检测方法如下所述。
首先，由试样提取基因。如果有必要，用适当的限制酶切断后，进行电泳和DNA印迹。接着，使具有与作为检测目的的靶基因互补的碱基序列的核酸探针与印迹的基因进行杂交。另外，该核酸探针通常用荧光色素进行标识。接着，用激光激发荧光色素。从而，检测杂交的核酸探针，确认靶基因的存在。
但是，在使用荧光色素的检测方法中，进行基因检测需要至少2～3天。另外，必须用昂贵的荧光色素标识核酸探针。而且，必须有激发荧光色素的激光发生装置，导致装置大型化。
为了解决上述使用荧光色素的检测方法的问题，设计出了采用电化学方法的基因检测方法。这种采用电化学方法的检测方法已经公开于本发明人设计出的专利第2573443号中，其内容也纳入本文供参考。根据这种电化学方法，通过检测来自固定了探针的电极的电化学信号，可确认靶基因的存在。
但是，在采用电化学方法的基因检测中，在电流检测时会发生背景电流。因此，由电极检测的电流值中包括来自与探针的电流和背景电流。因此，难以从检测结果仅仅提取出来源于探针的电流。

发明内容
本发明的目的在于提供基于与靶碱基序列的相互作用高精度地进行电流检测的碱基序列的检测电极与装置及其检测方法。
按照本发明的一种观点，提供一种碱基序列检测电极，其具备导电性的检测极；第1封阻分子，它以覆盖该检测极表面的方式形成，并降低该检测极表面对插入剂的吸附；靶互补探针，它固定于上述检测极上，并具有与作为检测目的的靶碱基序列互补的碱基序列；导电性的对照极；第2封阻分子，它以覆盖该对照极表面的方式形成，并降低该对照极表面对插入剂的吸附。
按照本发明的另一种观点，提供一种碱基序列检测装置，其具备导电性的检测极；第1封阻分子，它以覆盖该检测极表面的方式形成，并降低该检测极表面对插入剂的吸附；靶互补探针，它固定于上述检测极上，并具有与作为检测目的的靶碱基序列互补的碱基序列；导电性的对照极；第2封阻分子，它以覆盖该对照极表面的方式形成，并降低该对照极表面对插入剂的吸附；减法器，由上述检测极检测的电化学信号减去由上述对照极检测的电化学信号。
另外，按照本发明的另一种观点，提供一种碱基序列检测方法，该方法检测碱基序列检测装置的下述检测极和对照极的电化学信号，所述碱基序列检测装置具备导电性的检测极；第1封阻分子，它以覆盖该检测极表面的方式形成，并降低该检测极表面对插入剂的吸附；靶互补探针，它通过直链状有机分子构成的第1间隔部件固定于上述检测极上，并具有与作为检测目的的靶碱基序列互补的碱基序列；导电性的对照极；第2封阻分子，它以覆盖该对照极表面的方式形成，并降低该对照极表面对插入剂的吸附，并由上述检测极检测的电化学信号减去由上述对照极检测的电化学信号。
附图的简单说明图1是表示本发明的一种实施方式的碱基序列检测装置的总体结构的方框图。
图2A和图2B是表示同一实施方式的检测极和对照极的详细结构的图。
图3是表示同一实施方式的包括检测极和对照极的电极结构的俯视图。
图4是表示同一实施方式的包括检测极和对照极的电极结构的俯视图。
图5是表示同一实施方式的包括检测极和对照极的电极结构的俯视图。
图6是表示同一实施方式的包括检测极和对照极的电极结构的俯视图。
图7是表示同一实施方式的包括检测极和对照极的电极结构的俯视图。
图8是表示同一实施方式的包括检测极和对照极的电极结构的俯视图。
图9是表示同一实施方式的包括检测极和对照极的电极结构的俯视图。
图10是表示同一实施方式的包括检测极和对照极的电极结构的俯视图。
图11是表示同一实施方式的包括检测极和对照极的电极结构的俯视图。
图12是表示同一实施方式的包括检测极和对照极的电极结构的俯视图。
图13是表示同一实施方式的包括检测极和对照极的电极结构的俯视图。
图14是表示同一实施方式的包括检测极和对照极的电极结构的俯视图。
图15是同一实施方式的碱基序列检测装置的运作流程图。
图16是表示同一实施方式的碱基序列检测装置的对照极的变形例的图。
图17是表示以前的碱基序列检测装置的电流测定结果的图。
图18是表示包括对照极的碱基序列检测装置的电流测定结果的图。
图19是表示间隔部件中使用乙二醇分子的碱基序列检测装置的电流测定结果的图。
图20是表示使用巯基辛醇作为封阻分子的碱基序列检测装置的电流测定结果的图。
图21是表示间隔部件中使用直链烷烃分子的碱基序列检测装置的电流测定结果的图。
图22A和图22B是表示不使用间隔部件将靶核酸探针固定的变形例的图。
发明的最佳实施方式以下，参照


本发明的一种实施方式。
图1是表示本发明的一种实施方式的碱基序列检测装置的总体结构的方框图。如图1所示，在电化学池1中设置有检测极2和对照极3。该检测极2和对照极3中的电流分别用恒电位仪40和50检测。得到的电化学信号分别输出到信号处理装置60和70。信号处理装置60和70进行峰电流值的计算等信号处理，并将其信号处理得到的数据输出到减法器80中。
减法器80将由信号处理装置60得到的数据减去由信号处理装置70得到的数据，并将减得的结果输出到计算机90中。
电化学池1、检测极2、对照极3、恒电位仪40和50形成为检测碱基序列的半导体基板101(芯片)。另外，检测极2、对照极3、恒电位仪40和50由半导体芯片的集成电路构成。减法器80可以由该半导体基板101上形成的集成电路来实现，也可以通过和半导体基板101另外设置的计算机或减法器来实现。减法器80可以通过计算机和控制该计算机的软件来实现，也可以通过在ROM等上记录减法处理内容的固件来实现，也可以仅通过硬件来实现。
计算机90只要是任何例如个人计算机等一般能够进行演算处理的计算机均可。计算机90具备通信接口91、CPU 92以及显示装置93。通信接口91接受来自减法器80的减法计算结果，并输入CPU 92。CPU 92使减法计算结果显示于显示装置93上。
图2A和图2B是表示检测极2和对照极3的详细结构的图。图2A表示检测极2的详细结构，图2B表示对照极3的详细结构。
如图2所示，封阻分子21以覆盖检测极2表面的方式形成。封阻分子21由与检测极2表面相比单位面积对插入剂的吸附小的分子构成。具体而言，例如由巯基己醇与巯基辛醇等构成。检测极2不必被完全覆盖，至少检测极2表面的一部分被覆盖即可。这样，通过采用封阻分子21覆盖检测极2表面的结构，可降低检测极2表面对插入剂分子的吸附。
封阻分子21并非特定地限于上述物质，优选列如直链的烷烃、烯烃、炔烃、醚、酯、酮类，而且也可以是这些分子通过氧、氮、硫等原子结合成数个链状得到的分子。更优选作为官能团向其中导入烷基、羟基、羧基、磺基、硝基、苯基、氨基、巯基、卤素中难以与插入剂分子相互作用的官能团的分子。另外，优选使这些封阻分子21通过巯基、氨基等吸附在检测极2表面，制作自身组织单分子膜。此外，也可以形成无机氧化物层、高分子层等。
另外，间隔部件22的末端固定在未形成该封阻分子21的检测极2表面。该间隔部件22由与检测极2表面相比单位面积对插入剂的吸附少的材料构成。具体而言，间隔部件22由直链状有机分子构成，例如乙二醇。间隔部件22的材料没有特别的限定，优选例如直链的烷烃、烯烃、炔烃、醚、酯、酮类，而且也可以是这些分子通过氧、氮、硫等原子结合成数个链状得到的分子。
而且，靶互补核酸探针23固定在该间隔部件22的其它末端。靶互补核酸探针23是由具有与作为检测目的的靶核酸序列互补的碱基序列的核酸构成的探针。这样，用靶互补核酸探针23通过间隔部件22固定在检测极2上的结构，可提高试样与靶互补核酸探针23的结合效率。
以前，插入剂分子对间隔部件相互作用，成为导致背景电流增加的原因，但是象本实施方式这样，作为间隔部件22的构成，通过选择难以相互作用的插入剂分子，可减少背景电流。背景电流是指配置于检测极2的靶互补核酸探针23与插入剂的相互作用引起的电流以外的杂波等原因的电流。该背景电流包括例如检测极2表面与插入剂的相互作用、封阻分子21与插入剂的相互作用、间隔部件22与插入剂的相互作用引起的电流。靶互补核酸探针23与插入剂的相互作用引起的电流称为探针电流。
使用上述直链状有机分子构成的靶互补核酸探针23时，背景电流几乎仅仅是插入剂对检测极2表面相互作用引起的电流。因此，下述对照极3的结构非常优选仅由封阻分子层构成。作为具有这种效果的间隔分子，例如1个或多个乙二醇连结的直链状分子。此外，只要是不与插入剂分子相互作用的分子，其材料并没有限定。
如图2B所示，对照极3上，封阻分子31以覆盖对照极3表面的方式形成。该封阻分子31优选与覆盖检测极2表面的封阻分子21相同的材料构成，但只要是显示类似性质分子，并没有特别限定。可以不完全覆盖对照极3，至少覆盖对照极3表面的一部分即可。这样，通过采用与封阻分子21相同材料的封阻分子31覆盖对照极3表面的结构，能够降低检测极2表面对插入剂分子的吸附，同时也能够使降低对检测极2和对照极3双方的背景电流的影响的效果相同。
图3～图14是这种包括检测极2和对照极3的电极结构的俯视示意图。如图3～图14所示，电极的种类除检测极2和对照极3以外，还有对极4和参照极5。这些检测极2、对照极3、对极4和参照极5由导电性材料构成，均设置在电化学池1内。在设置有这些检测极2、对照极3、对极4和参照极5的电化学池1中，填充具有为使固定在检测极2或对照极3上的探针之间进行杂交的检体碱基序列的试样、插入剂和缓冲液等，进行电化学反应。
检测极2和对照极3是用于检测池1内的反应电流的电极。
在检测极2上具有与靶碱基序列互补的靶互补碱基序列的DNA探针固定，检测靶互补核酸探针与插入剂之间的相互作用引起的探针电流。
对照极3是用于检测杂波等背景电流，之后由检测极2检测的电流减去该背景电流，从而降低杂波等的影响的电极。对照极3用于不固定探针，或者如下述图16所示用于固定伪探针(Dummy probe)。
对极4是在检测极2或对照极3之间施加所定的电压向池1内供给电流的电极。
参照极5是为了将参照极5和检测极2或者参照极5和对照极3之间的电压控制在所定的电压特性，使其电极电压向对极4负反馈的电极。通过该参照极5，控制对极4产生的电压，不受池1内的各种检测条件左右，进行精度高的氧化电流检测。
图3由检测极2、对极4和参照极5构成的检测极侧3电极系31，以及对照极3、对极4和参照极5构成的对照极侧3电极系32构成。
检测极侧3电极系31对于圆形检测极2留出所定的间隔，设置在所定的方向上具有长边方向的长方形对极4。另外，对于检测极2留出所定的间隔，设置在与对极4的长边方向几乎垂直的方向上具有长边方向的长方形参照极5。虽然表示了检测极2和对极4的距离以及检测极2和参照极5的距离几乎相等地进行设置的实例，但是并不限于此，也可以按不同的距离进行设置。
对照极侧3电极系32具有将检测极侧3电极系31的检测极2更换为对照极3而成的结构。以这些3电极系31或32作为1组电极系，连接恒电位仪40或50。
图4是基于图3的电极结构构成的更具体的电极结构例。如图4所示，与图3所示同样的3电极系31和32交替矩阵设置。图4中，表示在列方向上并列相同的3电极系，在行方向上交替设置不同的3电极系的实例，但是也可以在行方向上设置相同的3电极系，在列方向上交替设置不同的3电极系。另外，也可以行方向和列方向上均交替设置不同的3电极系。这时，在矩阵的斜方向上并列设置相同的3电极系。
图5表示与图3同一形状的电极的其他配置例。对于长方形的对极4长边方向相同的参照极5夹持对极4，以相等的间隔进行设置。对极4和一个参照极5之间设置有对照极3，而且在该参照极5的与设有对照极3的一侧相反的另一侧设置检测极2。另外，对照极3和另一个参照极5之间设有检测极2，而且该参照极5的与设有对照极3的一侧相反的另一侧设置对照极3。对极4或参照极5与检测极2或对照极3的距离为等间隔。另外，检测极2和对照极3夹持参照极5设置在对称的位置。而且，检测极2和对照极3夹持对极4设置在对称的位置。
图6是基于图5的电极结构构成的更具体的电极结构例。如图6所示，具有与图5所示同样的电极结构，但是检测极2和对照极3沿着对极4与参照极5的长边方向以等间隔设置数个，分别构成检测极组20和对照极组30。另外，检测极2或对照极3夹持参照极5或对极4设置在对称的位置。设置在对称位置的检测极2和对照极3都是作为减法计算对象的电极。也就是说，对于参照极5在对称位置设置的检测极2或对照极3、该参照极5以及靠近其检测极2或对照极3设置的对极4构成3电极系。各检测极2至对极4和参照极5的距离相等，各对照极3至对极4和参照极5的距离相等。该3电极系上连接恒电位仪40或50。1个检测极组20、1个对照极组30、1个对极4和1个参照极5构成的电极组合在与这些电极或电极组的长边方向不同的方向(优选几乎垂直的方向)设置数个。
图7表示与图3或图5同一形状的电极的其他配制例。距对极4的中心附近所定的间隔，设置参照极5，而且对于对极4长边方向几乎垂直。距参照极5所定的间隔设置检测极2，并且在与该检测极2相对于参照极5对称的位置设置对照极3。
图8是基于图7的电极结构构成的更具体的电极结构例。如图8所示，具有与图7所示的同样的电极结构，而且检测极2和对照极3夹持参照极5在对称位置沿着参照极5的长边方向以等间隔设置数个，分别构成检测极组20和对照极组30。对于参照极5设置在对称位置的检测极2和对照极3是作为减法计算对象的电极。也就是说，对于参照极5在对称位置设置的检测极2或对照极3、该参照极5以及与参照极5垂直设置的对极4构成3电极系。该3电极系上连接恒电位仪40或50。各检测极2至参照极5的距离相等，各对照极3至参照极5的距离相等。
图9表示与图3、5和7同一形状的电极的其他设置例。设置距对极4所定的间隔，且以与对极4的长边方向几乎平行具有长边方向参照极51、52。在其一个参照极51和对极4之间设置检测极2，在另一个参照极52和对极4之间设置对照极3。参照极51对于检测极2以及对于对极4的位置关系，与参照极52对于对照极3以及对于对极4的位置关系相等。检测极2以及与该检测极2相应设置的参照极51的组称为检测极侧电极组510，对照极3以及与该对照极3相应设置的参照极52的组称为对照极侧电极组520。一个检测极侧电极组510与对极4构成3电极系，其上连接恒电位仪40。一个对照极侧电极组520与对极4构成3电极系，其上连接恒电位仪50。
图10是基于图9的电极结构构成的更具体的电极结构例。如图10所示，具有与图9所示同样的电极结构，是检测极侧电极组510在列方向上以等间隔设置数个，对照极侧电极组520在列方向上以等间隔设置数个，这些电极组在行方向上都交替设置的矩阵机构。这些电极组510、520分别与对极4构成3电极系，其上连接恒电位仪40或50。另外，表示了列方向上设置同一电极组的实例，也可以采用列方向上交替设置检测极侧电极组510和对照极侧电极组520的结构。另外，表示了行方向和列方向几乎垂直的情况，但是并不限于此，列方向也可以对于行方向具有不垂直的角度。
图11是表示与图3、5、7和9同一形状的检测极2和对照极3，以及圆形的对极4和圆环形状的参照极5构成的电极结构的一例的图。如图11所示，设置以圆形对极4的中心为中心圆环形状的参照极5，使之包围对极4。而且，在对于对极4对称的位置，即距参照极5的外周给定间隔，设置检测极2和对照极3。
图12是基于图11的电极结构构成的更具体的电极结构例。如图12所示，具有与图11所示同样的电极结构，而且检测极2和对照极3对于对极4在对称位置设置数个。另外，由于数个检测极2和数个对照极3分别设置在距对极4相同的位置，因此形成在以对极4为中心的圆周400上交替设置数个检测极2和对极3的结构。对于对极4在对称位置上的检测极2和对照极3可以作为减法计算的对象，相邻检测极2和对照极3也可以作为减法计算的对象。
图13是表示与图3、5、7和9同一形状的检测极2和对照极3，以及正方形的对极4和十字形状的参照极5构成的电极结构的一例的图。如图13所示，设置长边方向几乎互相垂直交叉的2个长方形电极重叠构成的十字形状的参照极5。在通过该参照极5的十字划分的4个区域，距参照极5所定的间隔，分别各设置1个对极4。另外，在这4个区域中，2个区域分别各设置1个检测极2，另外2个区域分别设置1个对照极3。这些检测极2和对照极3设置在与对极4相比远离参照极5的位置。参照极5至各对极4的距离相等，另外参照极5至各检测极2和各对照极3的距离相等。
图14是基于图13的电极结构构成的更具体的电极结构例。如图14所示，对极4和参照极5的构成与图13相同。该图14的情况，在通过参照极5划分的4个区域401～404中，分别设置数个检测极2，或者分别设置数个对照极3。更具体地说，在相邻的区域401和404设置数个检测极2，在相邻的区域402和403设置数个对照极3。与参照极5的间隔相等的检测极2和对照极3都成为减法计算的对象。另外，4个区域401～404中至少1个区域设置检测极2，且至少1个区域设置对照极3。因此，可以3个区域设置检测极2，也可以仅1个区域设置检测极2。另外，虽然表示了对极4在各区域分别设置1个，共计4个的情况，但是也可以在各区域设置2个以上的对极4。另外，也可以在1个区域混合设置检测极2和对照极3。
以上所示的图3～图14的电极设置只不过是一个个例，可以对各电极的形状、大小、位置关系等进行各种改变。图3～图14所示的电极结构可以设置在1个半导体和玻璃等基板上。因此，检测极2与对照极3设置在同一基板内。检测极2可以是1个也可以是数个。对照极3可以是1个，也可以是数个。另外，对于检测极2成为减法计算对象的对照极3可以是1个，也可以是数个。另外，对于对照极3成为减法计算对象的检测极2可以是1个，也可以是数个。当然，也可以将各电极设置在不同的基板上。
下面，按照图15的流程图说明上述碱基序列检测装置的运作。
首先，在电化学池1内设置检测极2和对照极3，在池1内填充含有作为检查对象的核酸的试样(检体溶液)。接着，将池1保持在所定的温度，促进试样与固定在检测极2上的靶互补核酸探针的杂交反应。杂交反应结束后，由池1内运出试样，用缓冲剂填充后，用插入剂填充池1内。在该填充了插入剂的池1内的检测极2和对照极3与对极4之间，在参照极5产生的电压的反馈下，施加所定的电压，分别通过检测极2和对照极3同时进行，由恒电位仪40和50进行电化学测定(s1)。
接着，检测通过电化学测定得到的检测极2和对照极3的电流值的峰电流值(s2)。这种峰电流值的检测用检测极2和对照极3双方同时进行。峰电流值的检测用信号处理装置60和70进行。信号处理装置60和70提取由恒电位仪40和50得到的电流波形或对电流波形进行电流电压转换得到的电压波形的峰值。另外，得到的峰电流值可以进行A/D转换，而且也可以在进行数个检测极2和数个对照极3的平均值计算等统计处理后得到。得到的峰电流值输出到减法器80中。
减法器80由检测极2的峰电流值减去对照极3的峰电流值(s3)。检测极2的峰电流值以插入剂分子对靶互补核酸探针相互作用引起的探针电流，加上作为不需要的杂波检测的背景电流得到的电流为基础得到。作为背景电流，包括检测极2表面与插入剂分子相互作用引起的电流值，以及插入剂分子对连接核酸探针部分和基板表面的间隔部件22相互作用引起的电流值对照极3的峰电流值基于作为不需要的杂波检测的背景电流得到。因此，通过减法计算可减去背景电流产生的电流值，能够检测探针产生的电流。
减法器80将减法计算结果输出到计算机90中。计算机90将减法计算结果显示于显示装置93上。操作者可根据该显示的减法计算结果，确定试样中含有的碱基序列。当然，也可以设计基于减法计算结果判断有无试样中含有的碱基序列等的判断回路，将其判断结果显示于显示装置93上。
按照本实施方式，在本发明中，除了作为检测极2的以前的基因检测电极以外，还具备作为对照极3的仅能够检测背景电流的电极。检测两电极2、3的电流值后，在基板上的集成电路上进行演算，由检测极2的电流值减去对照极3的电流值，能够检测除去了背景电流的仅仅来源于靶基因的电流值。由于封阻分子以覆盖检测极2和对照极3表面的方式形成，可降低电极表面与插入剂的相互作用产生的背景电流的影响。另外，通过使用直链状有机分子作为间隔部件，可大幅度降低间隔引起的背景电流。因此，对照极3即使不设置探针，也几乎不会产生有无间隔引起的背景电流的差异。因此，省略了固定间隔和探针的手续。
在以前的电流检测型基因检测方法中，难以仅提取出来自靶基因的电流值进行解析。特别是在判断一碱基多态性时，由于非特异性杂交的基因，电流值增加，难以判明背景电流，但是按照本实施方式，能够解决这一课题。
本发明并不局限于上述实施方式。
检测极2上固定的探针使用具有与靶碱基序列互补的碱基序列的靶互补碱基序列的探针，但是并不局限于此。例如也可以使用具有一个碱基或数个碱基与靶互补碱基序列不同的碱基序列，与靶碱基序列的互补性比靶互补碱基序列低的探针(以下称为靶准互补核酸探针)。另外，也可以将靶互补核酸探针和靶准互补核酸探针双方都固定于检测极进行使用。
另外，在上述实施方式中，说明了对照极3表面覆盖封阻分子31，未设置间隔和探针的实例，但是并不局限于此。图16是表示图2B所示对照极3的变形例的图。该变形例涉及的对照极300通过封阻分子31固定直链状有机分子构成的间隔部件301的末端。该间隔部件301由与检测极2上设置的间隔部件22同样的材料构成。
在间隔部件301的另一未端固定伪探针302。伪探针302是由不具有与靶核酸序列互补的碱基序列，具有非互补的碱基序列的核酸构成的探针。
因此，在对照极3侧也可以通过间隔固定探针。这样，检测极2侧的间隔部件22引起的背景电流可以用对照极3侧的电流减去。
另外，说明了在检测极2侧，通过间隔部件22在检测极2上固定靶核酸探针23的实例，但是并不局限于此。例如也可以如图22A和图22B所示，将靶核酸探针23不通过间隔部件22固定于检测极2上。
另外，在图1中没有特别表示，计算机90可以自动控制半导体基板101上形成的各回路。这时，计算机90通过通信接口91输出用于控制恒电位仪40、50、信号处理装置60、70、减法器80的运作的控制指令。这些各回路基于收到的控制指令进行运作，并将运作结果和演算结果传输给计算机90。这样，能够使碱基序列的检测自动化。另外，图1表示了在半导体基板101上设置信号处理装置60、70和减法器80的情况，但是也可以在计算机90侧实现与其相同的功能。这时，恒电位仪40和50的输出信号传输至计算机90，在计算机90侧进行信号处理和减法计算处理。
以上说明的本发明可基于与靶碱基序列的相互作用高精度地进行电流的检测。
实施例以下，说明本发明的碱基序列检测装置的更具体的实施例。
在下述实施例中，说明上述本实施方式的实施例和为和这些实施例进行比较的现有例。
(现有例)在本现有例中，不使用对照极3，进行核酸的检测。作为检测极2，使用检测极201、202和203的3个Au电极。试样核酸使用具有序列号1的MxA蛋白质的启动子区域。
(1)核酸探针在Au电极表面的固定以上述试样核酸作为靶核酸。作为具有与该靶核酸的序列号1互补的序列2的探针，在含有单链核酸探针10μM的溶液中将检测极201浸渍1小时。从而，进行靶互补核酸探针211在检测极201上的固定。同样，分别在检测极202和203上分别固定具有一个碱基与靶核酸互补的碱基序列不同的序列3、4的单链核酸探针(以下称为靶准互补核酸探针212、213)。这些单链核酸探针211～213通过20个碱基(胞嘧啶)构成的间隔分别固定在检测极201～203上。接着，通过在1mM巯基己醇水溶液中浸渍检测极201～203，将靶互补核酸探针211与靶准互补核酸探针212和213未固定的部分封阻。
(2)使用核酸探针固定化表面的试样核酸的检测试样核酸提取后通过PCR进行扩增。在含有该试样核酸的2×SSC溶液中，浸渍(1)制作的检测极201～203，在35℃下培养60分钟，进行退火反应。之后，用0.2×SSC溶液洗涤。再将检测极201～203和对照极3在含有插入剂，即50μMヘキスト33258溶液的溶液中浸渍15分钟后，测定ヘキスト33258分子的氧化电流应答。电流测定的结果如图17所示。与检测极201相比，检测极202和203的电流值低，但是分别不出与背景电流的区别。
(实施例1)在本实施例1中，使用对照极3，进行与现有例同样的核酸检测。作为检测极2，使用检测极201、202和203的3个Au电极。试样核酸使用具有序列号1的MxA蛋白质的启动子区域。
(1)核酸探针在Au电极表面的固定以上述试样核酸作为靶核酸。在含有具有与该靶核酸互补的序列2的单链核酸探针10μM的溶液中将检测极201浸渍1小时，进行靶互补核酸探针211的固定。同样，分别在检测极202和203上固定具有一个碱基与序列2不同的序列3、4的单链靶准互补核酸探针。再在对照极3上固定具有与序列2不互补的序列5的单链核酸探针(以下称为靶非互补核酸探针)。单链核酸探针通过20个碱基(胞嘧啶)构成的间隔部件固定在电极上。接着，通过在1mM巯基己醇水溶液中浸渍检测极201～203和对照极3，这样将核酸探针未固定的部分封阻。
(2)使用核酸探针固定化表面的试样核酸的检测试样核酸提取后通过PCR进行扩增。在含有该试样核酸的2×SSC溶液中，浸渍(1)制作的检测极201～203和对照极3，在35℃下培养60分钟，进行退火反应。之后，用0.2×SSC溶液洗涤。再将检测极201～203和对照极3在含有插入剂，即50μMヘキスト33258溶液的溶液中浸渍15分钟后，测定ヘキスト33258分子的氧化电流应答。电流测定后，用减法器除去背景电流。除去后的结果如图18所示。检测极202几乎没有来自作为检测目的的基因的电流值，表明能够明确判断1个碱基的差异。另一方面，可知检测极203非特异性地与作为目的的基因杂交。通过该实施例1，可以得知使用对照极3进行基因检测可提取出仅来自目的基因的电流。
(实施例2)在现有例1和实施例1中，核酸探针的间隔部件使用容易与插入剂分子相互作用的碱基序列。因此，在对照极3上也固定核酸探针。在该实施例2中，核酸探针的间隔部件使用与插入剂分子不相互作用的乙二醇分子。试样核酸使用具有序列号1的MxA蛋白质的启动子区域。
(1)核酸探针在Au电极表面的固定以上述试样核酸作为靶核酸。在含有10μM具有与该靶核酸互补的序列2的单链靶互补核酸探针211的溶液中将检测极201浸渍1小时，进行核酸探针的固定。同样，分别在检测极202和203上固定具有一个碱基与靶核酸不同的序列3、4的单链靶准互补核酸探针212和213。对照极3上不固定单链核酸探针。单链核酸探针211～213通过30个乙二醇分子构成的间隔固定在各电极上。接着，通过在1mM巯基己醇水溶液中浸渍检测极201～203和对照极3，将核酸探针未固定的部分封阻。
(2)使用核酸探针固定化表面的试样核酸的检测试样核酸提取后通过PCR进行扩增。在含有该试样核酸的2×SSC溶液中，浸渍(1)制作的检测极201和202以及对照极3，在35℃下培养60分钟，进行退火反应。之后，用0.2×SSC溶液洗涤。再将检测极201和202以及对照极3在含有插入剂，即50μMヘキスト33258溶液的溶液中浸渍15分钟后，测定ヘキスト33258分子的氧化电流应答。电流测定后，用减法器除去背景电流。除去后的结果如图19所示。检测极202几乎没有来自作为检测目的的基因的电流值，表明能够明确判断1个碱基的差异。另一方面，可知检测极203非特异性地与作为目的的基因杂交。通过该实施例2，可以得知使用乙二醇作为固定在检测极2上的核酸探针的间隔，能够不在对照极3上固定核酸探针仅通过封阻分子构成。
(实施例3)在本实施例3中，使用与现有例、实施例1和2不同的封阻分子。核酸探针的间隔部件使用5个乙二醇分子结合得到的分子。试样核酸使用具有序列号1的MxA蛋白质的启动子区域。
(1)核酸探针在Au电极表面的固定以上述试样核酸作为靶核酸。在含有10μM具有与该试样核酸互补的序列2的单链靶互补核酸探针211的溶液中将检测极201浸渍1小时，进行核酸探针的固定。同样，分别在检测极202和203上固定具有一个碱基与使用核酸不同的序列3、4的单链靶准互补核酸探针212和213。在对照极3上不固定单链核酸探针。单链核酸探针211～213通过30个乙二醇分子构成的间隔固定在电极上。接着，通过在1mM巯基辛醇水溶液中浸渍检测极201～203和对照极3，将核酸探针未固定的部分封阻。
(2)使用核酸探针固定化表面的试样核酸的检测试样核酸提取后通过PCR进行扩增。在含有该试样核酸的2×SSC溶液中，浸渍(1)制作的检测极201～203和对照极3，在35℃下培养60分钟，进行退火反应。之后，用0.2×SSC溶液洗涤。再将检测极201～203和对照极3在含有插入剂，即50μMヘキスト33258溶液的溶液中浸渍15分钟后，测定ヘキスト33258分子的氧化电流应答。电流测定后，用减法器除去背景电流。除去后的结果如图20所示。检测极202几乎没有来自作为检测目的的基因的电流值，表明能够明确判断1个碱基的差异。另一方面，可知检测极203非特异性地与作为目的的基因杂交。
(实施例4)在本实施例4中，核酸探针的间隔部件使用直链烷烃分子。试样核酸使用具有序列号1的MxA蛋白质的启动子区域。
(1)核酸探针在Au电极表面的固定以上述试样核酸作为靶核酸。在含有10μM具有与该试样核酸互补的序列2的单链靶互补核酸探针211的溶液中将检测极201浸渍1小时，进行核酸探针211在检测极201上的固定。同样，分别在检测极202和203上固定具有一个碱基与试样核酸不同的序列3、4的单链靶准互补核酸探针212和213。在对照极3上不固定单链核酸探针。单链靶互补核酸探针211以及靶准互补核酸探针212和213通过碳原子数96个的直链烷烃分子构成的间隔固定在电极上。接着，通过在1mM巯基己醇水溶液中浸渍检测极201～203和对照极3，将核酸探针未固定的部分封阻。
(2)使用核酸探针固定化表面的试样核酸的检测试样核酸提取后通过PCR进行扩增。在含有该试样核酸的2×SSC溶液中，浸渍(1)制作的检测极201～203和对照极3，在35℃下培养60分钟，进行退火反应。之后，用0.2×SSC溶液洗涤。再将检测极201～203和对照极3在含有插入剂，即50μMヘキスト33258溶液的溶液中浸渍15分钟后，测定ヘキスト33258分子的氧化电流应答。电流测定后，用减法器除去背景电流。除去后的结果如图21所示。检测极202几乎没有来自检测目的基因的电流值，表明能够明确判断1个碱基的差异。通过该实施例4，可以得知使用直链烷烃分子作为核酸探针的间隔，能够不在对照极3上固定核酸探针仅通过封阻分子构成。
附加的优点和改变可以由擅长该技术的人容易地想到。因此，这种更广泛的观点上的本发明，并不限于这里说明的具体详细内容和代表性的实施方式。因此，不脱离后附权利要求及其等同物定义的一般发明概念的精神或视野，可以进行各种改变。
工业实用性以上说明的本发明在用于检测碱基序列的检测电极的技术领域、用于检测碱基序列的检测装置的技术领域以及用于检测碱基序列的检测方法的领域是有效的。
序列表1/3序列表<110>株式会社东芝冈田纯桥本幸二高桥匡庆<120>碱基序列检测电极、碱基序列检测装置以及碱基序列检测方法<130>02S1026P<150>JP 2002-244018<151>2002-8-23<160>5<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>121<212>DNA<213>人类<400>1ggcctccgct ctcgcttcgc ctctttcacc ccgcgcccag ccccgccccg cgccgcgaag 60aaatgaaact cacagaccct gtgctgaggg cggctccggg cgcagaaacg aaacctagct 120c 121
2/3<210>2<211>15<212>DNA<213>人类<400>2gtttctgcgc ccgga 15<210>3<211>15<212>DNA<213>人类<400>3gtttctgcac ccgga 15<210>4<211>15<212>DNA<213>人类<400>4gtttctgctc ccgga 15
3/3<210>5<211>15<212>DNA<213>大肠杆菌<400>5gacctgcttc tgact 1权利要求
1.碱基序列检测电极，其特征在于，具备导电性的检测极；第1封阻分子，它以覆盖该检测极表面的方式形成，并降低该检测极表面对插入剂的吸附；靶互补探针，它固定于上述检测极上，并具有与作为检测目的的靶碱基序列互补的碱基序列；导电性的对照极；第2封阻分子，它以覆盖该对照极表面的方式形成，并降低该对照极表面对插入剂的吸附。
2.如权利要求1所述的碱基序列检测电极，其特征在于，上述靶互补探针通过直链状有机分子构成的第1间隔部件固定在上述检测极上。
3.如权利要求1所述的碱基序列检测电极，其特征在于，还具备伪探针，所述伪探针通过直链状有机分子构成的第2间隔部件固定在上述对照极上，且具有与作为检测目的的靶碱基序列不互补的碱基序列。
4.碱基序列检测装置，其特征在于，具备导电性的检测极；第1封阻分子，它以覆盖该检测极表面的方式形成，并降低该检测极表面对插入剂的吸附；靶互补探针，它固定于上述检测极上，并具有与作为检测目的的靶碱基序列互补的碱基序列；导电性的对照极；第2封阻分子，它以覆盖该对照极表面的方式形成，并降低该对照极表面对插入剂的吸附；减法器，它由上述检测极检测的电化学信号减去由上述对照极检测的电化学信号。
5.如权利要求4所述的碱基序列检测装置，其特征在于，上述靶互补探针通过直链状有机分子构成的第1间隔部件固定在上述检测极上。
6.如权利要求4所述的碱基序列检测装置，其特征在于，具备第1恒电位仪，它用于在上述检测极和对峙设置的第1对极之间施加给定电压，检测来自上述检测极的电化学信号；第1信号处理装置，它对第1恒电位仪的输出进行信号处理，并输出到上述减法器中；第2恒电位仪，它在上述对照极和对峙设置的第2对极之间施加给定电压，检测来自上述对照极的电化学信号；第2信号处理装置，它对第2恒电位仪的输出进行信号处理，并输出到上述减法器中。
7.如权利要求4所述的碱基序列检测装置，其特征在于，还具备显示上述减法器的减法计算结果的显示装置。
8.如权利要求7述的碱基序列检测装置，其特征在于，上述检测极、对照极和减法器在同一基板上形成，上述减法器和上述显示装置通过计算机由信号线连接。
9.如权利要求4所述的碱基序列检测装置，其特征在于，进一步具有伪探针，所述伪探针通过直链状有机分子构成的第2间隔部件固定在上述对照极上，且具有与作为检测目的的靶碱基序列不互补的碱基序列。
10.如权利要求4所述的碱基序列检测装置，其特征在于，以下述检测极侧3电极系和下述对照极侧3电极系的组以矩阵状设置数个，具备下述电极构成的检测极侧3电极系上述检测极；第1对极，它距上述检测极间隔第1距离进行设置，用于在与上述检测极之间施加所定的电压；第1参照极，它距上述检测极间隔第2距离进行设置，用于使检测的电压向第1对极负反馈，以及下述电极构成的对照极侧3电极系上述对照极；第2对极，它距上述对照极间隔第1距离进行设置，用于在与上述对照极之间施加所定的电压；第2参照极，它距上述检测极间隔第2距离进行设置，用于使检测的电压向第2对极负反馈。
11.如权利要求4所述的碱基序列检测装置，其特征在于，还具备上述检测极在第1方向上以等间隔设置数个而成的检测极组；距上述检测极组间隔所定的距离进行设置，并在第1方向上具有长边方向的参照极；距上述参照极间隔所定的距离进行设置，并上述对照极在第1方向上以等间隔设置数个而成的对照极组；距上述对照极组间隔所定的距离进行设置，并在第1方向上具有长边方向，用于在上述各个检测极以及上述各个对照极之间施加给定电压的对极。
12.如权利要求4所述的碱基序列检测装置，其特征在于，还具备上述检测极在第1方向上以等间隔设置数个而成的检测极组；上述对照极在第1方向上以等间隔设置数个而成的对照极组；距上述检测极组和上述对照极组间隔所定的距离进行设置，并在第1方向上具有长边方向，用于向上述各个检测极施加所定的电压的对极；距上述检测极组、对照极组和对极间隔所定的距离进行设置，并在与第1方向几乎垂直的第2方向上具有长边方向，用于使检测的电压向上述对极负反馈的参照极。
13.如权利要求4所述的碱基序列检测装置，其特征在于，还具备检测极侧电极组，它由上述检测极、距上述检测极间隔第1距离进行设置的第1参照极构成；对照极侧电极组，它由上述对照极、距上述对照极间隔第1距离进行设置的第2参照极构成；对极，它在第1方向上具有长边方向，用于在上述各个检测极以及上述各个对照极之间施加所定的电压，且上述检测极侧电极组和上述对照极侧电极组在第1方向以及与第1方向不同的第2方向上以矩阵状设置。
14.如权利要求4所述的碱基序列检测装置，其特征在于，还具备用于向上述检测极和上述对照极施加给定电压的圆形对极；距上述对极间隔所定的距离进行设置以围绕上述对极的圆环状参照极，且上述检测极和对照极在以上述对极为中心的圆周上交替设置数个。
15.如权利要求4所述的碱基序列检测装置，其特征在于，还具备第1部件和第2部件构成的参照极，第1部件在第1方向上具有长边方向，第2部件在与第1方向几乎垂直的方向上具有长边方向，且与第1部件在第1交点交叉4个对极，它们分别设置在上述参照极划分的4个区域，且距第1交点间隔第1距离，且上述检测极设置在上述4个区域中的至少1个区域内，距第1交点间隔比第1距离长的距离，设置数个，上述对照极设置在上述4个区域中的至少1个区域内，距第1交点间隔比第1距离长的距离，设置数个。
16.如权利要求4所述的碱基序列检测装置，其特征在于，上述对照极设置在上述4个区域中没有设置上述检测极的区域内，上述检测极设置在上述4个区域中没有设置上述对照极的区域内。
17.碱基序列检测方法，其特征在于，检测碱基序列检测装置的下述检测极和对照极的电化学信号，所述碱基序列检测装置具备导电性的检测极；第1封阻分子，它以覆盖该检则极表面的方式形成，并降低该检测极表面对插入剂的吸附；靶互补探针，它通过直链状有机分子构成的第1间隔部件固定于上述检测极上，并具有与作为检测目的的靶碱基序列互补的碱基序列；导电性的对照极；第2封阻分子，它以覆盖该对照极表面的方式形成，并降低该对照极表面对插入剂的吸附，由上述检测极检测的电化学信号减去由上述对照极检测的电化学信号。
18.如权利要求17所述的碱基序列检测方法，其特征在于，上述靶互补探针通过直链状有机分子构成的第1间隔部件固定在上述检测极上。
19.如权利要求17所述的碱基序列检测方法，其特征在于，还具备伪探针，所述伪探针通过直链状有机分子构成的第2间隔部件固定在上述对照极上，且具有与作为检测目的的靶碱基序列不互补的碱基序列。
20.如权利要求17所述的碱基序列检测方法，其特征在于，将上述减法计算结果在计算机具备的显示装置上显示。
全文摘要
碱基序列的检测电极，具备导电性的检测极(2)；封阻分子(21)，它以覆盖该检测极(2)表面的方式形成，并降低该检测极(2)表面对插入剂的吸附；靶互补核酸探针(23)，它通过直链状有机分子构成的间隔部件(22)固定于上述检测极(2)上，并具有与作为检测目的的靶碱基序列互补的碱基序列；导电性的对照极(3)；封阻分子(31)，它以覆盖该对照极(3)表面的方式形成，并降低该对照极(3)表面对插入剂的吸附。
文档编号G01N27/327GK1531651SQ0280013
公开日2004年9月22日 申请日期2002年8月28日 优先权日2002年8月23日
发明者冈田纯, 桥本幸二, 高桥匡庆, 二, 庆 申请人:株式会社东芝