专利名称：自身抗体的互补式亲和层析纯化方法
技术领域：
本发明是一种以互补式免疫亲和层析为主要创新点的特异性纯化自身抗体 的技术方案，尤其适用于对组织细胞中因组成成份较多而不适宜于用基因工程表 达和单克隆抗体亲和层析获得的自身抗原的多克隆抗体纯化，属于抗原抗体制备 和检测的免疫学技术领域。
背景技术：
在很多人的体内存有自身抗原，它们种类繁多，可以剌激机体免疫系统发生 免疫反应，产生针对自身抗原的抗体和致敏淋巴细胞，由此而引起很多的自身免 疫性疾病。如何从机体的组织细胞或体液中提取纯化这些自身抗原，在技术上一 直有难度，主要问题是获得的抗原特异性不高，不易剔除机体的其他正常组织成 分，因此利用这些自身抗原制作试剂盒检测特异性自身抗体时普遍存有很高的非 特异性反应，即假阳性较多。如何从机体血清中特异性地纯化这些自身抗原的抗 体就更加困难，尤其是针对那些组成成份众多的自身抗原的抗体。由于难以获得 特异性和纯度很高的自身抗体的标准品，自身抗体的定量检测就很难进行，因此 目前国内外绝大多数自身抗体的定量检测试剂盒都只能半定量，以相对单位数作 为机体体液中自身抗体的相对含量，而且各厂家自行定义各自的相对单位数，互 不可比。例如，不孕育症占我国已婚夫妇的8-15%，其中很多夫妇是因为机体对精子 抗原和子宫内膜抗原等发生了免疫反应，产生的抗精子抗体和抗子宫内膜抗体能 破坏精子和子宫内膜导致不孕，因此检测这些自身抗体的有无和含量是不孕症诊 断和疗效观察的重要指标。但是，检测抗体必须要有特异性的抗原。如何纯化精子抗原、子宫内膜抗原等自身抗原呢？近年来国内外文献报道的方法主要有超 声波粉碎、反复冻融破碎精子细胞或子宫内膜细胞等物理方法；化学试剂如LTS、DTT、 NP-40及Triton X-100等化学萃取法或胶原酶消化法；基因克隆表达单种 精子抗原以及利用单克隆抗体制备亲和层析柱的纯化法等。 后两种方法纯化所得抗原的特异性最高，但是缺点也非常明显。基因工程技 术只能克隆表达单一组分的抗原，而很多自身抗原的组成成份繁多，如精子抗原 多达100余种，子宫内膜抗原也种类众多，用基因克隆表达的仅包括极少数组分 的抗原来检测机体内的抗精子抗体和抗子宫内膜抗体极易导致漏检，因而离实际 应用尚远；另一个缺点是很多自身抗原从基因到蛋白质序列都不清楚，不能进行 基因克隆表达。利用单克隆抗体制备亲和层析柱进行亲和层析，同样也 只能纯化单一组分的自身抗原，而且需要制备单克隆抗体。单抗的制备不但技术 繁杂，很多时候无法用含有目的抗原的机体组织细胞或体液作为靶抗原进行单克 隆抗体的筛选，从而无法得到单抗，也因此很多自身抗原无法通过单抗的亲和层 析法来纯化。物理法和化学法提取的自身抗原纯度较差，极难清除与机体血清中 其他成分的非特异性反应。在自身抗体的纯化方面，国内少有报道，国外主要是制备针对基因工程表达 的自身抗原的单克隆抗体。这些单克隆抗体的克隆数有限，大多用于科研中。象 其他任何抗体的定量检测一样，抗精子抗体的定量检测也需要有抗精子抗体的标 准品。但是人类精子抗原多达数百种，而且大多数未能进行基因确定和克隆表达， 因此无法利用基因重组抗原筛选出如此众多的单克隆或多克隆抗体。不同抗原成 份诱导产生的抗体，其亲和力差异很大。即使能获得少数几种基因重组精子抗原， 其对应的单克隆抗体或者几种单抗的混合物只能与精子的极少数抗原决定簇结 合，因此它们在与固相载体上包被的成份和决定簇均相当复杂的抗原结合时，机 率很小，同时它们的亲和力也不足以代表体内几百种精子抗原的对应抗体的亲和 力。这种亲和力差异将直接导致定量检测结果的不同。相比之下，从抗血清中提 取纯化的人工主动免疫或自然免疫状态下产生的多克隆抗体，因其针对的抗原成 份和决定簇的多样性和随机性，更能代表定量检测中待测标本中抗体与抗原的结 合能力，因此更适合于作为定量检测自身抗体时的抗体标准品。2001年，我们报道了利用两种多克隆抗体制备两种亲和层析柱(A柱和B 柱)，对人精子膜抗原进行互补式亲和层析纯化，获得了纯度很高的精子膜抗原， 制成了抗精子抗体的定性酶标检测试剂盒，经过了南京金陵男科医院、郑州博赛 生物工程公司等4家单位的试用，并参加了东南大学首届科技成果展。(沈传来、 张建琼、贾力敏等。亲和层析纯化精子膜抗原的方法及精子抗体的检测，上海免 疫学杂志，2001; 21: 102-104)。 2002年以后，为了从病人血清或免疫动物血 清中高度特异性地纯化抗精子抗体，以进一步制备抗精子抗体定量检测试剂盒， 我们开始改进精子抗原的纯化方案，并在此基础上进一歩设计精子抗体的纯化方 案。最终，我们制备了亲和层析A、 B、 C柱纯化精子抗原，再制备亲和层析D、 E、 F柱，进一步从抗人精子的兔抗血清中提取纯化了抗精子多克隆抗体，用于 精子抗体的定量酶标检测。免疫印迹实验证实所得的抗精子多克隆抗体不与正常 人全血清、正常人组织细胞裂解液以及牛血清白蛋白等可能出现在检测系统中的 成份发生反应，为其成为自身抗体定量分析中的抗体标准品奠定了基础。目前市 场上尚无基于抗体标准品的精子抗体定量检测试剂盒，只有从国外进口的以 IU/ml为相对计量单位的半定量检测试剂盒。迄今为止，未有其他人报道过利用本发明方案从人血清或免疫动物血清中提 取纯化抗自身抗原的多克隆抗体。发明内容技术问题本发明目的在于提供一种自身抗体的互补式亲和层析纯化方法， 应用此方法纯化的自身抗体不但特异性和纯度极高，而且组分众多，特别适用于 组成成份较多的自身抗原所诱导的自身抗体的纯化。技术方案该方案避免了基因克隆表达和单克隆抗体制备等繁杂技术，只需 制备多克隆抗体、血清蛋白、组织细胞裂解液和亲和层析柱，操作简便，耗费低 廉，实验室条件要求不高，相对省时省力。本方案纯化所得的多克隆自身抗体可 以作为抗体标准品，用来制作基于各类免疫学实验方法的自身抗体定量检测试剂 盒，对自身免疫性疾病的诊断、治疗、预后和疗效观察具有重要价值。为了解决从血清中纯化自身抗体的技术难题，我们利用多克隆抗体、血清蛋白、组织细胞裂解液等制备6种亲和层析柱，建立了以互补式亲和层析为主要创新点的纯化方法。 该方法为首先用互补式亲和层析法纯化制备自身抗原11) 收集人的目的组织细胞，用NP-40萃取细胞膜抗原，再用超声波粉碎组 织细胞，超速离心后取上清液，作为粗制抗原A液，12) 用目的组织细胞免疫实验动物，取抗血清，经盐析法粗提Y免疫球蛋白，称免疫血清IgG;同时取未被免疫的该种实验动物的混合血清，经盐析法粗提Y
免疫球蛋白，称未免疫血清IgG;用正常人混合全血清免疫实验动物，取抗血清， 同样经盐析法粗提Y免疫球蛋白，称抗人全血清IgG，13) 用S印harose-4B琼脂糖凝胶分别与上述的免疫血清IgG、未免疫血清 IgG和抗人全血清IgG偶联成免疫亲和层析A柱、B柱和C柱，14) 取粗制抗原A液过亲和层析A柱，收集与A柱上IgG结合的抗原物质， 浓縮后为粗制抗原B液；再取粗制抗原B液过亲和层析B柱，收集不与B柱上 IgG结合的抗原物质，浓縮后为粗制抗原C液；最后取粗制抗原C液过亲和层析 C柱，收集不与C柱上IgG结合的抗原物质，浓縮后为精制抗原液； 然后用互补式亲和层析法纯化制备抗自身抗原的多克隆抗体-21) 收集自身抗体阳性的病人血清或者用自身抗原免疫接种的实验动物的抗 血清；用盐析法及DEAE52纤维素柱纯化IgG型和IgA型免疫球蛋白，并分别称 为粗制IgG型抗体D液和粗制IgA型抗体D液，22) 收集不含目的自身抗原的健康人的混合血清；收集不含目的抗原的人的 组织细胞，并制备成组织细胞裂解液，23) 用S印harose-4B琼脂糖凝胶分别与上述的精制抗原液、不含目的抗原 的健康人混合血清以及不含目的抗原的人组织细胞裂解液偶联成亲和层析D柱、 E柱和F柱，24) 取粗制IgG型或IgA型抗体D液过亲和层析D柱，收集与D柱上自身抗 原相结合的抗体物质，浓缩后为粗制IgG型或IgA型抗体E液；后者过亲和层析 E柱，收集不与E柱上蛋白相结合的抗体物质，浓缩后为粗制IgG型或IgA型抗 体F液；F液再过亲和层析F柱，收集不与F柱上蛋白相结合的抗体物质，浓縮 后为精制自身抗体液IgG型或者IgA型。在歩骤13)和歩骤23)用Sepharose-4B琼脂糖凝胶制备亲和层析A、 B、 C、 D、 E和F柱时，用非Sepharose-4B的琼脂糖凝胶代替。在步骤24)用亲和层析D、 E和F柱联合进行互补式亲和层析时，只用D柱 或者用D柱和E柱联合。在步骤ll)时不是收集目的组织细胞，而是收取含有目的抗原的人的体液， 继而不用NP-40萃取细胞膜抗原和超声波粉碎组织细胞，直接用含有目的抗原的 人的体液免疫实验动物。有益效果① 本发明提供了一种从人血清或免疫动物血清中特异性纯化自身抗体的技 术方案。② 应用本方案纯化的自身抗体不但特异性和纯度极高。③ 本方案特别适用于纯化组成成份较多的自身抗原所诱导的多克隆自身抗 体。因为组成成份较多的自身抗原很多从基因到蛋白质序列都不清楚，不能进行 基因克隆表达而获得，也不能通过单克隆抗体的亲和层析而全部获得。这些自身 抗原所诱导机体产生的自身抗体种类众多，因抗原很难获得，也因此很难纯化组 份众多的针对同一种自身抗原的自身抗体。④ 本方案避免了基因克隆表达和单克隆抗体制备等繁杂技术，操作简便，耗 费低廉，实验室条件要求不高，相对省时省力。⑤ 应用本方案纯化所得的多克隆自身抗体可以作为抗体标准品，用来制作基 于各类免疫学实验方法的自身抗体定量检测试剂盒，对自身免疫性疾病的诊断、 治疗、预后和疗效观察具有重要价值，因此能创造很好的经济效益和社会效益。
具体实施例方式本发明的自身抗体的互补式亲和层析纯化方法为 首先用互补式亲和层析法纯化制备自身抗原11) 收集人的目的组织细胞，用NP-40萃取细胞膜抗原，再用超声波粉碎组 织细胞，超速离心后取上清液，作为粗制抗原A液，12) 用目的组织细胞免疫实验动物，取抗血清，经盐析法粗提Y免疫球蛋白， 称免疫血清IgG;同时取未被免疫的该种实验动物的混合血清，经盐析法粗提Y免疫球蛋白，称未免疫血清IgG;用正常人混合全血清免疫实验动物，取抗血清，同样经盐析法粗提Y免疫球蛋白，称抗人全血清IgG，13) 用S印harose-4B琼脂糖凝胶分别与上述的免疫血清IgG、未免疫血清 IgG和抗人全血清IgG偶联成免疫亲和层析A柱、B柱和C柱，14) 取粗制抗原A液过亲和层析A柱，收集与A柱上IgG结合的抗原物质， 浓縮后为粗制抗原B液；再取粗制抗原B液过亲和层析B柱，收集不与B柱上 IgG结合的抗原物质，浓縮后为粗制抗原C液；最后取粗制抗原C液过亲和层析 C柱，收集不与C柱上IgG结合的抗原物质，浓縮后为精制抗原液；然后用互补式亲和层析法纯化制备抗自身抗原的多克隆抗体
21) 收集自身抗体阳性的病人血清或者用自身抗原免疫接种的实验动物的抗 血清；用盐析法及DEAE52纤维素柱纯化IgG型和IgA型免疫球蛋白，并分别称 为粗制IgG型抗体D液和粗制IgA型抗体D液，22) 收集不含目的自身抗原的健康人的混合血清；收集不含目的抗原的人的 组织细胞，并制备成组织细胞裂解液，23) 用S印harose-4B琼脂糖凝胶分别与上述的精制抗原液、不含目的抗原 的健康人混合血清以及不含目的抗原的人组织细胞裂解液偶联成亲和层析D柱、 E柱和F柱，24) 取粗制IgG型或IgA型抗体D液过亲和层析D柱，收集与D柱上自身抗 原相结合的抗体物质，浓縮后为粗制IgG型或IgA型抗体E液；后者过亲和层析 E柱，收集不与E柱上蛋白相结合的抗体物质，浓縮后为粗制IgG型或IgA型抗 体F液；F液再过亲和层析F柱，收集不与F柱上蛋白相结合的抗体物质，浓縮 后为精制自身抗体液IgG型或者IgA型。在步骤13)和歩骤23)用S印harose-4B琼脂糖凝胶制备亲和层析A、 B、 C、 D、 E和F柱时，可用非S印harose-4B的琼脂糖凝胶代替。以亲和层析A、 B、 C、 D柱进行互补式亲和层析，纯化自身抗体；以亲和层析 A、 B、 C、 D、 E柱进行互补式亲和层析，纯化自身抗体。取含有目的抗原的人的体液、细胞裂解液或者组织细胞悬液，免疫实验动物 如羊、马、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、猪等，获得免疫血清IgG、 IgA或者IgM; 同时从该种实验动物血清中获得未免疫血清IgG、 IgA或者IgM;同上制备亲和 层析A、 B、 C柱进行互补式亲和层析，从人体液中、细胞膜内或者细胞膜表面获 得精制抗原液；再同上制备亲和层析D、 E和F柱进行互补式亲和层析，获得精 制的抗人自身抗原的多克隆抗体。下面以抗人精子自身抗体的纯化为实例阐述本发明方案的
具体实施例方式① 收集人的目的组织细胞，用NP-40萃取细胞膜抗原，再用超声波粉碎组织 细胞，超速离心后取上清液，作为粗制抗原A液；② 用目的组织细胞免疫实验动物，取抗血清，经盐析法粗提Y免疫球蛋白 (IgG)，称免疫血清IgG;同时取未被免疫的该种实验动物的混合血清，经盐析法粗提IgG，称未免疫血清IgG;用正常人全血清免疫实验动物，取抗血清，同 样经盐析法粗提IgG，称抗人全血清IgG;
③ 用S印harose-4B琼脂糖凝胶分别与上述的免疫血清IgG、未免疫血清 IgG和抗人血清IgG偶联成亲和层析A柱、B柱和C柱；④ 取粗制抗原A液过亲和层析A柱，收集与A柱上IgG结合的抗原物质，浓 縮后为粗制抗原B液；再取粗制抗原B液过亲和层析B柱，收集不与B柱上IgG 结合的抗原物质，浓縮后为粗制抗原C液；最后取粗制抗原C液过亲和层析C 柱，收集不与C柱上IgG结合的抗原物质，浓縮后为精制抗原液。⑤ 收集自身抗体阳性的病人血清或者用自身抗原免疫接种的实验动物的抗 血清；用盐析法及DEAE52纤维素柱纯化血清IgG ( Y免疫球蛋白)和血清IgA(a免疫球蛋白)，并分别称为粗制IgG型抗体D液和粗制IgA型抗体D液；⑥ 收集不含目的自身抗原的健康人的混合血清；收集不含目的抗原的人的组 织细胞，并制备成组织细胞裂解液；⑦ 用S印harose-4B琼脂糖凝胶分别与上述的精制抗原液、不含目的抗原的 健康人混合血清以及不含目的抗原的人组织细胞裂解液偶联成亲和层析D柱、E 柱和F柱；⑧ 取粗制IgG型或IgA型抗体D液过亲和层析D柱，收集与D柱上自身抗原 相结合的抗体物质，浓縮后为粗制IgG型或IgA型抗体E液；后者过亲和层析E 柱，收集不与E柱上蛋白相结合的抗体物质，浓缩后为粗制IgG型或IgA型抗体 F液；F液再过亲和层析F柱，收集不与F柱上蛋白相结合的抗体物质，浓縮后 为精制自身抗体液(IgG或者IgA型)。冷冻真空干燥成粉剂后保存备用。抗精子抗体的互补式亲和层析纯化方法1.人精子膜抗原的粗提,制备粗制抗原A液收集新鲜正常精液100-500ml，用0. Olmol/L, pH7. 4的Tris-HCl缓冲液反 复洗涤6次，取精子沉淀加入抗原提取液(Tris 0.061g， EDTA 0. 012g, NaCl 0. 07g, NP-40 50ul，加蒸馏水至100ml,调pH9. 0)， 4"C磁力搅拌30分钟，而后另 加4种蛋白酶抑制剂(PMSF，lramol/L; Le叩印tin, 10ug/ml;Aprotinin, 10ug/ml; Iodoacetamide, 1. 8mg/ml),分装试管，放冰杯中进行超声波粉碎，300uA， lmin/ 次，间隔2min， 12-15次。而后离心1200 rpm/min， 10min，去残渣碎片。上清 置超速冷冻离心机，27000g离心50min。上清经聚乙二醇浓縮后，PBS溶液透析 48h以上即成粗制抗原A液。BCA法蛋白定量后，分装置-70't保存备用。
2. 制备免疫血清IgG、未免疫血清IgG和抗人全血清IgG: 收集多人的新鲜正常精液100ml，用生理盐水洗涤6次，沉淀用生理盐水重悬，计数精子量，常规皮下多点注射实验兔2只，免疫接种3-4次/只，每次间 隔2周，1Xl()6个精子/次。最后一次免疫后第7天取全部兔血清，分装于-20t 保存备用；同时取一只未经免疫接种的实验兔，取其全部血清，同上保存备用； 另外收集数名未婚少女的全血清数毫升，与福氏完全佐剂混匀成油包水样后常规 皮下多点注射实验兔2只，3-5次/只，l-2ml/次/只，每次间隔2周。从第二次 免疫开始，混合全血清与福氏不完全佐剂混匀。最后一次免疫后第7天取全部兔 血清，分装于-20"C保存备用。取上述用人精子免疫的兔血清、未被免疫的兔血清以及用人全血清免疫的兔 血清，分别经33%硫酸铵盐析法在4"C常规提取总IgG型免疫球蛋白，沉淀用PBS 缓冲液溶解后于4t透析过夜，BCA法蛋白定量后置-20"C保存备用，分别称为免 疫血清IgG、未免疫血清IgG和抗人全血清IgG。3. 制备亲和层析A柱、B柱和C柱取上述免疫血清IgG、未免疫血清IgG和抗人全血清IgG分别与溴化氰活化 的S印harose-4B偶联成亲和层析A柱、B柱和C柱。具体方法如下取2-5g溴 化氰活化的S印harose-4B干胶于烧杯中，用lmM HC1溶液溶解，待膨胀后 移至抽滤用的漏斗中，用lmM HC1溶液抽洗15min，接着用100-200ml的HC1溶 液抽洗至液面与琼脂凝胶面平齐，使凝胶恢复光泽活性。取上述血清IgG液，融 化后4UC超速离心去除Ig的聚集体，经BCA法蛋白定量后用0. lmol/L NaHC03/0. 5mol/L NaCl溶液稀释IgG液至5mg/L。将等体积的处理后凝胶与等体 积的IgG液混合于烧杯中，置室温不断搅拌1-2h。再用5倍于凝胶体积的 0. lmol/L NaHC03/0. 5raol/L NaCl溶液抽洗凝胶，至液面与凝胶面平齐，而后将 凝胶溶解于pH8.0的50mmol/L甘氨酸溶液中，置4°C 16h，以封闭凝胶上剩余的 活性基团。于玻璃层析管中装柱后用5倍于凝胶体积的0. 1M Acetate Buffer(pH4.0)/0.5M NaCl抽洗，再用5倍于凝胶体积的0. 1M Tris-HCl Buffer(pH8.0)/ 0. 5M NaCl抽洗，并重复二个循环。最后将偶联好的亲和层析 柱保存于TSA溶液中，置4"C条件下可保存1-2年。4. 互补式亲和层析纯化精子膜抗原常规亲和层析的方法见《精编分子生物学实验指南》(颜子颖、王海林译，
北京科学出版社，1998: 382)。本互补式亲和层析的主要歩骤为① 取粗制抗原A液过亲和层析A柱，收集与A柱上IgG结合的抗原物质取与A柱凝胶等体积的粗制抗原A液(l-10mg/ml)，上柱后室温作用3h，而后用 以下溶液依次洗涤A柱，流速lml/min，直至流出组分的0D280吸光度<0. 02为 止5倍柱床体积的洗涤缓冲液，pH8.05倍柱床体积的Tris缓冲液，pH8.05倍柱床体积的Tris缓冲液，pH9.0 然后以5倍柱床体积的三乙醇胺溶液洗脱A柱，直至流出组分的0D280吸光度 〈0.02为止，流速lml/min，同时收集洗脱液，并立即用lmol/L Tris-HC1 (Ph6. 7) 缓冲液中和，以免洗脱下来的蛋白质在硷性条件下变性，即将每一个柱床体积 的洗脱液收集于含有0.2体积的lmol/L Tris-HCl(Ph6.7)缓冲液的试管中，聚 乙二醇浓縮后调pH值至7. 4左右即为粗制抗原B液。② 取粗制抗原B液过亲和层析B柱，收集不与B柱上IgG结合的抗原物质 将粗制抗原B液上B柱，室温作用lh，用5倍柱床体积的洗涤缓冲液(pH8. 0)洗涤B柱，流速lml/min，直至流出组分的0D280吸光度〈0. 02为止；最后用5 倍柱床体积的Tris缓冲液(pH8. 0)洗脱B柱，并同时收集洗脱液，经聚乙二醇 浓縮后即为粗制抗原C液。(D最后取粗制抗原C液过亲和层析C柱，收集不与C柱上IgG结合的抗原物 质将粗制抗原C液上C柱，室温作用lh，用5倍柱床体积的洗涤缓冲液(pH8. 0) 洗涤C柱，流速lml/min，直至流出组分的OD280吸光度<0. 02为止；最后用5 倍柱床体积的Tris缓冲液(pH8.0)洗脱C柱，并同时收集洗脱液，经聚乙二醇 浓縮为l-5ml，透析24h以上即为精制抗原液。BCA法蛋白定量，SDS-PAGE电泳 鉴定纯度及成分，分装置-70"C保存备用。TSA保存缓冲液:0.002mol/LTris-Cl; 0. 14mol/LNaCl; 0.025%(W/V) NaN3; lmmol/L EDTA; 20ug/ral庆大霉素，pH8. 0，置40C冰冷洗涤缓冲液0. 01mol/L Tris-CI; 0. 14mol/L NaCl; 0. 025%(W/V) NaN:,; 0. 5%(V/V)Triton X-100; 0. 5%(V/V)脱氧胆酸钠，pH8. 0，置4"C冰冷Tris缓冲液:50誦ol/LTris-Cl;O. 1%(V/V) TritonX-100: 0. 5mol/L NaCl, pH8. 0或者pH9. 0，置4"C冰冷三乙醇氨缓冲液50謹1/L三乙醇氨；0. l%(V/V)TritonX-100; 0. 15mol/L NaCl， pH11.5，置4('C冰冷5.从抗精子抗体阳性血清中提取总IgG和总IgA:收集抗精子抗体阳性的病人血清或者用人精子免疫接种的兔血清；用盐析法 结合DEAE52纤维素柱纯化总IgG型和IgA型免疫球蛋白，并分别称为粗制IgG 型抗体D液和粗制IgA型抗体D液。总IgG提取取抗精子抗体IgG型阳性患者混合血清或兔抗血清，经常规33%硫酸铵盐析法粗提IgG型免疫球蛋白，具体步骤见《精编分子生物学实验指南》(颜子颖、王海林译，北京科学出版社，1998: 436)。透析除盐后分批过DEAE52纤维素层析柱，用0.01MpH7.4PBS缓冲液洗脱，收集洗脱液，经聚乙二醇浓縮为2-4mg/ml即为纯化的总IgG液，称为粗制IgG型抗体D液。分装置-70UC保存备用。所有盐析、透析、层析及离心步骤均在4"C进行。总IgA提取取抗精子抗体IgA型阳性患者混合血清或兔抗血清，加等量0. 1M ZnSO，液，调pH值至7. 0，搅拌lh后离心去沉淀，上清中加等量饱和硫酸铵液，混匀后于4"C过夜，离心去上清后溶沉淀于10% EDTA-Na溶液中，透析除盐后再分批过DEAE52纤维素层析柱，先用0. 01M pH7. 4 PBS洗脱并弃洗脱液，再换用0. 1M pH6.4 PBS洗脱，所收集的蛋白峰即为IgA。聚乙二醇浓縮后再过S印hadexG200柱，经0. 01M pH7. 4 PBS洗脱，第一蛋白峰即为纯化的总IgA液，称为粗制IgA型抗体D液。分装置-70"C保存备用。所有盐析、透析、层析及离 心步骤均在4"C进行。6. 制备亲和层析D柱、E柱和F柱收集未婚少女混合血清(不含人精子抗原)；收集健康女性的组织细胞(不 含人精子抗原)，并常规制成组织细胞裂解液。取溴化氰活化的S印harose-4B 琼脂糖凝胶分别与精制精子抗原液、未婚少女混合血清以及健康女性组织细胞裂 解液等偶联成亲和层析D柱、E柱和F柱。具体偶联步骤与亲和层析A、 B、 C柱 制备时的偶联步骤相同，只要改换被偶联物即可。7. 互补式亲和层析纯化抗人精子多克隆抗体常规亲和层析的方法见《精编分子生物学实验指南》(颜子颖、王海林译， 北京科学出版社，1998: 382)。本互补式亲和层析的主要步骤为①取粗制IgG型(IgA型)抗体D液过亲和层析D柱，收集与D柱上精子抗 原结合的抗体物质取与D柱凝胶等体积的抗体D液(1-10mg/ml)，上柱后室温 200710190243.6说明书第11/11页作用3h，而后用以下溶液依次洗涤D柱，流速lml/niin，直至流出组分的0D280 吸光度<0. 02为止5倍柱床体积的洗涤缓冲液，pH8. 05倍柱床体积的Tris缓冲液，pH8.05倍柱床体积的Tris缓冲液，pH9. 0 然后以5倍柱床体积的三乙醇胺溶液洗脱D柱，直至流出组分的0D280吸光度 <0. 02为止，流速lml/min，同时收集洗脱液，并立即用lmol/L Tris-HCl (p朋.7) 缓冲液中和，以免洗脱下来的蛋白质在硷性条件下变性，即将每一个柱床体积 的洗脱液收集于含有0.2体积的lmol/L Tris-HCl(pH6.7)缓冲液的试管中，聚 乙二醇浓缩后调pH值至7. 4左右即为粗制IgG型(IgA型)抗体E液。② 取粗制IgG型(IgA型)抗体E液过亲和层析E柱，收集不与E柱上人血清 蛋白结合的抗体物质将抗体E液上E柱，室温作用lh，用5倍柱床体积的洗 涤缓冲液(pH8. 0)洗涤E柱，流速lml/min，直至流出组分的OD280吸光度 〈0.02为止；最后用5倍柱床体积的Tris缓冲液(pH8.0)洗脱E柱，并同时收 集洗脱液，经聚乙二醇浓縮后即为粗制IgG型(IgA型)抗体F液。③ 最后取粗制IgG型(IgA型)抗体F液过亲和层析F柱，收集不与F柱上 人组织细胞蛋白结合的抗体物质将抗体F液上F柱，室温作用lh，用5倍柱 床体积的洗涤缓冲液(p朋.O)洗涤F柱，流速lml/min，直至流出组分的0D280 吸光度<0. 02为止；最后用5倍柱床体积的Tris缓冲液(pH8. 0)洗脱F柱，并 同时收集洗脱液，经聚乙二醇浓缩为1-5ml，透析24h以上即为精制自身抗体液(IgG或者IgA型)。BCA法蛋白定量，SDS-PAGE电泳鉴定纯度及成分，冷冻真 空千燥成粉剂后保存备用。分装置-70"C保存备用。8.精制自身抗体的鉴定和保存取精制抗人精子自身抗体液(IgG或者IgA型)，BCA法进行蛋白定量； 10%SDS-PAGE电泳鉴定其抗体的纯度；而后做免疫印迹实验，检测精制抗体与精 子抗原、未婚少女全血清、人组织细胞裂解液以及牛血清白蛋白等可能在精子抗 体检测系统中出现的成分的反应性，鉴定所纯化的自身抗体的特异性；最后冷冻真空干燥成粉剂后保存备用。1权利要求
1、一种自身抗体的互补式亲和层析纯化方法，其特征在于该方法为首先用互补式亲和层析法纯化制备自身抗原11)收集人的目的组织细胞，用NP-40萃取细胞膜抗原，再用超声波粉碎组织细胞，超速离心后取上清液，作为粗制抗原A液，12)用目的组织细胞免疫实验动物，取抗血清，经盐析法粗提γ免疫球蛋白，称免疫血清IgG；同时取未被免疫的该种实验动物的混合血清，经盐析法粗提γ免疫球蛋白，称未免疫血清IgG；用正常人混合全血清免疫实验动物，取抗血清，同样经盐析法粗提γ免疫球蛋白，称抗人全血清IgG，13)用Sepharose-4B琼脂糖凝胶分别与上述的免疫血清IgG、未免疫血清IgG和抗人全血清IgG偶联成免疫亲和层析A柱、B柱和C柱，14)取粗制抗原A液过亲和层析A柱，收集与A柱上IgG结合的抗原物质，浓缩后为粗制抗原B液；再取粗制抗原B液过亲和层析B柱，收集不与B柱上IgG结合的抗原物质，浓缩后为粗制抗原C液；最后取粗制抗原C液过亲和层析C柱，收集不与C柱上IgG结合的抗原物质，浓缩后为精制抗原液；然后用互补式亲和层析法纯化制备抗自身抗原的多克隆抗体21)收集自身抗体阳性的病人血清或者用自身抗原免疫接种的实验动物的抗血清；用盐析法及DEAE52纤维素柱纯化IgG型和IgA型免疫球蛋白，并分别称为粗制IgG型抗体D液和粗制IgA型抗体D液，22)收集不含目的自身抗原的健康人的混合血清；收集不含目的抗原的人的组织细胞，并制备成组织细胞裂解液，23)用Sepharose-4B琼脂糖凝胶分别与上述的精制抗原液、不含目的抗原的健康人混合血清以及不含目的抗原的人组织细胞裂解液偶联成亲和层析D柱、E柱和F柱，24)取粗制IgG型或IgA型抗体D液过亲和层析D柱，收集与D柱上自身抗原相结合的抗体物质，浓缩后为粗制IgG型或IgA型抗体E液；后者过亲和层析E柱，收集不与E柱上蛋白相结合的抗体物质，浓缩后为粗制IgG型或IgA型抗体F液；F液再过亲和层析F柱，收集不与F柱上蛋白相结合的抗体物质，浓缩后为精制自身抗体液IgG型或者IgA型。
2、 根据权利要求l所述的自身抗体的互补式亲和层析纯化方法，其特征在 于在步骤13)和步骤23)用S印harose-4B琼脂糖凝胶制备亲和层析A、 B、 C、 D、 E和F柱时，用非S印harose-4B的琼脂糖凝胶代替。
3、 根据权利要求l所述的自身抗体的互补式亲和层析纯化方法，其特征在 于在步骤24)用亲和层析D、 E和F柱联合进行互补式亲和层析时，只用D柱 或者用D柱和E柱联合。
4、 根据权利要求l所述的自身抗体的互补式亲和层析纯化方法，其特征在 于在步骤ll)时不是收集目的组织细胞，而是收取含有目的抗原的人的体液， 继而不用NP-40萃取细胞膜抗原和超声波粉碎组织细胞，直接用含有目的抗原的 人的体液免疫实验动物。
全文摘要
自身抗体的互补式亲和层析纯化方法，能高度特异性地从人血清或免疫动物血清中提取纯化抗组织细胞自身抗原的多克隆抗体。对于组织细胞中因组成成分较多而不适宜于用基因工程表达和单克隆抗体亲和层析获得的自身抗原，其对应的自身抗体也种类众多，适合于用本方案进行多克隆抗体的纯化。所获得的高度特异性自身抗体可以作为抗体标准品，用来制作基于各类免疫学实验方法的自身抗体定量检测试剂盒，对自身免疫性疾病的诊断、治疗、预后和疗效观察具有重要价值。在纯化抗人精子抗体的实践中，该方法科学可行，耗费低廉，所得免源性抗人精子多克隆抗体具有极高的纯度和特异性。
文档编号G01N33/531GK101158681SQ20071019024
公开日2008年4月9日 申请日期2007年11月23日 优先权日2007年11月23日
发明者张建琼, 沈传来, 维 谢 申请人:东南大学