专利名称：鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及养殖病害病原检测技术的改进，具体讲是ー种鱼类病毒性出血性败血症病毒(Viral haemorhagic septicaemia virus, VHSV))快速检测试纸,属于检测试纸结构技术领域。
技术背景 鱼类病毒性出血性败血症(VHS)是由病毒性出血性败血症病毒(VHSV)引起的，属弹状病毒科RNA病毒。该病可侵袭野生的海水和淡水鱼，导致大量的野生鱼类的死亡。对养殖鱼类的侵袭更为严重，近年来，全球VHSV检出鱼类种数持续攀升，达50余种鱼类。VHS作为海水养殖鱼类新兴传染性疾病，该病已对丹麦、瑞典、芬兰的欧洲国家海水养殖虹鱒造成严重危害；对德国、英国、爱尔兰的欧洲国家养殖大菱鲆造成严重危害；对加拿大海水养殖大西洋鲑造成一定损失；近年对日本养殖牙鲆，真鯛造成严重危害，而且北美基因型VHSV广泛见于日本和韩国养殖牙鲆、日本养殖无备平鈾和太平洋玉筋鱼，并广泛见于日本沿岸野生牙鲆和太平洋玉筋鱼；而分离自日本养殖牙鲆病鱼的北美基因型和欧洲基因型VHSV，也对我国海水养殖鱼类如许氏平軸、赤点石斑鱼、黑鲷等致病。因而，对于国内海水鱼类养殖业，尤其是大菱鲆、牙鲆、真鯛、黑鲷、赤点石斑鱼、许氏平鈾养殖业来说，防范鱼类VHS发生，加强鱼类VHS疫情监测，是非常重要的。VHS是鱼类ロ岸第一类检疫对象，也是必需向世界动物卫生组织(OIE)申报的鱼类疫病，鉴于VHS是淡水、海水养殖鱼和野生鱼中常发、高传染性并且损失严重的疾病，现在全国只有少数出入境检验检疫部门可做这方面的检测，检测方法复杂，限于实验室内的检测，需要仪器设备，检测时间长，所用试剂均是国外进ロ，价格昂贵。因而，一种适用于在全国各地出入境检验检疫部门均能方便的使用，在ロ岸现场快速、简便、准确检测VHSV的方法的研制势在必行，及时的杜绝该病的传入。

实用新型内容本实用新型针对鱼类病毒性出血性败血症危害现状，针对水生生物生理特点，设计实用新型提供ー种简便、快速、准确的检测方法，以达到快速、简便、快速、准确的检测目的的鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸本实用新型技术方案实现如下鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸，其包括适当尺寸不干胶载体板
(I)，在该载体板的中间部设有包被有鱼类病毒性出血性败血症病毒单克隆抗体E的检测线(6)和羊抗小鼠IgG的质控线(7)的硝酸纤维膜制成的检测层(2)，与该层相延续的两端设置吸水纸，分别构成加样端吸水层(3)和手持端吸水层(4);在检测层(2)的检测线(6)的远端与加样端吸水层(3)交界处，设有载有金标鱼类病毒性出血性败血症病毒的单克隆抗体A的玻璃纤维膜(5)，该膜一端部分设置在加样端吸水层(3)之下，其另一端部分设置在检测层(2)之上。[0007]本实用新型鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸的检测原理将鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸的加样端吸水层插入或在其上滴加由磷酸盐缓冲液从捣碎的鱼肾脏提取含有病毒粒子的检测样品，根据夹心免疫层析原理，即由金标单抗A同检测样品液中的抗原反应，形成由金标单抗A-鱼类病毒性出血性败血症病毒复合物，当该复合物层析至硝酸纤维素膜上预先包被在检测线上的单抗E处时，此处的抗体会识别该复合物中抗原，反应的结果便形成了金标单抗A+鱼类病毒性出血性败血症病毒抗原+单抗E的夹心结构，最終是单抗A上标记的胶体金颗粒在此固定并累积出现肉眼可见的红色线，未反应的金标单抗A则仍继续层析前行，当到达点预先包被在质控线羊抗鼠IgG处时，抗体类型为IgG的金标单抗A被其结合住 ，从而在此处也出现由胶体金颗粒固定并累积而显现出肉眼可见的红色线，结果是检测线显示红色表示鱼类病毒性出血性败血症病毒阳性；检测线不显示红色，表示鱼类病毒性出血性败血症病毒阴性，即检测样品中不含鱼类病毒性出血性败血症病毒或是鱼类病毒性出血性败血症病毒含量极低。质控线显示红色，表示试纸有效；质控线处不显示红色，说明试纸失效，即或是金标抗体A、或是羊抗鼠IgG失活，检测结果无效。本使用新型具有以下优点I、本实用新型的鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸，使用时无需专门设施和操作技木，适合样品的现场检测，具有检测快速、准确、灵敏、特异性高等特点，并具有较高的稳定性及重复性；2、本实用新型的鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸使用方法中，无需加入特殊的裂解液；只需将鱼肾脏捣碎即可，与传统病毒提取研磨、离心等方法相比，此方法方便简单，可快速提取病毒检测。

本实用新型的实施例结合附图进ー步描述如下图I鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸示意图；图2鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸的检测结果示意图。
具体实施方式
实施例I.參见图1，2本实用新型鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸，其包括胶体金标记的抗鱼类病毒性出血性败血症病毒单克隆抗体A (简称金标单抗A);抗鱼类病毒性出血性败血症病毒的单克隆抗体E(简称单抗E)和羊抗小鼠IgG ;包被有单抗E和羊抗小鼠IgG的硝酸纤维膜2 ;载有金标单抗A的玻璃纤维膜5 ;带有不干胶的载体板
I。在带有不干胶的载体板I的中间部，粘贴包被有单抗E的检测线6和羊抗小鼠IgG的质控线7的硝酸纤维膜为检测层2 ;与该层相延续的两端设置吸水纸分别构成加样端吸水层3和手持端吸水层4 ;在检测层2的检测线6的远端与加样端吸水层3交界处，设有载有金标单抗A的玻璃纤维膜5，该膜一端部分设置在加样端吸水层3之下，其另一端部分设置在检测层2之上。实施例2.鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸的使用方法，即鱼类病毒性出血性败血症病毒的检测步骤取鱼肾脏放入离心管中充分捣碎，按质量/体积比1 (5-10) (g/ml)加入0. Olmol/L pH 6. 0-8. 0的磷酸盐缓冲液，制成检测样品。然后，将样品滴在的加样端吸水层3，5分钟内读結果。阳性结果检测层2上下呈现两条红色的检测线6和质控线7，表示有鱼类病毒性出血性败血症病毒感染；阴性结果检测层2上端部呈现一条红色质控线7，表示无鱼类病毒性出血性败血症病毒感染或其病毒含极低；检测结果无效加样10分钟，检测层2上端质控线7处无红线出现，表示该试纸失效，检测结果无效。(见图2)实施例3.本实用新型的鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸检测的最低病毒量的測定如下结果见表2。表2最低病毒量的測定结果(TAIE5tl = 10_5 3/0. Iml)
权利要求1.一种鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸，其包括适当尺寸不干胶载体板(I)，在该载体板的中间部设有包被有鱼类病毒性出血性败血症病毒单克隆抗体E的检测线(6)和羊抗小鼠IgG的质控线(7)的硝酸纤维膜制成的检测层(2)，与该层相延续的两端设置吸水纸，分别构成加样端吸水层(3)和手持端吸水层(4);在检测层(2)的检测线(6)的远端与加样端吸水层(3)交界处，设有载有金标鱼类病毒性出血性败血症病毒的单克隆抗体A的玻璃纤维膜(5)，该膜一端部分设置在加样端吸水层(3)之下，其另一端部分设置在检测层(2)之上。
专利摘要一种鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸，包括适当尺寸不干胶载体板(1)，在该载体板的中间部设有包被有鱼类病毒性出血性败血症病毒单克隆抗体E的检测线(6)和羊抗小鼠IgG的质控线(7)的硝酸纤维膜制成的检测层(2)，与该层相延续的两端设置吸水纸，分别构成加样端吸水层(3)和手持端吸水层(4)；在检测层(2)的检测线(6)的远端与加样端吸水层(3)交界处，设有载有金标鱼类病毒性出血性败血症病毒的单克隆抗体A的玻璃纤维膜(5)，该膜一端部分设置在加样端吸水层(3)之下，其另一端部分设置在检测层(2)之上。该试纸稳定性、重复性好，具有简便、快速、准确、灵敏特异性高的特点。
文档编号G01N33/577GK202404102SQ20112046933
公开日2012年8月29日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者王晓洁 申请人:鲁东大学