专利名称：：一种采用间接elisa方法检测鹅圆环病毒抗体的方法
技术领域：
：本发明涉及一种血清学检测病毒抗体的方法，特别是涉及一种采用间接ELISA方法检测鹅圆环病毒抗体的方法。
背景技术：
：1999年，德国学者首次报道了鹅圆环病毒(GoCV)感染的病例，发病鹅群主要表现为死亡率偏高、个体生长速度减慢参差不齐、羽毛发育不良等症状，病理剖解通常仅见轻度的气囊浑浊，但组织病理学检测可见法氏囊、脾脏和胸腺有不同程度的淋巴细胞缺失的特征性病理变化，其它病变还包括肺、肝、心肌散在的炎性细胞浸润等，一些病例中可见法氏囊结构的严重破坏，并在法氏囊髓质、皮质和个别囊上皮细胞内观察到了嗜碱性的病毒包涵体；经提纯和磷钨酸负染，在鹅法氏囊、脾、胸腺等组织提取物中观察到了圆环病毒样颗粒。此后，Tod、chen等对鹅圆环病毒全基因组序列进行了克隆、测定和序列分析。2004年，Ball等用PCR和斑点杂交法(DBH)对匈牙利一些鹅场的病死鹅样品进行了检测，发现用这两种方法的阳性检出率分别为48.1%和24.6%。2005年，Glavits等报道了匈牙利一鹅场爆发西尼罗河热与圆环病毒的共感染病例，病死率达14%。2006年英国学者Scott等应用SFV(Semliki森林病毒)真核表达载体在幼仓鼠肾细胞(BabyHamsterKidneyCell)中表达了GoCV核衣壳蛋白，并以此为抗原，以兔抗鸭荧光抗体为二抗，建立了间接免疫荧光(IFA)检测方法，并应用该方法对英国的一些鹅场进行血清学调查，发现16岁鹅的抗体阳性率为88.6%，30周龄以下的为40.9%。2005年本实验室在国内首次从浙江永康禽流感病死鹅的样品中检测到了GoCV，进一步应用PCR方法对从浙江省不同地区的8个鹅场采集的样品进行了检测，并克隆测定了10株GoCV全基因组序列，进行了GoCV的分子流行病学分析。除英国学者Scott等建立的IFA夕卜，GoCV的检测目前主要应用PCR和斑点杂交等核酸学方法。我们在采用PCR方法开展GoCV检测和分子流行病学的调查工作时发现，被检鹅通常需要屠宰取法氏囊等淋巴组织样品进行试验成功率才高，直接用血清样品检测的检出率很低，其它核酸学方法如斑点杂交、原位杂交等也会存在同样的问题。为更好地开展我国GoCV的流行情况和感染范围调查，并为进一步开展GoCV的致病性和免疫机制的研究奠定基础，有必要建立一种更加快速、敏感、特异、便于大规模应用且不需要扑杀动物的血清学检测诊断方法。
发明内容本发明的目的是提供一种快速、敏感、特异、便于大规模应用且不需要扑杀动物的血清学检测鹅圆环病毒抗体的方法，特别是提供一种采用间接ELISA方法检测鹅圆环病毒抗体的方法。本发明在已建立的鹅圆环病毒重组核衣壳蛋白的原核表达基础上，利用羊抗鸡二抗的交叉反应性，替代抗鹅二抗，开展了鹅圆环病毒抗体检测间接ELISA方法的研究，本发明的技术方案提供一种采用间接ELISA方法检测鹅圆环病毒抗体的方法，其采用原核表达的鹅圆环病毒重组核衣壳蛋白作为ELISA检测的包被抗原，以HRP-羊抗鸡IgG酶标抗体作为二抗，进行鹅血清GoCV抗体的间接ELISA方法检测。上述原核表达鹅圆环病毒重组核衣壳蛋白的菌株为含融合表达GoCV外壳蛋白重组质粒pET-28a-AC即的BL21(DE3)工程菌，构建方法见参考文献余旭平等，鹅圆环病毒重组核衣壳蛋白的原核表达，中国预防兽医学报，2008年7月第30巻第7期，P505-509，其在IPTG诱导下能融合表达鹅圆环病毒缺失核定位序列的核衣壳蛋白(ACap蛋白)。将含阳性重组表达质粒的工程菌接种于10mLLB液体培养基中(含50ug/mL卡那霉素)，37t:振荡培养过夜，按1%的量转接10mLLB液体培养基(含50ug/mL卡那霉素)，37。C振荡培养，待0D6。。值达0.6左右，加IPTG至终浓度为lmM，诱导4h。离心收集菌体，经超声破碎后离心收集包涵体，分别以含4M尿素、1%Triton100的缓冲液对包涵体进行洗涤，重复两次，最后用8M的尿素溶解包涵体。离心后取上清，用镍琼脂糖凝胶柱进行进一步纯化，用咪唑洗脱，具体操作参照试剂使用说明。含重组质粒pET-28a-AC即的BL21(DE3)工程菌经IPTG诱导后GoCV外壳蛋白(AC即，已缺失核定位序列)获得了较高水平的表达，经Bandscan4.5生物图象分析软件分析其表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的18.6%。菌体经超声破碎后离心，发现融合蛋白均在沉淀中，上清液未见可见的条带，可见融合蛋白是以包涵体形式存在。分别以含4M尿素、1%TritonIOO的缓冲液对包涵体进行洗涤，除去部分杂蛋白。最后用8M的尿素溶解包涵体，并进一步对粗提蛋白进行镍柱纯化，获得了高纯度的AC即蛋白，经Bandscan4.5扫描分析纯度达95.5%。上述GoCV外壳蛋白采用透析法复性将用8mol/L尿素溶解的包涵体溶液装入已处理好的透析袋内，置于复性缓冲液(含不同浓度尿素的0.02MpH7.4PBS)中，在4。C下进行梯度透析，复性缓冲液中尿素浓度依次递减，分别为4mol/L、2mol/L、lmol/L、0.5mol/L和Omol/L，蛋白复性换液间隔时间为10h-12h。经过复性可使重组蛋白折叠成具有活性的正确构型。获得了上述高纯AC即蛋白后，进行ELISA反应，较合适条件为抗原包被浓度为0.26-4.1iig/mL，鹅血清稀释度为1:25_1:100，羊抗鸡IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1:1000-1:4000，封闭液为1%BSA或5X脱脂奶，待测血清和二抗均于37t:反应l-2h，底物于室温显色10-20min。最优选条件为抗原包被浓度为2.05yg/mL，鹅血清稀释度为l:50，羊抗鸡IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1:2000，封闭液为1%BSA或5%脱脂奶，待测血清和二抗均于37t:反应1.5h，底物于室温显色10min。采用上述间接ELISA方法检测出的抗体效价的阴阳性临界点为0.25。本发明根据上述方法，还提供一种采用间接ELISA方法检测鹅圆环病毒抗体的快诊板产品，即将包被好抗原的酶标板用封闭液封闭后洗涤吸干水分，密封后得，所述抗原为原核表达的鹅圆环病毒重组核衣壳蛋白。上述快诊板，其中所述包被抗原的浓度优选为0.26-4.1iig/mL。上述快诊板，采用的封闭液为1%BSA或5X脱脂奶。上述快诊板可直接用在间接ELISA方法检测鹅圆环病毒抗体中，具体反应条件分别为鹅血清稀释度为l:25-1:lOO，羊抗鸡IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1:1000-1:4000，封闭液为lXBSA或5X脱脂奶，待测血清和二抗均于37t:滴于所述快诊板上反应l-2h，底物于室温显色10-20min。图1是本发明实施例中ACap蛋白的诱导表达、提纯与复性的电泳图，其中A:1:诱导前；2:IPTG诱导4小时后；3:超声裂解液离心沉淀；4:超声裂解液离心上清；5:包涵体洗涤后；6:洗涤上清液；7:8M尿素超声离心沉淀；8:8M尿素超声离心上清;9:蛋白mark;B:1:过柱前；2:过柱后；3:复性后上清；4:复性后沉淀；图2是间接ELISA方法对几个鹅群血清的测定结果。具体实施例方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。—种采用间接ELISA方法检测鹅圆环病毒抗体的方法，其采用原核表达的鹅圆环病毒重组核衣壳蛋白作为ELISA检测的包被抗原，以HRP-羊抗鸡IgG酶标抗体作为二抗，进行鹅血清GoCV抗体的间接ELISA方法检测。具体的试验过程如下1材料与试剂1.1菌株含融合表达GoCV外壳蛋白重组质粒pET-28a-AC即的BL21(DE3)工程菌，由发明人构建(构建方法见参考文献余旭平等，鹅圆环病毒重组核衣壳蛋白的原核表达，中国预防兽医学报，2008年7月第30巻第7期，P505-509)，在IPTG诱导下能融合表达鹅圆环病毒缺失核定位序列的核衣壳蛋白(ACap蛋白)。1.2血清(l)GoCV阴性血清首先以10份正常鸡的血清混合作为阴性参考血清，建立方法；随后对经PCR反复多批次检测为GoCV阴性的1个种鹅群及其商品鹅的血清进行抗体检测，并与PCR确认为阳性的鹅群采集的血清的抗体测定结果相对照，确认该种鹅群为阴性群；以该种鹅群4个批次(2批次种鹅、2批次商品鹅)共38份血清为阴性参考血清进行平均值和标准差的计算，确定阴阳性临界点。(2)GoCV阳性血清自宁波某自繁自养(外来品种)鹅场的商品肉鹅采集法氏囊，经核酸抽提和PCR检测发现GoCV具有很高的检出率(4/5)，确定该场为GoCV阳性种鹅场。采集该鹅场1年龄左右种鹅11份血清，每份各取100iiL混合，作GoCV阳性血清样品；另选取经PCR和抗体检测确认为阴性的种鹅群所产的雏鹅，隔离饲养，于3周龄时用GoCV阳性组织病毒样品进行攻毒，一直饲养到16周龄扑杀，采集血清，合并作为GoCV阳性血清。采集宁波另一自繁自养(本地浙东白鹅)鹅场1年龄左右种鹅的血清10份，作为GoCV阳性待检血清，用建立的ELISA方法进行血清抗体检测。(3)鸡大肠杆菌01、新城疫阳性标准血清购自中国兽医药品监察所，禽流感H5、H9阳性标准血清购自哈尔滨兽医研究所，小鹅瘟、鹅副粘病毒病等阳性血清，本实验室保存。51.3主要试剂羊抗鸡IgG辣根过氧化物酶标记抗体为德国SBA公司产品；镍琼脂糖凝胶购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司，其它试剂为国产分析纯。2方法2.IELISA抗原的制备与纯化2.1.1目的蛋白初步纯化将含阳性重组表达质粒的工程菌接种于10mLLB液体培养基中(含50ug/mL卡那霉素)，37。C振荡培养过夜，按1%的量转接10mLLB液体培养基(含50ug/mL卡那霉素)，37t:振荡培养，待0D6。。值达0.6左右，加IPTG至终浓度为lmM，诱导4h。离心收集菌体，经超声破碎后离心收集包涵体，分别以含4M尿素、1%Triton100的缓冲液对包涵体进行洗涤，重复两次，最后用8M的尿素溶解包涵体。离心后取上清，用镍琼脂糖凝胶柱进行进一步纯化，用咪唑洗脱，具体操作参照试剂使用说明。2.1.2目的蛋白的复性采用透析法复性GoCV外壳蛋白将用8mol/L尿素溶解的包涵体溶液装入已处理好的透析袋内，置于复性缓冲液(含不同浓度尿素的0.02MpH7.4PBS)中，在4。C下进行梯度透析，复性缓冲液中尿素浓度依次递减，分别为4mol/L、2mol/L、lmol/L、0.5mol/L和Omol/L，蛋白复性换液间隔时间为10h-12h。2.2间接ELISA检测方法的建立2.2.1抗原包被浓度和血清工作浓度的确定采用棋盘滴定法确定抗原的最适包被浓度和血清稀释倍数将ACap蛋白用包被液(0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液)做8.2iig/ml、4.1iig/ml、2.05iig/ml、l.02iig/ml、0.51iig/ml、0.26iig/ml共6个倍比稀释度，每稀释度每孔100yL，4。C包被过夜；将包被好的酶标板用PBS-T(含0.5%Tween20的0.01MpH7.4的PBS)洗涤，用5%脱脂奶粉封闭液封闭；用封闭液将GoCV阳性血清和阴性血清进行i:25、i:50、i:ioo、i:200倍稀释，组成方阵以HRP-羊抗兔IgG(l:2000)为二抗，OPD显色。具体操作按常规间接ELISA进行。2.2.2封闭液确定以最适抗原浓度包被酶标板，洗涤后，分成3组分别用5%脱脂奶粉，1%明胶、1%BSA等3种不同的封闭液进行封闭。封闭时每孔均加入200i!L，每孔重复2次，37。C作用2h。洗涤后，加入阴阳性血清，按常规间接ELISA程序进行，比较阳性血清和阴性血清的0D492值及P/N值，以确定最佳包被条件。2.2.3血清最适作用时间的选择以最适抗原浓度包被酶标板，血清按最适稀释度稀释，分别作用30、60、90、120min，按间接ELISA程序进行，取平均值。选取阳性0D值在1.0附近，P/N比值最大的一组作为最适血清作用时间。2.2.4最佳显色时间的确定室温避光条件下，设立四组显色时间，分别为5min、10min、15min、20min，比较0D492值和P/N值，以确定最佳显色时间。2.2.5间接ELISA方法阴阳性的判断对经PCR反复多批次检测为GoCV阴性的1个种鹅群及其商品鹅的血清进行抗体检测，并与正常鸡血清及与PCR确认为阳性的鹅群采集的血清的抗体测定结果相对照，确认该种鹅群为阴性群；以该鹅群的种鹅和商品鹅血清为阴性血清，按优化好的条件进行间接ELISA操作，检测0D492值，每个个体的血清单独检测。通过对4个批次共38份血样进行测定，求得OD平均值(Average)X，标准差(StandardDifference)SD，并设定阴阳性临界值为X+3承SD，大于该值定为阳性，小于为阴性。2.2.6特异性试验以纯化的ACap蛋白包被酶标板，分别对鸡大肠杆菌、新城疫、禽流感、小鹅瘟、鹅副粘病毒病等阳性标准(参考)血清，按建立的间接ELISA方法进行操作测定，每孔重复2次，以确定该方法的特异性。2.2.7重复性试验2.2.7.1批内重复性试验用同一批制备的重组AC即蛋自包被酶标板，取5份GoCV抗体水平不同的血清和l份阴性血清在不同时间，应用本方法进行检测，每份样品重复4孔，结果进行统计学分析。2.2.7.2批间重复性试验取3份不同时间制备纯化的AC即蛋白(批次分别为070925，071213和080125)，经包被、封闭后，将阳性血清和阴性血清在相同条件下进行检测，每份血清检测4孔，结果进行统计学分析。2.2.8快诊板保存期试验将包被好的酶标板用封闭液封闭后洗涤吸干水分，用塑料袋密封后，分别置于-2(TC冰箱中和4t:冰箱中保存2周、3周、4周、6周、8周，进行间接ELISA检测。2.2.9间接ELISA方法初步应用取PCR检测为GoCV阳性的宁波某鹅场1年左右的10份鹅血清，以及用于阴性(4批次38份)和阳性(11份)对照的血清，按建立好的间接ELISA检测方法进行抗体检测。3结果3.1AC即蛋白表达、纯化和复性含重组质粒pET-28a-AC即的BL21(DE3)工程菌经IPTG诱导后GoCV外壳蛋白(AC即，已缺失核定位序列)获得了较高水平的表达(图1A，泳道1，2)，经Bandscan4.5生物图象分析软件分析其表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的18.6%。菌体经超声破碎后离心，发现融合蛋白均在沉淀中，上清液未见可见的条带(图1A，泳道3，4)，可见融合蛋白是以包涵体形式存在。分别以含4M尿素、1%Triton100的缓冲液对包涵体进行洗涤，除去部分杂蛋白(图1A，泳道5，6)。最后用8M的尿素溶解包涵体(图1A，泳道7，8)，并进一步对粗提蛋白进行镍柱纯化，经洗涤条件等探索，获得了高纯度的AC即蛋白，经Bandscan4.5扫描分析纯度达95.5%(图1B，泳道2)。纯化后的蛋白如果直接对水进行透析复性，其复性率很低(小于10%，数据未给出)，本发明经透析条件的摸索，在不同浓度的尿素中梯度复性，最终获得了GoCV融合外壳蛋白的高效复性(图1B，泳道3，4)。3.2最适包被浓度与血清稀释度由表1可知，随着抗原浓度的减少和血清稀释倍数的增大，血清0D492值逐渐降低，当重组蛋白抗原的包被浓度为2.05iig/ml，血清50倍稀释时，阳性血清的0D492值在1.0左右，且阴性血清(正常鸡血清)OD舰值低，P/N值高。一般酶标仪在OD值为l.O左右时误差最小，反应敏感。据此，我们确定抗原的包被浓度最优为2.05ug/ml，血清的稀释度为i:50。表1重组蛋白包被浓度及血清稀释倍数的测定<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注+:表示阳性血清；_:表示阴性血清3.3最适封闭液从表2中可知，用1%BSA、5X脱脂奶粉的封闭时P/N值均较高，考虑到经济与方便性，本发明优选5%脱脂奶粉作为封闭液。表2封闭液的确定<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.4血清最适作用时间从表3可知当一抗血清的作用时间为1.5h时，其阴、阳血清0D492值之比最高，且阴性血清数值比较低。因此，可确定一抗作用时间优选为1.5h。表3—抗血清不同作用时间的0D492测定值作用时间阳性血清阴性血清P/N值0.5h0.5070.0677.6lh0.8840.1038.51.5h1.1130.1349.82h1.2370.1647.63.5最佳显色时间按照确定的最适条件进行ELISA检测，底物室温避光作用时间分别为5min、10min、15min、20min，测其0D492数值如表4。可知在底物作用10min-15min时读数，数值均接近1.0且P/N值均较大。因此，确定实际操作的底物作用时间优选为10min。表4显色时间的选择显示时间5min10min15min20min阳性OD柳0.6331.0161.0591.276阴性OD柳0.0350.0940.1090.132P/N值_^_^_^_9.63.6阴阳性临界值的确定按优化的抗原包被浓度、血清稀释倍数、封闭条件、显色时间进行间接ELISA，测得4个批次阴性鹅的38份血样的0D492值，其范围在0.0750.237。经统计其平均值为0.131，标准差为0.0383，按公式X+3ASD确定间接ELISA的阴阳临界值为0.246，为便于判断，以OD舰>0.25判为阳性，OD舰<0.25判为阴性。3.7特异性实验交叉反应试验结果如表5所示，可见各标准阳性血清的0D492值均小于0.25，表明重组蛋白不与大肠杆菌、新城疫、禽流感H5、H9、小鹅瘟、鹅副粘病毒等阳性(参考)血清反应，仅与GoCV阳性血清反应，说明我们建立的以AC即重组蛋白为包被抗原的ELISA方法具有很好的特异性。表5交叉反应试验血清鸡大肠鸡新城禽流感禽流感小鹅瘟鹅副粘GoCVGoCV杆菌疫H5H9病毒阳性阴性OD4920.2010.1220.1410.1280.1730.1461.2410.1323.8重复性实验批内重复试验结果见表6，批间重复试验结果见表7。如表6和表7所示，批内重复试验的变异系数基本小于10%;三个批次的抗原检测的阳性、阴性血清检测的OD值，其变异系数也在10%左右。表明该方法具有良好的重复性。表6批内重复性试髮<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表7批间重复性试验<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.9快诊板保存期试验抗原包被封闭后的快诊板分别于4t:和-201:保存，对不同保存期的快诊板用同一份血清样品进行检测，结果保存于-2(TC(8周)的快诊板阴阳性血清的变异系数都小于10%，而保存于4°。(2周)的快诊板阴阳性OD值明显增大(数据未给出)。这可能是4。C保存的快诊板易受污染而微生物滋生，使包被的AC即或封闭用的脱脂奶粉等发生变性，造成非特异性吸附和反应的缘故。3.10间接ELISA方法初步应用结果应用建立好的间接ELISA检测方法，对1岁左右的阳性鹅群共10份血清进行抗体检测，结果6份阳性4份阴性，阳性率60%;而用于阳性对照的ll份阳性血清的测定结果为10份阳性1份阴性，阳性率为90.9%;结合用于阴阳性界限判定的4个批次的38份阴性鹅血清一起作图，结果见图2。4结论到目前为止，GoCV尚不能通过细胞培养进行病毒增殖，因此给GoCV的研究，包括GoCV感染的流行病学调查带来极大的困难。目前GoCV的检测主要是通过PCR、斑点杂交等核酸学方法，但应用PCR等核酸学方法开展的分子流行病学检测需要扑杀鹅取样，操作不够简便快捷。而ELISA检测方法具有简便、快速、批量检测等优点，且检测仅需要少量的血清样品。因此，建立GoCV的ELISA检测方法，非常有利于大面积地开展鹅圆环病毒感染的流行病学普查，同时也为GoCV的致病性和免疫机制等进一歩研究提供技术手段，具有重要意义。应用本实验获得的高纯度GoCV重组AC即蛋白做为包被抗原，并应用商品的羊抗鸡酶标抗体可替代抗鹅二抗(试验显示进口二抗较自制的兔抗鹅二抗结果更佳，数据未给出)，这为GoCVELISA检测方法的建立奠定了重要基础。但由于国内外对GoCV的相关研究较少，且无标准GoCV阳性血清及阴性血清，给方法的建立带来了困难。英国学者Scott等以SFV真核表达载体表达的鹅圆环病毒Cap蛋白为抗原，以兔抗鸭荧光抗体为二抗，通过有无荧光染色判断阴阳性，建立了间接免疫荧光检测法，并对不同的鹅群的血清进行了GoCV抗体检测，发现大于l年的鹅群其抗体阳性率达88.7%，且血清中圆环病毒抗体荧光强度1年以上的鹅要比1年以下的鹅普遍较强。我们采集了经PCR检测其商品鹅为高阳性率(4/5)的对应群种鹅(1年龄左右)血清11份，每份血清各取lOOiiL等量混合作为阳性血清(随后的血清样品个体检测结果也显示，该11份血清阳性率为90.9%，它们的ELISA测定值在0.196-1.973之间，数据见图2);由于圆环病毒具有严格的感染动物种属特异性(鹅圆环病毒不会感染鸡)，因此我们首先以正常鸡血清为阴性血清，确定ELISA条件，建立方法；以经PCR反复多次检测为GoCV阴性的1个种鹅群不同批次的血清为假定阴性血清，用建立的ELISA方法对该4个批次的38份血清进行复核，结果测定值均很低，在0.0750.237间，而同时进行对照测定的阳性群的值有高有低，变异范围很大(0.196-1.973)，二者区别明显；由此，经2种方法复核，确定该种鹅群为阴性群，并经计算确定阴阳性0D临界值为0.25。在试验中我们利用建立好的间接ELISA检测方法，对经PCR检测为GoCV阳性的另一个1年左右鹅群的10份血清进行GoCV抗体检测，结果其血清抗体阳性率为60.0%(6/10，见图2)，该结果与Scott等对相同日龄GoCV阳性鹅群检测的抗体(IFA法)阳性率基本符合。相对地，IFA法只能定性地确定是否为抗体阳性，而本发明建立的GoCV间接ELISA检测方法能很好的显示血清中GoCV抗体效价，并对抗体情况进行量化。GoCV的血清抗体间接ELISA检测方法的建立，为进一步了解GoCV的流行情况及疾病防控等提供了方便。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。权利要求一种采用间接ELISA方法检测鹅圆环病毒抗体的方法，其特征在于，采用原核表达的鹅圆环病毒重组核衣壳蛋白作为ELISA检测的包被抗原，以HRP-羊抗鸡IgG酶标抗体作为二抗，进行鹅血清GoCV抗体的间接ELISA方法检测。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，ELISA反应条件分别为抗原包被浓度为0.26-4.1iig/mL，鹅血清稀释度为1:25_1:100，羊抗鸡IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为l:1000-1:4000，封闭液为1%BSA或5X脱脂奶，待测血清和二抗均于37t:反应l-2h，底物于室温显色10-20min。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，ELISA反应条件分别为抗原包被浓度为2.05g/mL，鹅血清稀释度为1:50，羊抗鸡IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1:2000，封闭液为lXBSA或5X脱脂奶，待测血清和二抗均于37t:反应1.5h，底物于室温显色10min。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用所述间接ELISA方法检测出的抗体效价的阴阳性临界点为O.25。5.—种采用间接ELISA方法检测鹅圆环病毒抗体的快诊板，其特征在于，将包被好抗原的酶标板用封闭液封闭后洗涤吸干水分，密封后得，所述抗原为原核表达的鹅圆环病毒重组核衣壳蛋白。6.如权利要求5所述的快诊板，其特征在于，所述包被抗原的浓度为0.26-4.1iig/mL。7.如权利要求5或6所述的快诊板，其特征在于，所述封闭液为1XBSA或5X脱脂奶。8.权利要求5-7任一项所述的快诊板在间接ELISA方法检测鹅圆环病毒抗体中的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，ELISA反应条件分别为鹅血清稀释度为i:25-1:ioo，羊抗鸡igG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为i:iooo-i:4000，封闭液为1%BSA或5%脱脂奶，待测血清和二抗均于37t:滴于所述快诊板上反应l-2h，底物于室温显色10-20min。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，ELISA反应条件分别为抗原包被浓度为2.05iig/mL，鹅血清稀释度为1:50，羊抗鸡IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1:2000，封闭液为1%BSA或5%脱脂奶，待测血清和二抗均于37t:反应1.5h，底物于室温显色10min。全文摘要本发明公开了一种采用间接ELISA方法检测鹅圆环病毒抗体的方法，其采用原核表达的鹅圆环病毒重组核衣壳蛋白作为ELISA检测的包被抗原，以HRP-羊抗鸡IgG酶标抗体作为二抗，进行鹅血清GoCV抗体的间接ELISA方法检测。本发明能够快速、敏感、特异地利用鹅血清检测鹅圆环病毒抗体，便于大规模应用且不需要扑杀动物。本文建立的间接ELISA方法具有较好的特异性、重复性，为调查GoCV的流行情况提供了便捷的手段。文档编号G01N33/569GK101776687SQ201010122698公开日2010年7月14日申请日期2010年3月2日优先权日2010年3月2日发明者于洪涛,余旭平,俞永裕,刘晓宁,孙红霞,胡东建,赵秀玲,郭婧,陈维虎申请人:浙江大学