专利名称：人IgE抗体检测试剂盒、制备方法及检测方法
技术领域：
本发明涉及酶联免疫检测领域，具体地，涉及一种人IgE抗体检测试剂盒、制备方法及检测方法。
背景技术：
过敏性疾病又称变态反应性疾病，是指机体对某些抗原初次应答后，再次接受相同抗原刺激时，发生的一种以机体生理功能紊乱或组织损伤为主的特异性免疫应答。1966年,Ishizaka等首先发现并证明IgE抗体是介导I型过敏反应的主要抗体。临床过敏症主要指I型过敏反应，其主要的发生机制为过敏原(allergen)进入机体后可刺激特异性B细胞产生IgE抗体，特异性IgE抗体的Fe段可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞膜上的Fe ε RI对结合，使机体处于致敏状态。当相同的过敏原再次进入致敏状态的机体时，就可与致敏的肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的特异性IgE抗体的可变区结合而触发细胞活化，释放组胺、白三烯(LTs)、血小板活化因子(PAF)等生物活性介质。这些生物活性介质可作用于皮肤、血管、呼吸道和消化道等效应器官，引起平滑肌痉挛、毛细血管扩张、血管通透性增加、腺体分泌增加等过敏性症状，临床上常表现为支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性胃肠炎和过敏性皮肤病等，严重时可引起威胁生命的过敏性休克。近年来，随着社会经济的发展，IgE介导的过敏性疾病正在迅速增加，影响了很多人的生活质量，给社会带来了沉重的经济负担。根据文献报道，IgE介导的I型过敏反应受累人群已经达到世界人口总数的四分之一。世界卫生组织(WHO)已把过敏性疾病列为21世纪需重点研究和防治的三大疾病之一。过敏性疾病在发达国家已被视为影响健康的主要问题。而且由于过敏性疾病的发生率不断上升，对过敏性疾病的研究和关注较过去大为提高。因此，开展IgE抗体检测新技术的研究适合当前变态反应学临床与研究的需要。IgE抗体检测方法主要有放射免疫法、荧光免疫法、条带免疫法、免疫印迹法、酶联免疫法(ELISA)等。放射免疫法有放射性污染，容易对人体造成伤害；荧光免疫法需要昂贵的仪器；条带免疫法和免疫印迹法操作复杂，准确性低；这些方法都不适合于在临床上大范围推广。相对而言，酶联免疫法操作简单、准确性高、无需昂贵的仪器，是目前临床上普遍使用的方法。由于IgE抗体在人体中的含量很低，容易受到IgG等抗体的干扰，常规的ELISA检测方法由于灵敏度不够，检测的准确性较差，尤其是检测低值IgE抗体时，结果更加不准确。而目前进口试剂盒占据国内市场前三名的地位，进口的IgE抗体诊断试剂盒，因价格昂贵，让许多中、小型医院望而却步。中国市场销售仅仅只限于部分大型医院使用，无法进行大幅度普及使用，尤其国内一直长期依赖进口，国外产品在国内市场占有绝对的垄断和控制地位。因此，国内迫切需要开发具有自主知识产权集聚灵敏高、特异性强、重现性好、成本低的国产化IgE抗体检测试剂，这已是当务之急需亟待解决的问题
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏高、特异性强、重现性好、成本低的人IgE抗体检测试剂盒。本发明的第二个目的在于提供一种标记效率高的人IgE抗体检测试剂盒的制备方法。本发明的第三个目的在于提供一种成本低、操作简单、使用方便的人IgE抗体检测方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:人IgE抗体检测试剂盒，包括:包被的微孔板或其制备原料、以及样本稀释液、质控血清、浓缩清洗液、底物液、终止液，还包括生物素标记的抗IgE抗体结合液、辣根过氧化物酶标记的亲和素结合液。进一步地，所述包被的微孔板为包被有抗人IgE抗体的微孔板。进一步地，所述样本稀释液为载体蛋白或动物血清溶于磷酸盐缓冲液中；所述质控血清为阳性血清溶于磷酸盐缓冲液中；所述浓缩清洗液为吐温溶于磷酸盐缓冲液中；所述底物液为四甲基联苯胺和过氧化氢溶于柠檬酸缓冲液中；所述终止液为含硫酸的溶液；还包括标准血清，所述标准血清为高值人IgE抗体血清溶于磷酸盐缓冲液中。进一步地，所述生物素标记的抗IgE抗体结合液为:生物素标记的抗IgE抗体和载体蛋白或动物血清溶于磷酸盐缓冲液中；所述辣根过氧化物酶标记的亲和素结合液为:辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素和载体蛋白或动物血清溶于磷酸盐缓冲液中。人IgE抗体检测试剂盒的制备方法，包括如下样品的制备:包被的微孔板或其制备原料、样本稀释液、质控血清、浓缩清洗液、底物液、终止液，还包括:A、生物素标记的抗IgE抗体结合液的制备:(I)将抗IgE抗体的不变区Fe端进行SATA修饰；(2)用HPDP-LC-生物素与修饰后的抗IgE抗体进行连接，形成生物素标记的抗IgE抗体；(3)将生物素标记的抗IgE抗体溶于抗体稀释液中配制生物素标记的抗IgE抗体结合液。B、辣根过氧化物酶标记的亲和素结合液的制备:将辣根过氧化物酶与亲和素进行标记，后将辣根过氧化物酶标记的亲和素溶于酶稀释液中配制辣根过氧化物酶标记的亲和素结合液。进一步地，所述步骤(I)为:称取抗人IgE抗体融入0.1M的磷酸盐缓冲液中，PH7.0-7.6，使抗体的浓度为l_5mg/ml ;称取SATA溶于DMF或DMSO中，使浓度为5-lOmg/ml ;每毫升抗体溶液中加入10-40 μ I的SATA溶液,室温反应30_60min ；以SephadexG25柱或透析法除去未反应的SATA溶液；所述步骤(2)为:称取HPDP-LC-生物素溶于DMF或DMSO中，使浓度为l_5mg/ml ;每毫升SATA修饰的抗体溶液中加入50-150 μ I的HPDP-LC-生物素溶液，室温反应60-120min ；以S印hadexG25柱或透析法除去未反应的HPDP-LC-生物素溶液；所述步骤(3)为:称取载体蛋白或量取动物血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入保护剂配制抗体稀释液，将生物素标记的抗人IgE抗体溶于抗体稀释液中配制生物素标记的抗IgE抗体结合液；所述步骤B为:将辣根过氧化物酶与链霉亲和素进行标记，称取载体蛋白或量取动物血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入保护剂配制酶稀释液，将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素溶于酶稀释液中配制辣根过氧化物酶标记的亲和素结合液。进一步地，所述步骤B中，辣根过氧化物酶与链霉亲和素3:1以过碘酸钠法进行标记。进一步地，所述包被的微孔板为包被有抗人IgE抗体的微孔板。进一步地，制备包被的微孔板:将抗人IgE抗体溶于碳酸或磷酸、醋酸缓冲液中，混匀，加入微孔板内，孵育，用吐温溶于磷酸盐缓冲液洗板后，再在微孔板内加入封闭液，孵育，弃去孔内液体，干燥微孔板，干燥后将微孔板封入铝箔袋中；制备样本稀释液:量取载体蛋白或量取动物血清溶于磷酸盐缓冲液中；制备质控血清:量取阳性血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入保护剂；制备浓缩清洗液:量取吐温溶于磷酸盐缓冲液中；制备底物液:称取四甲基联苯胺和过氧化氢溶于柠檬酸缓冲液中；制备终止液:量取硫酸溶于纯水中；还包括制备标准血清:量取高值人IgE抗体血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入保护剂。人IgE抗体的检测方法，采用上述的人IgE抗体检测试剂盒进行检测，或采用上述制备方法制备的试剂盒进行检测。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:1、采用生物素-亲和素放大系统，由于生物素和亲和素的亲和力更高，且一个亲和素分子可以结合4个生物素分子，使检测灵敏度比常规的ELISA检测方法提高了 4-5倍，有效地解决了 IgE抗体含量低，常规的ELISA检测方法由于灵敏度不够，检测结果不准确的问题。2、采用双抗体加心法检测人IgE抗体，可有效地消除IgG、IgM、IgA等抗体的干扰，进一步提闻了检测的准确性。3、由于抗人IgE抗体的分子量大，生物素的分子量又小，直接标记很容易将生物素结合在抗体的可变区Fab端，使抗体失去活性，降低标记效率。本发明先将抗体的不变区Fe端进行SATA修饰，再用加臂的HPDP-LC-生物素与修饰后的抗体进行连接，使生物素只标记在抗体的Fe端上，而抗体的可变区Fab端不受影响，保持了抗体的活性。加长臂的生物素分子空间增大，提闻了生物素和未和素的结合效率，进一步提闻了广品的灵敏度。4、采用本发明的试剂盒进行IgE抗体检测，成本低、操作简单、使用方便、无需昂贵的仪器设备、易于推广应用，具有极其好的社会效益和非常可观的经济效益。
具体实施例方式以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1:人IgE抗体检测试剂盒的组分人IgE抗体检测试剂盒的组分包括:包被的微孔板或其制备原料、以及样本稀释液、质控血清、浓缩清洗液、底物液、终止液，还包括生物素标记的抗IgE抗体结合液、辣根过氧化物酶标记的亲和素结合液。其中:包被的微孔板为包被有抗人IgE抗体的微孔板。样本稀释液为载体蛋白或动物血清溶于磷酸盐缓冲液中；质控血清为阳性血清溶于磷酸盐缓冲液中；浓缩清洗液为吐温溶于磷酸盐缓冲液中；底物液为四甲基联苯胺和过氧化氢溶于柠檬酸缓冲液中；终止液为含硫酸的溶液。上述试剂盒的组分还包括标准血清，标准血清为高值人IgE抗体血清溶于磷酸盐缓冲液中。
上述生物素标记的抗IgE抗体结合液为:生物素标记的抗IgE抗体和载体蛋白或动物血清溶于磷酸盐缓冲液中；上述辣根过氧化物酶标记的亲和素结合液为:辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素和载体蛋白或动物血清溶于磷酸盐缓冲液中。实施例2:人IgE抗体检测试剂盒的制备方法1、将抗人IgE抗体按I μ g/ml溶于50mM的碳酸(或磷酸、醋酸)缓冲液中，混匀。2、按一定的排列顺序加入微孔板内，每孔100μ 1，4°C孵育过夜，用吐温溶于磷酸盐缓冲液洗板3次后，再在微孔板内加入封闭液(含2%BSA的磷酸缓冲液)，每孔200 μ 1，4°C孵育过夜。3、弃去孔内液体，室温过夜干燥微孔板，干燥后将微孔板封入铝箔袋中。4、称取IOgBSA溶于I升50mM磷酸盐缓冲液中配制样本稀释液，按50ml每瓶进行分装。5、标记抗体的 SATA(N-Succinimidyl-S-acetylthioacetate)修饰。称取抗人 IgE抗体融入0.1M的磷酸盐缓冲液中，PH7.2，使抗体的浓度为2mg/ml。称取SATA溶于DMF中，使浓度为8mg/ml。每毫升抗体溶液中加入20μ I的SATA溶液，室温反应40min。以SephadexG25柱除去未反应的SATA溶液。6、生物素与抗人IgE抗体的标记。称取HPDP-LC-生物素溶于DMF中，使浓度为2mg/ml。每毫升SATA修饰的抗体溶液中加入100 μ I的HPDP-LC-生物素溶液，室温反应90min。以S印hadexG25柱除去未反应的HPDP-LC-生物素溶液。7、称取IOgBSA溶于I升50mM磷酸盐缓冲液中，并加入保护剂配制抗体稀释液，将生物素标记的抗人IgE抗体(1:2000)溶于抗体稀释液中配制生物素标记的抗人IgE抗体结合液，按20ml每瓶进行分装。8、将辣根过氧化物酶与链霉亲和素(3:1)以过碘酸钠法进行标记。9、称取IOgBSA溶于I升50mM磷酸盐缓冲液中，并加入保护剂配制酶稀释液，将辣根过氧化物酶标记的亲和素(1:5000)溶于酶稀释液中配制辣根过氧化物酶标记的亲和素结合液，按20ml每瓶进行分装。10、称取0.2g四甲基联苯胺(TMB)和0.6ml过氧化氢溶于I升柠檬酸缓冲液中配制底物液，按15ml每瓶进行分装。11、量取IOml吐温溶于I升磷酸盐缓冲液中配制浓缩清洗液，按50ml每瓶进行分装。12、量取50ml硫酸溶于I升纯水中配制终止液，按15ml每瓶进行分装。13、量取高值人IgE抗体血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入保护剂配制标准血清，按Iml每瓶进行分装。14、量取阳性血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入保护剂配制质控血清，按Iml每瓶进行分装。15、按照试剂盒的组分贴上标签，将包被的微孔板、样本稀释液、生物素标记抗体结合液、辣根过氧化物酶标记的亲和素结合液、标准血清、质控血清、浓缩洗液、底物液、终止液、说明书放入试剂盒的相应位置，组装成完整的试剂盒。上述步骤4、7、9中的BSA可替换为动物血清，按常规方法配置相应的稀释液。实施例3:人IgE抗体检测试剂盒的制备方法
按实施例2的方法制备人IgE抗体检测试剂盒，不同之处在于:步骤5中，PH7.0,使抗体的浓度为lmg/ml。称取SATA溶于DMSO中，使浓度为5mg/ml ο每毫升抗体溶液中加入10 μ I的SATA溶液，室温反应30min。以透析法除去未反应的SATA溶液。步骤6中，称取HPDP-LC-生物素溶于DMSO中，使浓度为lmg/ml。每毫升SATA修饰的抗体溶液中加入50 μ I的HPDP-LC-生物素溶液，室温反应60min。以透析法除去未反应的HPDP-LC-生物素溶液。实施例4:人IgE抗体检测试剂盒的制备方法按实施例2的方法制备人IgE抗体检测试剂盒，不同之处在于:步骤5中，PH7.6，使抗体的浓度为5mg/ml。称取SATA溶于DMSO中，使浓度为IOmg/ml ο每毫升抗体溶液中加入40 μ I的SATA溶液，室温反应60min。以透析法除去未反应的SATA溶液。步骤6中，称取HPDP-LC-生物素溶于DMSO中，使浓度为5mg/ml。每毫升SATA修饰的抗体溶液中加入150 μ I的HPDP-LC-生物素溶液，室温反应120min。以透析法除去未反应的HPDP-LC-生物素溶液。实施例5:人IgE抗体检测方法采用实施例1的人IgE抗体检测试剂盒进行检测，或采用实施例2、3、4制备方法制备的试剂盒进行检测。使用前请将试剂盒中的所有试剂平衡至室温。1、将浓缩清洗液(I:25) 40ml加到蒸馏水或去离子水中，使终体积为1000ml，混
匀，配得清洗缓冲液。2、准备绘制标准曲线:从每管标准血清中各取100 μ I加入到包被抗IgE抗体的微孔内，每种标准品重复2孔。3、向包被抗IgE抗体的微孔中加入90 μ I样本稀释液和10 μ I质控血清或患者样本。4、用封口膜或塑料袋封闭微孔板，置室温(22-25° C)孵育I小时。5、孵育后，用300 μ I清洗缓冲液清洗每个反应孔，需清洗3次。如果选用自动清洗仪，请参照厂家说明进行3次循环清洗，并将清洗容量设为300μ I。6、分别向各微孔中加100 μ I生物素标记的抗人IgE抗体结合液。7、用封口膜或塑料袋封闭微孔板，置室温(22-25° C)孵育I小时。8、重复步骤5清洗微孔板。9、分别向各微孔中加100 μ I辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素结合液。10、置室温(22-25° C)孵育30分钟。11、重复步骤5清洗微孔板。12、在所有反应孔中加入100 μ I底物液。13、封闭微孔板,置室温(22-25° C)孵育30分钟。14、在所有反应孔中加入100 μ I终止液(此时反应孔中的溶液由蓝色变为黄色)。15、用酶标仪测定每孔在450nm处的吸光度值。经检测，相对于普通的ELISA检测方法，其灵敏度提高了 4_5倍。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.人IgE抗体检测试剂盒，包括:包被的微孔板或其制备原料、以及样本稀释液、质控血清、浓缩清洗液、底物液、终止液，其特征在于:还包括生物素标记的抗IgE抗体结合液、辣根过氧化物酶标记的亲和素结合液。
2.根据权利要求1所述的人IgE抗体检测试剂盒，其特征在于:所述包被的微孔板为包被有抗人IgE抗体的微孔板。
3.根据权利要求2所述的人IgE抗体检测试剂盒，其特征在于: 所述样本稀释液为载体蛋白或动物血清溶于磷酸盐缓冲液中； 所述质控血清为阳性血清溶于磷酸盐缓冲液中； 所述浓缩清洗液为吐温溶于磷酸盐缓冲液中； 所述底物液为四甲基联苯胺和过氧化氢溶于柠檬酸缓冲液中； 所述终止液为含硫酸的溶液； 还包括标准血清，所述标准血清为高值人IgE抗体血清溶于磷酸盐缓冲液中。
4.根据权利要求1、2或3所述的人IgE抗体检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的抗IgE抗体结合液为:生物素标记的抗IgE抗体和载体蛋白或动物血清溶于磷酸盐缓冲液中；所述辣根过氧化物酶标记的亲和素结合液为:辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素和载体蛋白或动物血清溶于磷酸盐缓冲液中。
5.人IgE抗体检测试剂盒的制备方法，包括如下样品的制备:包被的微孔板或其制备原料、样本稀释液、质控血清、浓缩清洗液、底物液、终止液，其特征在于，还包括: A、生物素标记的抗IgE抗体结合液 的制备: (1)将抗IgE抗体的不变区Fe端进行SATA修饰； (2)用HPDP-LC-生物素与修饰后的抗IgE抗体进行连接，形成生物素标记的抗IgE抗体； (3)将生物素标记的抗IgE抗体溶于抗体稀释液中配制生物素标记的抗IgE抗体结合液； B、辣根过氧化物酶标记的亲和素结合液的制备: 将辣根过氧化物酶与亲和素进行标记，后将辣根过氧化物酶标记的亲和素溶于酶稀释液中配制辣根过氧化物酶标记的亲和素结合液。
6.根据权利要求5所述的人IgE抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于: 所述步骤(I)为:称取抗人IgE抗体融入0.1M的磷酸盐缓冲液中，PH7.0-7.6，使抗体的浓度为l_5mg/ml ;称取SATA溶于DMF或DMSO中，使浓度为5-10mg/ml ;每毫升抗体溶液中加入10-40 μ I的SATA溶液，室温反应30-60min ；以S印hadexG25柱或透析法除去未反应的SATA溶液； 所述步骤(2)为:称取HPDP-LC-生物素溶于DMF或DMSO中，使浓度为l_5mg/ml ;每毫升SATA修饰的抗体溶液中加入50-150 μ I的HPDP-LC-生物素溶液，室温反应60_120min ；以S印hadexG25柱或透析法除去未反应的HPDP-LC-生物素溶液； 所述步骤(3)为:称取载体蛋白或量取动物血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入保护剂配制抗体稀释液，将生物素标记的抗人IgE抗体溶于抗体稀释液中配制生物素标记的抗IgE抗体结合液； 所述步骤B为:将辣根过氧化物酶与链霉亲和素进行标记，称取载体蛋白或量取动物血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入保护剂配制酶稀释液，将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素溶于酶稀释液中配制辣根过氧化物酶标记的亲和素结合液。
7.根据权利要求6所述的人IgE抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于:所述步骤B中，辣根过氧化物酶与链霉亲和素3:1以过碘酸钠法进行标记。
8.根据权利要求5、6或7所述的人IgE抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于:所述包被的 微孔板为包被有抗人IgE抗体的微孔板。
9.根据权利要求8所述的人IgE抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于: 制备包被的微孔板:将抗人IgE抗体溶于碳酸或磷酸、醋酸缓冲液中，混匀，加入微孔板内，孵育，用吐温溶于磷酸盐缓冲液洗板后，再在微孔板内加入封闭液，孵育，弃去孔内液体，干燥微孔板，干燥后将微孔板封入铝箔袋中； 制备样本稀释液:量取载体蛋白或量取动物血清溶于磷酸盐缓冲液中； 制备质控血清:量取阳性血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入保护剂； 制备浓缩清洗液:量取吐温溶于磷酸盐缓冲液中； 制备底物液:称取四甲基联苯胺和过氧化氢溶于柠檬酸缓冲液中； 制备终止液:量取硫Ife溶于纯水中； 还包括制备标准血清:量取高值人IgE抗体血清溶于磷酸盐缓冲液中，并加入保护剂。
10.人IgE抗体的检测方法，其特征在于:采用权利要求1-4任一项所述的人IgE抗体检测试剂盒进行检测，或采用权利要求5-9任一项所述的制备方法制备的试剂盒进行检测。
全文摘要
本发明公开了人IgE抗体检测试剂盒，包括包被的微孔板或其制备原料、以及样本稀释液、质控血清、浓缩清洗液、底物液、终止液，还包括生物素标记的抗IgE抗体结合液、辣根过氧化物酶标记的亲和素结合液。通过采用生物素-亲和素放大系统，试剂盒灵敏度高、特异性强；本发明还公开了上述试剂盒的制备方法，通过先将抗体的不变区Fc端进行SATA修饰，再用HPDP-LC-生物素与修饰后的抗体进行连接，可提高标记效率。本发明还公开了人IgE抗体的检测方法，采用上述人IgE抗体检测试剂盒或上述制备方法制备的试剂盒进行检测，成本低、操作简单、使用方便、易于推广应用。
文档编号G01N33/535GK103175954SQ20131007384
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月8日 优先权日2013年3月8日
发明者刘兴旺 申请人:北京海瑞祥天生物科技有限公司