专利名称：一种含绿色荧光蛋白融合标签的重组蛋白定量检测方法
技术领域：
本发明涉及一种利用双抗体夹心酶联免疫吸附试验来定量检测绿色荧光蛋白或 含该蛋白的融合蛋白的方法。
背景技术：
进入二十一世纪的第二个十年，人类的生命科学研究已经全面开启“功能基因组 计划”，首当其冲的就是蛋白质组学的研究。蛋白质结构和功能的多样性决定了蛋白质组学 研究难度之大，新基因所编码蛋白质的结构和功能的揭示对生物学家来说是至关重要的。 不管是常规的蛋白分子研究还是蛋白组学的研究，为了充分理解蛋白的结构与功能，原核 或真核表达重组蛋白分子的工作需求日益增加。其中，标签蛋白是一种重要的工具。应用 适当的融合蛋白标签主要有以下几方面的优点一、可以增加目的基因表达产物(目的蛋 白)的稳定性，提高表达水平；二、提高原核表达系统中目的蛋白的可溶性；三、部分具有分 子伴侣效应的标签蛋白可以帮助目的蛋白保持天然构像及与配体结合的能力；四、为检测 和/或纯化目的蛋白提供了便利。常用的融合蛋白标签包括多聚精氨酸、多聚组氨酸、钙 调蛋白结合多肽、c-myc、谷胱甘肽S转移酶、FLAG多肽、葡萄球菌蛋白Α、绿色荧光蛋白、硫 氧化还原蛋白等等。特别是绿色荧光蛋白以其本身所具有的荧光特性而成为用途非常广泛 的蛋白标签。含绿色荧光蛋白标签的融合蛋白表达后，可以在荧光显微镜下定性检测，但很 多情况下仍然需要定量的检测技术。目前对带有绿色荧光蛋白标签的重组蛋白的检测方法 主要是半定量的免疫印迹法，该方法操作复杂、实验周期较长，所需试剂多、花费高，并且无 法进行精确定量。

发明内容
为了克服免疫印迹法的不足，本发明提供一种定量检测方法，不仅可以定量，而且 特异性强、灵敏度高、重复性好、简便易行，非常适合于快速定量检测绿色荧光蛋白或含该 蛋白的融合蛋白。为达到以上目的，本发明是采取如下技术方案予以实现的一种含有绿色荧光蛋白融合标签的重组蛋白定量检测方法，其特征在于，包括下 述步骤(1)用5mg/L包被抗体包被96孔板，4°C下放置过夜；(2)用含牛血清白蛋白的缓冲液室温封闭96孔板，洗涤后弃去封闭液；(3)在一部分孔中加入倍比稀释的绿色荧光蛋白标准品，剩余孔中加入待测标本， 孵育及洗涤后加入检测抗体，再孵育及洗涤后加入酶标抗体，(4)第三次孵育及洗涤后以2，2’_连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺酸)作 为底物显色，于波长410nm测定光吸收值；(5)以标准品的光吸收值为纵坐标，相应浓度为横坐标，作标准曲线，根据待测标 本的光吸收值，经曲线拟合计算，得出待测标本中绿色荧光蛋白的浓度。
另一种含有绿色荧光蛋白融合标签的重组蛋白定量检测方法，，其特征在于，包括 下述步骤(1)用5mg/L包被抗体包被96孔板，4°C下放置过夜；(2)用含牛血清白蛋白的缓冲液室温封闭96孔板，洗涤后弃去封闭液；(3)在一部分孔中加入倍比稀释的绿色荧光蛋白标准品，剩余孔中加入待测融合 蛋白GFP-CD226ICD标本，孵育及洗涤后加入检测抗体，再孵育及洗涤后加入酶标抗体，
(4)第三次孵育及洗涤后以2，2’_连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺酸)作 为底物显色，于波长410nm测定光吸收值；(5)以标准品的光吸收值为纵坐标，相应浓度为横坐标，作标准曲线，根据待测融 合蛋白GFP-⑶2261⑶的光吸收值，经曲线拟合计算，得出待测融合蛋白GFP-⑶2261⑶的浓度。上述方案中，所述的包被抗体为单克隆抗体，其制备方法是将重组表达的绿色荧 光蛋白作为免疫原，采用常规杂交瘤法并经阴离子交换层析纯化得到抗绿色荧光蛋白的多 株单克隆抗体；所述检测抗体为多克隆抗体，其制备方法是将重组表达的绿色荧光蛋白 作为免疫原，采用常规免疫家兔法得到抗绿色荧光蛋白的多克隆抗血清，经阴离子交换层 析纯化获得多克隆抗体，多株单克隆抗体需筛选与多克隆抗体配对。配对方法是将得到的单克隆抗体作为包被抗体，多克隆抗体作为检测抗体，商品 化的HRP标记羊抗兔抗体作为酶标抗体，采用阵列法配对挑选敏感性最高且特异性最好的 配对抗体；其中，敏感性最高是指，检测相同浓度的绿色荧光蛋白的光吸收值最高；特异性 最好是指检测无关蛋白的光吸收值最低，也即非特异本底最低。本发明的有益效果是，它可以快速定量检测绿色荧光蛋白，因为这是在单克隆抗 体基础上建立的方法，而单克隆抗体是识别单一表位的抗体，所以本发明的特异性强；又因 为经过抗体的配对筛选，所以本发明的灵敏度高；本发明是建立在酶联免疫吸附试验的基 础上的，免疫印迹整个过程约需2天，而本发明只需先用5分钟左右包被抗体，放到4°C冰箱 过夜后做后面一半，后面一半约4个小时，且各复孔间的光吸收值间误差极小，即批间批内 变异系数小，所以本发明还有简便易行、重复性好的特点。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。绿色荧光蛋白的定量检测方法，利用在制备抗绿色荧光蛋白单克隆抗体和多克隆 抗体的基础上，经过配对抗体的筛选，建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验，来定量检测绿色 荧光蛋白。抗绿色荧光蛋白单克隆抗体的制备是将重组表达的绿色荧光蛋白作为免疫原， 采用常规杂交瘤法得到多株抗绿色荧光蛋白的单克隆抗体。抗绿色荧光蛋白多克隆抗体的制备是将重组表达的绿色荧光蛋白作为免疫原， 采用常规免疫家兔法得到抗绿色荧光蛋白的多克隆抗血清，经阴离子交换层析纯化获得多 克隆抗体。配对双抗体的筛选方法是将得到的单克隆抗体作为包被抗体，多克隆抗体作为 检测抗体，商品化的HRP标记羊抗兔抗体作为酶标抗体，采用阵列法配对挑选敏感性最高且特异性最好的配对抗体，其中；敏感性最高是指，检测相同浓度的绿色荧光蛋白的光吸收 值最高。特异性最好是指检测无关蛋白的光吸收值最低，也即非特异本底(由于蛋白间非 特异性的相互作用而导致的结合，在本实验体系中表现为无关蛋白的光吸收值)最低。实施例1定量检测绿色荧光蛋白的方法将重组表达的绿色荧光蛋白作为免疫原，采用常规杂交瘤技术，经细胞融合、筛 选及克隆化，共得到3株抗绿色荧光蛋白的单克隆抗体，分别命名为FMU-GFP3、FMU-GFP4、 FMU-GFP5。将重组表达的绿色荧光蛋白作为免疫原，采用常规免疫家兔技术得到抗绿色荧光 蛋白的多克隆抗血清，经阴离子交换层析技术纯化获得多克隆抗体。经过抗体的配对筛选后，将FMU-GFP3和FMU-GFP5同时作为包被抗体，用pH9. 6、 0. 05mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液稀释包被抗体至5mg/L，加入96孔板，100 μ 1/孔，保湿， 4°C放置过夜。用洗涤缓冲液洗96孔板3次，加入含0. 3%牛血清白蛋白的缓冲液，室温 封闭30分钟。弃去封闭液，一部分孔中加入倍比稀释的绿色荧光蛋白标准品，剩余孔中加 入待测标本，100μ 1/孔，37°C孵育1小时。洗板3次，将抗绿色荧光蛋白的多克隆抗体作 为检测抗体，使用含0. 3%牛血清白蛋白的缓冲液将检测抗体稀释500倍，加入到各孔中， 100 μ 1/孔，37°C孵育1小时。洗板3次，加入商品化的HRP标记羊抗兔抗体，100 μ 1/孔， 37°C孵育1小时。洗板3次，以2，2’ -连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺酸)底物显 色，100μ 1/孔，37°C放置10分钟，于波长410nm测定光吸收值。以标准品的光吸收值为纵 坐标，相应浓度为横坐标，作标准曲线，其灵敏度达31. 3ng/mL。根据待测标本的光吸收值， 经曲线拟合计算，得出待测标本中绿色荧光蛋白的浓度为500ng/mL。标准品，即已知浓度的 用来免疫小鼠的免疫原(重组表达的绿色荧光蛋白)。实施例2定量检测含绿色荧光蛋白的融合蛋白GFP-⑶2261⑶的方法将重组表达的绿色荧光蛋白作为免疫原，采用常规杂交瘤技术，经细胞融合、筛 选及克隆化，共得到3株抗绿色荧光蛋白的单克隆抗体，分别命名为FMU-GFP3、FMU-GFP4、 FMU-GFP5。将重组表达的绿色荧光蛋白作为免疫原，采用常规免疫家兔技术得到抗绿色荧光 蛋白的多克隆抗血清，经阴离子交换层析技术纯化获得多克隆抗体。经过抗体的配对筛选后，将FMU-GFP3和FMU-GFP5同时作为包被抗体，用pH9. 6、 0. 05mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液稀释包被抗体至5mg/L，加入96孔板，100 μ 1/孔，保湿， 4°C放置过夜。用洗涤缓冲液洗96孔板3次，加入含0. 3%牛血清白蛋白的缓冲液，室温 封闭30分钟。弃去封闭液，一部分孔中加入倍比稀释的绿色荧光蛋白标准品，剩余孔中加 入待测标本GFP-⑶2261⑶，100 μ 1/孔，37°C孵育1小时。洗板3次，将抗绿色荧光蛋白的 多克隆抗体作为检测抗体，使用含0. 3%牛血清白蛋白的缓冲液将检测抗体稀释500倍，加 入到各孔中，100μ 1/孔，37°C孵育1小时。洗板3次，加入商品化的HRP标记羊抗兔抗体， 100 μ 1/孔，37°C孵育1小时。洗板3次，以2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺 酸)底物显色，100μ1/孔，37°C放置10分钟，于波长410nm测定光吸收值。以标准品的光 吸收值为纵坐标，相应浓度为横坐标，作标准曲线，其灵敏度达31. 3ng/mL。根据待测标本的光吸收值，经曲线拟合和分子量换算后计算，得出待测标本中待测目的蛋白GFP-CD226ICD 的浓度为300ng/mL。标准品，即已知浓度的用来免疫小鼠的免疫原(重组表 达的绿色荧光 蛋白)。
权利要求
一种含绿色荧光蛋白融合标签的重组蛋白定量检测方法，其特征在于，包括下述步骤(1)用5mg/L包被抗体包被96孔板，4℃下放置过夜；(2)用含牛血清白蛋白的缓冲液室温封闭96孔板，洗涤后弃去封闭液；(3)在一部分孔中加入倍比稀释的绿色荧光蛋白标准品，剩余孔中加入待测标本，孵育及洗涤后加入检测抗体，再孵育及洗涤后加入酶标抗体，(4)第三次孵育及洗涤后以2，2’ 连氮基 双(3 乙基苯并噻吡咯啉 磺酸)作为底物显色，于波长410nm测定光吸收值；(5)以标准品的光吸收值为纵坐标，相应浓度为横坐标，作标准曲线，根据待测标本的光吸收值，经曲线拟合计算，得出待测标本中绿色荧光蛋白的浓度。
2.如权利要求1所述的含绿色荧光蛋白融合标签的重组蛋白定量检测方法，其特征 在于，所述的包被抗体为单克隆抗体，其制备方法是将重组表达的绿色荧光蛋白作为免疫 原，采用常规杂交瘤法并经阴离子交换层析纯化得到抗绿色荧光蛋白的多株单克隆抗体； 所述检测抗体为多克隆抗体，其制备方法是将重组表达的绿色荧光蛋白作为免疫原，采用 常规免疫家兔法得到抗绿色荧光蛋白的多克隆抗血清，经阴离子交换层析纯化获得多克隆 抗体，多株单克隆抗体需筛选与多克隆抗体配对。
3.如权利要求2所述的含绿色荧光蛋白融合标签的重组蛋白定量检测方法，其特征在 于，所述配对方法是将得到的单克隆抗体作为包被抗体，多克隆抗体作为检测抗体，商品 化的HRP标记羊抗兔抗体作为酶标抗体，采用阵列法配对挑选敏感性最高且特异性最好的 配对抗体；其中，敏感性最高是指，检测相同浓度的绿色荧光蛋白的光吸收值最高；特异性 最好是指检测无关蛋白的光吸收值最低，也即非特异本底最低。
4.一种含绿色荧光蛋白融合标签的重组蛋白定量检测方法，其特征在于，包括下述步骤(1)用5mg/L包被抗体包被96孔板，4°C下放置过夜；(2)用含牛血清白蛋白的缓冲液室温封闭96孔板，洗涤后弃去封闭液；(3)在一部分孔中加入倍比稀释的绿色荧光蛋白标准品，剩余孔中加入待测融合蛋白 GFP-CD226ICD标本，孵育及洗涤后加入检测抗体，再孵育及洗涤后加入酶标抗体；(4)第三次孵育及洗涤后以2，2’_连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺酸)作为底 物显色，于波长410nm测定光吸收值；(5)以标准品的光吸收值为纵坐标，相应浓度为横坐标，作标准曲线，根据待测融合蛋 白GFP-⑶2261⑶的光吸收值，经曲线拟合计算，得出待测融合蛋白GFP-⑶2261⑶的浓度。
5.如权利要求4所述的含绿色荧光蛋白融合标签的重组蛋白定量检测方法，其特征 在于，所述的包被抗体为单克隆抗体，其制备方法是将重组表达的绿色荧光蛋白作为免疫 原，采用常规杂交瘤法并经阴离子交换层析纯化得到抗绿色荧光蛋白的多株单克隆抗体； 所述检测抗体为多克隆抗体，其制备方法是将重组表达的绿色荧光蛋白作为免疫原，采用 常规免疫家兔法得到抗绿色荧光蛋白的多克隆抗血清，经阴离子交换层析纯化获得多克隆 抗体，多株单克隆抗体需筛选与多克隆抗体配对。
6.如权利要求5所述的绿色荧光蛋白融合标签的重组蛋白定量检测方法，其特征在 于，所述配对方法是将得到的单克隆抗体作为包被抗体，多克隆抗体作为检测抗体，商品化的HRP标记羊抗兔抗体作为酶标抗体，采用阵列法配对挑选敏感性最高且特异性最好的 配对抗体；其中，敏感性最高是指，检测相同浓度的绿色荧光蛋白的光吸收值最高；特异性 最好是指检测无关蛋白的光吸收值最低，也即非特异本底最低
全文摘要
本发明涉及一种绿色荧光蛋白或含该蛋白的融合蛋白的定量检测方法，它利用在制备抗绿色荧光蛋白多克隆抗体和单克隆抗体的基础上，经过配对抗体的筛选，建立的双抗体夹心酶联免疫吸附试验，来定量检测绿色荧光蛋白。其特征是在96孔板中，顺序加入单克隆抗包被抗体、待测标本和标准品、多克隆检测抗体、酶标抗体及底物，于波长410nm测定光吸收值。本发明克服了免疫印迹法的不足，不仅可以定量检测，而且特异性强、灵敏度高、重复性好、简便易行，非常适合于快速定量检测绿色荧光蛋白及相应的融合白。
文档编号G01N33/68GK101963619SQ20101027851
公开日2011年2月2日 申请日期2010年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者宋朝君, 庄然, 徐竹蔚, 李琦, 金伯泉 申请人:中国人民解放军第四军医大学