专利名称：一种关黄柏中小檗碱和巴马丁的提取及检测方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及关黄柏中有效成份的提取，尤其涉及利用超高压提取关黄柏中小檗碱和巴马丁的方法。
背景技术：
“黄柏”是常用中药材，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效。在中医临床使用的黄柏包括“关黄柏”和“川黄柏”两个品种，药用部位均为干燥树皮。2005年版《中国药典》之前一直将关黄柏和川黄柏同作“黄柏”收载，直到2005年版药典，才根据两者在成分含量和组成上的差异而分为关黄柏和黄柏。关黄柏为芸香科植物黄檗Phellodendronamurense Rupr.的干燥树皮,具有抗菌、解热、抗炎、抗癌、抗血小板聚集等作用，主要含有小檗碱、药根碱、木兰花碱、巴马丁、黄柏碱、留醇及黏液质等多种成分，其中小檗碱和巴马丁是两个极具代表性药效成分，而且在2010年版《中国药典》含量测定中明确规定小檗碱含量不得少于0.60%,巴马丁不得少于0.30%。通常关黄柏中小檗碱和巴马丁的提取方法有加热回流法、水煎煮法、冷浸法、超声波提取法、微波提取法、超临界CO2萃取法等。水煎煮法和加热回流提取法在较高温度下进行，容易导致活性成分的损失、分解、变化，产物中杂质含量高，而且提取时间长，工艺繁琐。微波提取和超声波提取虽然提取时间、能耗等大大降低，但存在噪音大、难以规模化生产等不足。超临界CO2萃取法存在设备投资大，耗费高，对相对分子质量高、极性强的物质提取困难等问题。此外，2010版《中国药典》分别采用HPLC方法对小檗碱和巴马丁的含量进行测定，测定时间长，过程较为繁琐，不利于快速分析和大批量样品质量控制的需要。因此，寻找一种快速、高效提取关黄柏中小檗碱和巴马丁并同时对该两种成分进行HPLC定量分析的方法，对关黄柏药材及饮片的质量控制有很好的作用。

发明内容
本发明的发明目的是提供一种关黄柏中小檗碱和巴马丁的提取方法，解决现有技术中提取时间长的问题，同时提供一种关黄柏中小檗碱和巴马丁的快速检测方法。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是:一种关黄柏中小檗碱和巴马丁的提取方法，包括如下步骤:首先将干燥的关黄柏粉碎过60 80目筛，再将粉末按质量比1:10 1:50的固液比加入溶剂中，混合密封后在常温下浸泡24 48 h，再将该混合物置于高压容器中，在20 60°C下施加100 500 MPa压力进行浸取，保压时间为I 5 min，卸压后将提取物进行离心，取上清液，过滤，得关黄柏提取液；所述溶剂选自水、浓度为10% 90%乙醇、70%甲醇或70%丙酮。优选的技术方案，溶剂为50%的乙醇、提取压力300 MPa、固液比1:30、提取时间2min。超高压提取(ultrahigh pressure extraction),全称为“冷等静压技术”，是指在常温下用10(T1000 MPa的流体静压力作用于提取溶剂和中药的混合液上，并在预定压力下保持一段时间，使植物细胞内外压力达到平衡后迅速卸压。由于细胞内外渗透压力忽然增大，细胞膜的结构发生变化，使得细胞内的有效成分能够穿过细胞的各种膜而转移到细胞外的提取液中，达到提取中药有效成分的目的，在整个提取过程中不会产生高温，也不会引起物质的变化。目前未见利用超高压提取关黄柏的报道，将超高压技术应用于关黄柏中生物碱的提取对于关黄柏药材的开发利用有重要的作用。一种关黄柏中小檗碱和巴马丁的检测方法，包括如下步骤:
(1)首先将干燥的关黄柏粉碎过60 80目筛，再将粉末按质量比1:10 1:50的固液比加入溶剂中，混合密封后在常温下浸泡24 48 h，再将该混合物置于高压容器中，在20 60°C下施加100 500 MPa压力进行浸取，保压时间为I 5 min，卸压后将提取物进行离心，取上清液；所述溶剂选自水、浓度为10% 90%乙醇、70%甲醇或70%丙酮；
(2)取所述上清液1ml于10 ml的容量瓶中，用蒸馏水定容，采用HPLC定量分析，HPLC条件:Daiso ODS-BP色谱柱，10 Mm, 4.6 mm X 250 mm;流动相:乙腈(A) —0.7%磷酸水溶液(B);梯度洗脱条件:0 5 min, B:75%; 5 35 min, B:60% ;柱温:30°C ;流速:1 ml/min ;检测波长:345 nm ;进样量:10 ο

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:
1、本发明利用超高压提取关黄柏中小檗碱和巴马丁，与传统的加热提取方法相比，本方法在40°c下进行，避免了因热效应引起的有效成分结构变化损失以及生理活性的降低。而且，已有研究报道，生物材料受高压作用时，只有大分子物质发生变性，而小分子物质不会受影响。因此，超高压提取时不会发生小檗碱和巴马丁的破坏、变性。2、本发明利用超高压技术提取关黄柏中小檗碱和巴马丁可以大大缩短提取时间(<5 min)，耗能低，同时超高压提取是在一个密闭的环境中进行的，没有溶剂的损失，因此该技术更加符合绿色环保的要求。3、与传统方法相比，本发明提取的效率高，而且提取液中的杂质含量低，有利于生物活性成分的分离和纯化。4、本发明建立的HPLC分析方法能同时对小檗碱和巴马丁进行分析，简单、准确、快速、紧密度高、重复性好，有很好的应用价值。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述:
本发明利用超高压提取关黄柏中小檗碱和巴马丁并进行HPLC定量分析的方法，包括如下步骤:
1)超高压提取:首先将干燥的关黄柏粉碎，过6(Γ80目筛，将粉末按照1:1(Γ1:50的固液比加入乙醇(浓度为109Γ90%)、水、70%甲醇、70%丙酮等有机溶剂，混合后密封，在室温下浸泡24-48 h，再将该混合物置入高压容器中，在温度2(T60°C，压力100 500 MPa下进行提取，保压时间为广5 min，卸压后将提取物进行离心，过滤，得到关黄柏提取液，4°C冰箱保存。2)定量分析:取1ml关黄柏提取液加入到10 ml的容量瓶中，蒸馏水定容，HPLC — DAD 进样分析。HPLC 条件:Daiso ODS-BP 色谱柱(5 Mm, 4.6 mm X 250 mm);流动相:乙腈(A) — 0.7%磷酸溶液(B);梯度洗脱条件:0 5 min, B:75%; 5 35 min, B:60% ；柱温:30°C ;流速:1 ml/min ;检测波长:345 nm ;进样量:10 ο实施例1 不同溶剂实验
将干燥的关黄柏粉碎过6(Γ80目筛，精确称量1.0 g干燥的关黄柏粉末12份置塑料封口袋中，随机分成4组，每组3袋，分别加入40 ml的水、70%乙醇、70%甲醇、70%丙酮，密封浸泡24小时。然后放入超高压设备中，加压200 MPa浸取，提取温度30°C，保压时间3min，卸压，离心过滤后取提取液I ml于10 ml的容量瓶中，用蒸馏水定容，采用HPLC-DAD方法来测定小檗碱和巴马丁的含量。HPLC条件为:Daiso ODS-BP色谱柱(5 Mm, 4.6 mm X250 mm);流动相:乙腈(A) —0.7%磷酸溶液(B);梯度洗脱条件:0 5 min, B:75%; 5 35 min, B:60% ;柱温:30°C ;流速:1 ml/min ;检测波长:345 nm ;进样量:10 μ 。巴马丁和小檗碱的提取率见表I。表I不同溶剂下巴马丁和小檗碱提取率
权利要求
1.一种关黄柏中小檗碱和巴马丁的提取方法，其特征在于，包括如下步骤:首先将干燥的关黄柏粉碎过60 80目筛，再将粉末按质量比1:10 1:50的固液比加入溶剂中，混合密封后在常温下浸泡24 48 h，再将该混合物置于高压容器中，在20 60°C下施加100 500 MPa压力进行浸取，保压时间为I 5 min，卸压后将提取物进行离心，取上清液，过滤，得关黄柏提取液；所述溶剂选自水、浓度为10% 90%乙醇、70%甲醇或70%丙酮。
2.根据权利要求1所述的关黄柏中小檗碱和巴马丁的提取方法，其特征在于:溶剂为50%的乙醇、提取压力300 MPa、固液比1:30、提取时间2 min。
3.一种关黄柏中小檗碱和巴马丁的检测方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)首先将干燥的关黄柏粉碎过60 80目筛，再将粉末按质量比1:10 1:50的固液比加入溶剂中，混合密封后在常温下浸泡24 48 h，再将该混合物置于高压容器中，在20 60°C下施加100 500 MPa压力进行浸取，保压时间为I 5 min，卸压后将提取物进行离心，取上清液；所述溶剂选自水、浓度为10% 90%乙醇、70%甲醇或70%丙酮； (2)取所述上清液Iml于10 ml的容量瓶中，用蒸馏水定容，采用HPLC定量分析，HPLC条件:Daiso ODS-BP色谱柱，10 Mm, 4.6 mm X 250 mm ;流动相:乙腈(A) —0.7%磷酸水溶液(B);梯度洗脱条件:0 5 min, B:75%; 5 35 min, B:60% ;柱温:30°C ;流速:1 ml/min ;检测波长:345 n m ;进样量:10 ο
全文摘要
本发明公开了一种关黄柏中小檗碱和巴马丁的提取和检测方法，提取方法包括如下步骤将干燥的关黄柏粉碎过60～80目筛，再将粉末按质量比1:10～1:50的固液比加入溶剂中，混合密封后在常温下浸泡24h，再置于高压容器中，在20～60℃下施加100～500MPa压力进行浸取，保压时间为1～5min，卸压后将提取物进行离心，取上清液，过滤，得关黄柏提取液；所述溶剂选自水、浓度为10%～90%乙醇、70%甲醇或70%丙酮。采用上清液进行HPLC定量分析实现检测。本发明避免了因热效应引起的有效成分结构变化损失以及生理活性的降低，提取时间短，耗能低；检测方法简单、准确、快速、紧密度高、重复性好。
文档编号G01N30/02GK103149292SQ201310056830
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日
发明者李贺然, 刘顺 申请人:苏州大学