专利名称：刺五加叶的质量检测方法
技术领域：
本发明属于刺五加叶的质量检测方法。
刺五加是五加属五加科植物，为长白山地区特产中药材之一，通常用其干燥的根及根茎入药，商品名为五加参。刺五加已有悠久的药用历史。其根及根茎、茎的质量标准已列入药典1996年版，近年来的研究表明，刺五加叶中含有丰富的具有广泛药理活性的黄酮和皂甙类化合物，可以进一步开发利用。并且将叶子作为药材，具有保护药用资源，环境友好的特点。由于刺五加叶的质量标准未列入药典，建立一种能够准确可靠的质量检测手段，对于刺五加叶的开发利用是十分重要的。
本发明的目的是提供一种刺五加叶的质量检测方法。利用刺五加叶粗提物的电喷雾质谱作为指纹图谱，利用紫外-可见分光光度法确定刺五加叶中总黄酮、总皂甙的含量，保证了质量检测标准的准确性和先进性。
本发明利用软电离质谱技术对刺五加叶的粗提物进行检测，根据得到的刺五加叶粗提物的电喷雾指纹图谱中黄酮及皂甙的个数及分布，对刺五加叶的质量进行初步评价。该指纹图谱可以清晰反映出由于产地、采收季节所带来的黄酮和皂甙种类的不同。本发明考虑到刺五加叶中所含皂甙的甙元以齐墩果酸为主，基于齐墩果酸与香兰素-浓硫酸能发生显色反应这一原理，以齐墩果酸作为标准品，通过测定总皂甙水解产物中齐墩果酸的含量来测定刺五加叶总皂甙含量。而总黄酮的含量测定采用芦丁作为标准品，硝酸铝与黄酮类化合物形成配合物的显色原理进行测定。
本发明选择60％-90％的乙醇作为溶媒，称取已粉碎的刺五加叶60-100g于2000ml烧瓶中，加360ml-1000ml 60％-90％乙醇，通过超声提取2-3次，20-40min/次，或热浸2-3次，1-3h/次；合并两次提取液并浓缩至约60-100ml，再用石油醚萃取近无色，将下层蒸干成固体物，精确称取50mg于50ml容量瓶中，加乙醇定容后即为黄酮含量测定用样品a，水定容后饱和正丁醇萃取4次，分别合并4次萃取的正丁醇层，减压蒸干，残渣以甲醇溶解，移入50ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，作为总皂甙含量测定的样品b。
样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到取少量的样品溶液a，用甲醇稀释后，作电喷雾质谱分析。电喷雾质谱实验条件如下电喷雾源，正、负离子电离方式，喷雾电压3.5-5.5kV。流动注入泵进样。扫描范围m/z50-2000。利用负离子电喷雾质谱确认黄酮的种类，在m/z50-700范围内，存在m/z301，m/z447，m/z463，m/z609等离子；利用正离子电喷雾质谱确认皂甙的种类，在m/z900-1500范围内，存在m/z1065，m/z1081，m/z1097，m/z1108，m/z1123，m/z1211，m/z1227，m/z1243，m/z1253，m/z1269，m/z1285等离子。总皂甙含量测定的方法如下精密称取约15mg的齐墩果酸置于10ml容量瓶中，加甲醇定容；香兰素配成8％乙醇溶液；硫酸配成72％(V/V)溶液。
用微量注射器精密移取齐墩果酸标准品溶液0μl-100μl及50μl样品溶液b分别置于六个小试管中，挥干溶剂，分别加入8％香兰素乙醇溶液0.5ml，72％(V/V)硫酸5ml，摇匀后于60℃恒温水浴加热10min，然后置冰水浴中冷却15min，反应物作为待测溶液。
首先测定标准溶液在530-545nm波长下的可见光吸收，作标准工作曲线，然后根据标准曲线测得样品中总皂甙的含量。
总黄酮含量测定方法如下精密称量约10mg的芦丁，置于10ml容量瓶中，加乙醇定容，用微量注射器精密移取芦丁标准品溶液0μl-50μl及25μl样品溶液a分别置于25ml容量瓶中，分别加入5％亚硝酸钠1.0ml，摇匀，静止5min，再加入4％氢氧化钠溶液5ml，加70％乙醇至刻度，放置15min，在490-510nm波长下首先测定标准溶液的吸收，作标准工作曲线，然后根据标准曲线测得样品中总黄酮的含量。
本方法的样品前处理过程较为简单，提取效率较高。利用刺五加叶提取物的电喷雾质谱作为指纹图谱，通过黄酮、皂甙的种类可以清晰地看出不同产地、不同季节采收的刺五加叶的质量差异，再结合紫外-可见分光光度计对刺五加叶提取物中总黄酮、总皂甙的含量测定结果，可以对刺五加叶的质量进行评价。
本发明提供的实施例如下实施例1(1).样品制备称取已粉碎的刺五加叶60g于2000ml烧瓶中，加360ml 60％乙醇，超声提取三次，每次20分钟；合并两次提取液并浓缩至约100ml，再用石油醚萃取近无色，将下层蒸干成固体物，精确称取50mg于50ml容量瓶中，加乙醇定容后即为黄酮含量测定用样品a。水定容后饱和正丁醇萃取4次，分别合并4次萃取的正丁醇层，减压蒸干，残渣以甲醇溶解，移入50ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，作为总皂甙含量测定的样品b。
(2)样品的电喷雾指纹图谱取少量的样品溶液a，用甲醇稀释至一定浓度后，作电喷雾质谱分析。电喷雾质谱实验条件如下电喷雾源，正、负离子电离方式，喷雾电压4.5kV。流动注入泵进样。扫描范围m/z50-2000。利用负离子电喷雾质谱确认黄酮的种类，m/z50-700范围内，存在m/z301，m/z447，m/z463，m/z609离子；利用正离子电喷雾质谱确认皂甙的种类，在m/z900-1500范围内，存在m/z1065，m/z1081，m/z1097，m/z1108，m/z1123，m/z1211，m/z1227，m/z1243，m/z1253，m/z1269，m/z1285等离子。
(3)总皂甙含量测定的方法精密称取约15mg的齐墩果酸置于10ml容量瓶中，加甲醇定容；香兰素配成8％乙醇溶液；硫酸配成72％(V/V)溶液。
用微量注射器精密移取齐墩果酸标准品溶液0μl-100μl及50μl样品溶液b分别置于六个小试管中，挥干溶剂，分别加入8％香兰素乙醇溶液0.5ml，72％(V/V)硫酸5ml，摇匀后于60℃恒温水浴加热10min，然后置冰水浴中冷却15min，反应物作为待测溶液。
首先测定标准溶液在530nm波长下的可见光吸收，作标准工作曲线，然后根据标准曲线测得样品中总皂甙的含量。
(4)总黄酮含量测定精密称量约10mg的芦丁，置于10ml容量瓶中，加乙醇定容，用微量注射器精密移取芦丁标准品溶液0μl-50μl及25μl样品溶液a分别置于六个25ml容量瓶中，分别加入5％亚硝酸钠1.0ml，摇匀，静止5min，再加入4％氢氧化钠溶液5ml，加70％乙醇至刻度，放置15min，在490nm波长下首先测定标准溶液的吸收，作标准工作曲线，然后根据标准曲线测得样品中总黄酮的含量。
实施例2(1).样品制备称取已粉碎的刺五加叶80g于2000mL烧瓶中，加640ml 80％乙醇，超声提取二次，每次30分钟；按照实施例1的样品制备步骤得到黄酮含量测定用样品a和作为总皂甙含量测定的样品b。
(2)样品的电喷雾指纹图谱取少量的样品溶液a，用甲醇稀释至一定浓度后，作电喷雾质谱分析。电喷雾质谱实验条件如下电喷雾源，正、负离子电离方式，喷雾电压4.5kV。流动注入泵进样。扫描范围m/z50-2000。按照实施例1的步骤(2)确认黄酮和皂甙的种类。
(3)总皂甙含量测定的方法利用实施例1中总皂甙含量测定的方法在537.5nm波长下对标准溶液和样品溶液进行测定，确定样品中总皂甙的含量。
(4)总黄酮含量测定利用实施例1中总黄酮含量测定的方法在510nm波长下对标准溶液和样品溶液进行测定，确定样品中总黄酮的含量。
实施例3(1).样品制备称取已粉碎的刺五加叶100g于2000mL烧瓶中，加1000ml 90％乙醇，超声提取二次，每次40分钟；按照实施例1的样品制备步骤得到黄酮含量测定用样品a和作为总皂甙含量测定的样品b。
(2)样品的电喷雾指纹图谱取少量的样品溶液a，用甲醇稀释至一定浓度后，作电喷雾质谱分析。电喷雾质谱实验条件如下电喷雾源，正、负离子电离方式，喷雾电压5.5kV。流动注入泵进样。扫描范围m/z50-2000。按照实施例1的步骤(2)确认黄酮和皂甙的种类。
(3)总皂甙含量测定的方法利用实施例1中总皂甙含量测定的方法在545nm波长下对标准溶液和样品溶液进行测定，确定样品中总皂甙的含量。
(4)总黄酮含量测定利用实施例1中总黄酮含量测定的方法在500nm波长下对标准溶液和样品溶液进行测定，确定样品中总黄酮的含量。
实施例4(1).样品制备称取已粉碎的刺五加叶60g于2000mL烧瓶中，加360ml 60％乙醇，60℃热浸提取三次，每次2小时；按照实施例1的样品制备步骤得到黄酮含量测定用样品a和作为总皂甙含量测定的样品b。
(2)样品的电喷雾指纹图谱取少量的样品溶液a，用甲醇稀释至一定浓度后，作电喷雾质谱分析。电喷雾质谱实验条件如下电喷雾源，正、负离子电离方式，喷雾电压4.5kV。流动注入泵进样。扫描范围m/z50-2000。按照实施例1的步骤(2)确认黄酮和皂甙的种类。
(3)总皂甙含量测定的方法利用实施例1中总皂甙含量测定的方法在545nm波长下对标准溶液和样品溶液进行测定，确定样品中总皂甙的含量。
(4)总黄酮含量测定利用实施例1中总黄酮含量测定的方法在510nm波长下对标准溶液和样品溶液进行测定，确定样品中总黄酮的含量。
实施例5
(1).样品制备称取已粉碎的刺五加叶80g于2000mL烧瓶中，加640ml 80％乙醇，60℃热浸提取三次，每次1小时；按照实施例1的样品制备步骤得到黄酮含量测定用样品a和作为总皂甙含量测定的样品b。
(2)样品的电喷雾指纹图谱取少量的样品溶液a，用甲醇稀释至一定浓度后，作电喷雾质谱分析。电喷雾质谱实验条件如下电喷雾源，正、负离子电离方式，喷雾电压3.5kV。流动注入泵进样。扫描范围m/z50-2000。按照实施例1的步骤(2)确认黄酮和皂甙的种类。
(3)总皂甙含量测定的方法利用实施例1中总皂甙含量测定的方法在537.5nm波长下对标准溶液和样品溶液进行测定，确定样品中总皂甙的含量。
(4)总黄酮含量测定利用实施例1中总黄酮含量测定的方法在500nm波长下对标准溶液和样品溶液进行测定，确定样品中总黄酮的含量。
实施例6(1).样品制备称取已粉碎的刺五加叶100g于2000mL烧瓶中，加1000ml 90％乙醇，60℃热浸提取二次，每次3小时；按照实施例1的样品制备步骤得到黄酮含量测定用样品a和作为总皂甙含量测定的样品b。
(2)样品的电喷雾指纹图谱取少量的样品溶液a，用甲醇稀释至一定浓度后，作电喷雾质谱分析。电喷雾质谱实验条件如下电喷雾源，正、负离子电离方式，喷雾电压5.5kV。流动注入泵进样。扫描范围m/z50-2000。按照实施例1的步骤(2)确认黄酮和皂甙的种类。
(3)总皂甙含量测定的方法利用实施例1中总皂甙含量测定的方法在530nm波长下对标准溶液和样品溶液进行测定，确定样品中总皂甙的含量。
(4)总黄酮含量测定利用实施例1中总黄酮含量测定的方法在490nm波长下对标准溶液和样品溶液进行测定，确定样品中总黄酮的含量。
权利要求
1.一种刺五加叶的质量检测方法，其特征在于选择60％-90％的乙醇作为溶媒，称取已粉碎的刺五加叶60-100g于2000ml烧瓶中，加360ml-1000ml 60％-90％乙醇，通过超声提取2-3次，20-40min/次，或热浸2-3次，1-3h/次；合并两次提取液并浓缩至约60-100ml，再用石油醚萃取近无色，将下层蒸干成固体物，精确称取50mg于50ml容量瓶中，加乙醇定容后即为黄酮含量测定用样品a；水定容后饱和正丁醇萃取4次，分别合并4次萃取的正丁醇层，减压蒸干，残渣以甲醇溶解，移入50ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，作为总皂甙含量测定的样品b；样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到取少量的样品溶液a，用甲醇稀释后，作电喷雾质谱分析，电喷雾质谱实验条件如下电喷雾源，正、负离子电离方式，喷雾电压3.5-5.5kV，流动注入泵进样；扫描范围m/z50-2000，利用负离子电喷雾质谱确认黄酮的种类，利用正离子电喷雾质谱确认皂甙的种类；总皂甙含量测定的方法如下精密称取约15mg的齐墩果酸置于10ml容量瓶中，加甲醇定容；香兰素配成8％乙醇溶液；硫酸配成72％(V/V)溶液；用微量注射器精密移取齐墩果酸标准品溶液0μl-100μl及50μl样品溶液b分别置于六个小试管中，挥干溶剂，分别加入8％香兰素乙醇溶液0.5ml，72％(V/V)硫酸5ml，摇匀后于60℃恒温水浴加热10min，然后置冰水浴中冷却15min，反应物作为待测溶液；首先测定标准溶液在530-545nm波长下的可见光吸收，作标准工作曲线，然后根据标准曲线测得样品中总皂甙的含量；总黄酮含量测定方法如下精密称量约10mg的芦丁，置于10ml容量瓶中，加乙醇定容，用微量注射器精密移取芦丁标准品溶液0μl-50μl及25μl样品溶液a分别置于25ml容量瓶中，分别加入5％亚硝酸钠1.0ml，摇匀，静止5min，再加入4％氢氧化钠溶液5ml，加70％乙醇至刻度，放置15min，在490-510nm波长下首先测定标准溶液的吸收，作标准工作曲线，然后根据标准曲线测得样品中总黄酮的含量。
全文摘要
本发明提供了一种长白山地道药材刺五加叶的质量检测方法。利用乙醇提取、浓缩、过滤、除脂等样品前处理手段将刺五加叶处理后,通过电喷雾质谱得到总黄酮、总皂甙的指纹图谱,根据其指纹图谱确定刺五加叶中所含的黄酮、皂甙的种类;利用紫外－可见分光光度计测定总黄酮,总皂甙的含量。综合其指纹图谱及含量测定数据,可以对刺五加叶的质量进行评价。
文档编号G01N21/33GK1369704SQ0110400
公开日2002年9月18日 申请日期2001年2月16日 优先权日2001年2月16日
发明者刘淑莹, 宋凤瑞, 刘志强, 郭明全, 陈貌连, 崔勐 申请人:中国科学院长春应用化学研究所