专利名称：通过同时测量至少两种不同分子标记物来提高检测肿瘤及其前体阶段时的临床特异性的方法
通过同时測量至少两种不同分子标记物来提高检测肿瘤 及其前体阶段时的临床特异性的方法
本申请是申请号为01143708.1、申请日为2001年12月18曰《 发明专利申请的分案申请.
背景技术：
癌性疾病仍然是全球最常见的致死原因之一.临床上存在对癌症 和癌前期的早期识別和特定检測方法的需求.此外，肿瘤的更详尽的 特征描述至关重要，以便得出有关治疗和预后的推论.这是有效的， 因为不同的癌症亚型对所施用的治疗措施产生相异的反应.因此，譬 如，当被怀疑为乳腺癌时，会更加頻繁地求助于对分子标记物的免疫 组织化学染色，例如细胞角蛋白、雌激素受体、her2/neu、 K167或 p53(例如Leek等，1994, Br. J. Cancer, 69, 135-139; Mokbel 等，1999， Am. L Surgery, 178, 69-72; Reiner等，1990, Cancer, Res. ， 50, 7057-7061).而这些染色常常通过乳腺活组织检查进行， 通过针穿刺(FNA-细针吸活检)进行染色也日益增多.分子标记物也 用于有关判定肿瘤是否是原发性肿瘤或转移中.例如，对原发性感染 器官特异性的标记物的表达可以有助于这种筌定.
近年来，业已養定了大量的基罔，作为突变的结果，它们以变化
了的方式表达其蛋白，罔而在癌的发生中起了作用.作为诊断标记
物，可以在血清和细胞水平检测到相应的蛋白质.这些蛋白质参与细
胞中多样性的生理调节过程，例如生长调控(增殖基因，例如Ki67和
mcm-5:致癌基因和肿瘤抑制基因，例如p16、 EGF受体、her2/neu
和mdm-2)、细胞消亡(自然细胞死亡，例如p53和bcl-2)、 DNA修复
(msh-l)和细胞粘着(E-钙粘着蛋白、p-连环蛋白和APC).譬如，试
验对抗上述蛋白质的特异性抗体的免疫组织化学和免疫细胞化学检
测方法适合这样的检測(van Noorden, 1986, Immunocytochemistry,
Modern Methods and Applications, 2nd edition, Wright, Bristol, 26-53).
已经多次证实单一标记物不足以获得有关识別病变细胞的特异 性，因为它存在于一些健康细胞中.这所基于的事实是，这些标记物 可以是参与健康细胞中的生理调节过程且只被过分高度表达的蛋白 质，所述的过分髙度表达是病变细胞的一个指征.Williams等(1998,
PNAS, 95, H932-H937〉描述了 DNA复制标记物nc旭-5，其检測出子 宫颈涂片的28种试验损伤/肿瘤(n-58),但在这28种正常涂片中也 提供2种错误的阳性染色.Sano等(Pathology Intl. ， 1998, 48, 580-585)报导了标记物pl6在15种正常宫颈活组织中的3种非特异 染色.虽然事实上可以在子宫劲的100%的全部损伤和肿瘤中检测到 HPV,但也可以在许多正常子宫颈上皮中检测到HPV;即，虽然检测 HPV的试验高度敏感，但它只具有低的特异性(例如Cuzick, 2000, JAMA. 283, 108-109).
在病理学中，人们对检测生物样本中多种标记物日益感兴趣.一 方面，这能够获得更多有关检测和定性病变细胞或組织区域的可利用 信息；另一方面，可以识別出各个标记物的非特异染色是什么并且由 此避免不正确结论.传统上，出于这种肖的制备了可利用活組织的连 续切片或机体样本的多种标本(例如宫颈涂片在罔定剂中)，随后其分 别用特定标记物染色.这种方法存在若干缺点患者样本材料的高度
耗费，而样本材料通常是有限的；染色试剂的高度消耗；需要大量的 时间且成本较高；而且也不可能在细胞或組织样本的特定区域中同时 清晰地探測出两种或多种标记物.虽然文献中业已报导了在生物样本
中两种或多种不同生物标记物的同时检测(DAKO,免疫蘇双染色法实 践指南；Gomez等，Eur J. Histochem., 1997. 41, 255-259),但 该途径至今无法应用到常规诊断中，罔为这些方案在任何程度上都无 法标准化，Terhavauta等人(Cytopathology, 1994, 5， 282-293) 采用p53和Ki67在取自子官颈损伤的活组织中的双重染色，并且在 一个细胞的某些情况中可以由HPV阳性和HPV阴性损伤衍生的基细胞 和副基细胞中检測到这两种标记物.然而，同时，作者没有利用由上 述双重染色所获得的信息，通过合并所得的结果，来描绘出有关这个 样本中肿瘤细胞存在的可靠结论.完全没有任何从自动检测肿瘤区域 的立场出发利用染色信息的尝试.而且，除了这种联合之外，没有提 及任何其它可能有利于肿瘤区域的筌定和定性的标记物联合物.
其它在肺的肿瘤活组织上进行的双重染色在Kraeft等(Clin Cancer Res. 2000, 6, 434-442〉和Oshika等(Mod Pathol, 1998, 11, 1059-1063)中提及.这些参考文献中提及的抗体联合物完全不同于本 发明所基于的联合物.而且，上述两篇公开物另外要求评估活組织染
色的病理学家作出诊断.这种途径在概念上与方法的自动化毫不相 容，由此迄今无法加以考虑.
Rao 等 (1998, Cancer Epidemiology, Biomarkers and Evolution. 7, 1027-1033)描述了多种肿瘤相关性标记物(DNA含 量、G-肌动蛋白和p53)在取自乳腺组织的针穿刺材料(FNA,细针吸活 检)中的多重染色.他们解释了其结果与使用多种标记物获得比由单 独标记物的观察更加高的临床特异性的影响，并此在乳腺癌的早期识 別中发挥重要作用，作者所指出的多重染色仅限于由乳腺组织获得的 针穿刺材料，因为材料的不同特性，无法应用于其它生物材料(即活 组织和子宫颈涂片).而且，所述的标记物联合物不同于本发明所提 及的联合物.他们不曾尝试从肿瘤区域的检测自动化的立场上利用这 些染色信息.
现有临床肿瘤诊断的进一步改进在于两个方面， 一方面是样本制
备和染色的自动化，另一方面是自动困像分析，自动困像分析中包括 诊断的确立.除了节省时间且需要较少的人力以外，这条途径也可以 更加客观，并由此使诊断更加统一.用荧光或用显色染料对肿瘤细胞 或其前体中的生物标记物的染色能够做到使信号定量并由此以自动 方式读取它们.能够以自动方式实现染色方案的体系业已存在.然 而，困象分析没有被用于获得自动化诊断(LeNeel等，Clin Chim Acta, 1998, 278, 185-192).最先进的体系包括利用形态学困象信息自动 化检测子宫颈涂片中的肿瘤细胞及其前体(Sawaya等，Clinical Obstetrics and Gynecology, 1999, 42， 922-938:Stoler, 2000, Mod. Pathol, 13, 275-284).
除了利用PAPNET体系自动化形态检测子宫颈涂片中的异常细胞 以外，Boon等(1995, Diagn. Cytopathol, 13, 423-428)也使用Ki67 抗体对增殖细胞的免疫组织化学染色.然而，这种单一分子标记物的 使用无法进行任何明确地区分良性增殖细胞和致癌细胞.但是，这些
作者不曽采用至少两种分子标记物的同时检测来鉴定异常细胞.
作者为Boon等的专利(US- 5544650〉描述了采用免疫化学标记 物的染色如何有利子样本中增殖(致癌性和非致癌性〉鈿胞的自动化 检测，并且如何在半自动过程中，监控病理学家/细胞学家进而可以 判断被染色细胞是否真的为致癌细胞.然而，其中没有提及任何能够
以自动化方式检測异常或肺瘤细胞的特异性抗体的联合物.
专利US - 6005M6(其作者为McGlynn和Akkapeddi)提供了同时 检测机体样本中多种荧光标记的标记物的装罝和方法的详细描述，包 括出于鉴定癌细胞的目的装置和方法，但并没有涉及到癌症诊断的具 体应用中或提及适当的标记物联合物可以产生较高的特异性.
已知Ampersand Medical Systems Group (www, ampersandmedical. com) 正在开发一种新的用于宫颈涂片的筛选系统(InPath〉，除了公司内部 所拥有的样品标本以外，还包括使用荧光进行非特异生物标记物的检 测.

发明内容
发明目的
本发明描述了一种通过使用规定的标记物联合物可以用于測定 病变细胞、优选癌细胞及其前体的自动化方法.
根据本发明，这可以通过本专利权利要求书中所详述的主题来获得.
概述/目的实现
本发明基于申请人的发现是通过细胞或组织样本中至少两种特 异性分子标记物(也就是基罔表达中与疾病有关的变化〉的同时检测 可以提高对病变细胞、优选癌及其前体的检测的特异性；和一种更加 特异的检測方法；和一种此后可以自动化的方法；该方法是在检测多 种标记物并合并和确认信号的基础上得到的. 发明详迷
本发明涉及分子标记物，其在单独检測时无法获得有关识別病变 细胞或组织的足够特异性，因为它们也以相似或相异的量存在于某些 未病变的生物材料中.这是基于这些标记物可以是参与健康细胞中生 理调节过程的蛋白质的事实.此外，由于抗体以非特异方式的交叉反 应，分子标记物的检测可能不清晰，这表现在未含有分子标记物的生 物材料的顆粒被染色.本发明人已经观察到，通过同时检測细胞中或 生物材料的组成区域内(例如组织切片的狭窄规定的区域内〉至少两 种标记物，可以弥补羊一标记物栓測的特异牲缺陷，从而在栓測异常 细胞或组织节片时确保较高水平的特异性.所以，当诊断生物样本时 通过联合多种标记物可以获得比使用单一标记物更高的信息价值.
标记物联合物包含属于至少一种下列类型的基罔的改变表达的
显色致癌基因、肿瘤抑制基因、细胞凋亡基因、增殖基因、修复基 罔和病毒基因；例如，通过分子标记物her2/neu、 p16、 p53、 Ki67、 MN、 mdB-2、 bcl-2和EGF受体的联合物所示.特別优逸下列联合物 her2/neu和Ki67、 her2/neu和p53、 he:r2/neu和bcl-2、 her2/neu 和pl6、 bcl-2和Ki67、 bcl-2和p53、 bcl-2和p16、 p16和p53、 p16和Ki67.
根据本发明，申请人的发现可以应用在疾病相关性细胞或组织节 片的早期诊断的方法中，所迷的方法包含以检测癌及其前体为目标检 测上述分子标记物的联合物，而且另外如果必要以自动方式检测转移 的起源.通过下面的方法可以达到肿瘤细胞的自动化和特异性检测 首先，细胞或机体样本的限定区域内必须存在这两种信号，其次，两 种标记物所产生信号必须在各种情况中高于或低于各自的规定强度 或阈值.当采用这两种标准时，可以排除健康细胞，例如那些表达一 种标记物高于设定阈的健康细胞，或表现两种标记物在各种情况中低 于所规定的信号强度的健康细胞.
术语"分子标记物"包括细胞中的分子变化，特別是基因表达的变 化，已经观察到其与改变了的或病理性的细胞构造有关.检测分子标 记物的方法包含任何可以测定标记物的數量或质量的方法，优选在蛋 白质水平上測定的方法，
利用抗体或其他特异性结合的蛋白质(例如抗cullins〉适合在蛋 白质水平进行检测，其允许包括显色和/或荧光检测的后续细胞化学 或组织化学检测.
短语"至少两种特异性分子标记物的同时检测"包括使机体样本 中至少两种基因表达显色的方法，特別是机体样本的单一标本中，由 此可以观察到彼此有关的基因表达.就此，不仅至少两种信号的存 在，而且一种或多种附加信号的存在或不存在，其都是可能组合的信 息值.除了肿瘤特异性以外，这种进一步的信息可以包含有关转移的 起源的结论.因此，以相对空间邻近检測被測的标记物非常重要，特 別是在一种細胞中或在样本的狭窄規定区城内，如组织切片的区城 内.
短语"合并和确认信号"包括将至少两项的信息连接，所述的信
息是在检测机体样本中的至少两种标记物的基础上获得.此外，通过 规定标记物强度的阈值可以特异性地将健康细胞与患病细胞区分 开.
短语"细胞或组织样本"包括由机体样本分离的细胞，例如涂片、 唾液、器官穿剌液、活组织、分泌物、脑脊號液、胆汁、血液、淋巴
液、尿和粪便；或从器官取得的组织，例如乳腺、肺、肠、皮肤、子 宫颈、前列腺和胃.因此，组织样本包含机能相关细胞或相邻细胞的 区域.
短语"病变细胞"包括癌及其前体，优选呼吸、生殖和胃砀道的 癌；和皮肤、乳腺和血管系统的肿瘤，而且特別是乳腺癌和子宫颈癌 及其前体，例如子宫頭上皮内瘤形成(CIN I-III)和原发癌.
术语"自动化检测，，包括其中全部或只在组成步骤中代替人工的 手工操作的方法，并且特别是用于检测过程的步槺中或相关后继文件 或信息的处理中.这包括样本制备、样本染色、样本读取和信息处理 的步骧.因此，通过吸收測量、反射测量或荧光测量的方式可以实现 检测，荧光测量方法包括所有方法如荧光显徵镜或FACS(流通式血细 胞计数器)分析.
术语"诊断专家系统，，包括将困象信息转化为建议性诊断的计算 机软件.基于软件中存在的参数，或基于软件可以存取的外部信息， 这种专家系统能够将全部或部分的可利用信息归纳为建议性诊断.如 果需要其它参数来确立建议性诊断，软件可以提出收集这些参数，或 通过链接到适当分析设备上、利用反射性算法自动地访问这个系统.
术语"扩增系统"包括生物化学方法，其能够增强信号强度从而产 生更优越的适合特异性检測分子标记物的信号/噪音比.这通常是利 用附加抗体和/或醃检测反应来获得.
可以利用本发明特异性地检测病变细胞，例如癌及其前体，并且 用于测定转移的起源.本发明还涉及实施本发明方法的试剂盒，这种 试剂盒含有下列组成
(a) 检测至少两种分子标记物的试剂，也就是标记和/或未标记的 抗her2/neu, p16、 pS3、 Ki67、 MN、 mda-2、 bcl-2和EGF受体的抗 体.
(b) 常规辅剂，例如緩冲刑、栽体、信号扩增物质、染色剂等. (C)制备和染色样本以及检测信号的自动化方法. (d)作为对照反应的细胞系的染色方案和试剂.
上述评价适于所述试剂盒的各个组分.所述试剂盒的单一组分或 多种组分还可以以改变了的形式使用，
本发明可以手动或以部分或全部自动化的方法来检测病变细 胞，例如癌及其前体.由于按照本发明并由同时检测至少两种分子标 记物获得的结果未经过任何主观评估，而且相反地，却有利于生物材 料中病理性变化的客观的、自动化检测，所以形态学的发现可以用客 观参数补充，也可以以"反射性试验"的形式.由于所述的方法可以 快速且以自动化方式操作，所以其适合大规模的筛选方法，其在成本 和人力上均很经济.除此以外，两种以上标记物的组合染色使诊断不 同的病理性变化并测定转移的起源成为可能.
罔此，本发明给疾病的现代诊断带来了重大贡献.具体实施方式
实施例
下文将通过举例的方式提供实施上述发明的方案.这些实施例具
体化了精确条件，其在目前的情况中预先调整为使用Ventana自动染 色仪NEXES的结果.但这不以任何方式改变不同参数可以改变的事 实，也就是可以与其它设备相匹配的事实，所述的参数例如是培养和 洗涤温度、培养和洗涤时间以及抗体和其它试剂的浓度.此处所述的 扩增系统同样可以被忽略，或者可以增加新的，这取决于各自的抗体 或DNA探针.
使用特异性抗体并采用Ventana提供的Nexes自动免疫染色仪同时检 测活组织中两种分子标记物的试验的描述
首先从活组织制备4 - 5jiin厚的石蜡切片(Leica提供的RM2155 切片机〉，将其罔定并包埋在石蜡中，切片在37X:下干燥过夜.为了 避免切片在有关后续染色中漂浮，使用用硅坑涂层的显微镜栽玻片. 为了染色，将石蜡切片在二甲笨中脱蜡2 x 15分钟并且随后穿过一 组浓度降低的醇(100%， 90%, 70%,各种情况中2 x 5分钟〉，以 便再次洗涤除去二甲笨.
用福尔马林固定导致搭交联鍵的形成，其掩蔽了抗原并由此使它 们无法被抗体利用.所以，需要进一步预处理.抗原在lOmM柠檬酸
緩冲液，pH 6中在600W徵波中解蔽30分钟.
经微波预处理之后，在Nexes(Ventana Medical Systems)自动 免疫染色仪中进行免疫组织化学染色.由Ventana Medical Systems 分別或以试剂盒的形式得到出初级抗体和血清之外的所有试剂.培养 全部是在37C下进行.该自动染色仪在每次培养之后用下迷试剂自动
洗条《
首先，内源性过氣化物踩用试刑盒中所含的"抑制剂"灭活4分 钟.任何可能的非特有结合位点随后用1.596山羊血清(得自Vector) 封阻10分钟.此后将切片用笫一单克隆抗体(her2/neu(克隆3B5〉， 得自Oncogene Scinece/BAYER, 2. 5ng/ml，存在于Ventana抗体稀 释緩冲液中)培养30分钟.
此后使用一种增强试剂盒来获得更加强化的染色结果.这种试剂 盒由兔抗小鼠免疫球蛋白和小鼠抗兔免疫球蛋白组成，其中的兔抗小 鼠免疫球蛋白先与结合的初级抗体反应，而且所迷的小鼠抗兔免疫球 蛋白依次与先前的兔抗小鼠免疫球蛋白结合.培养时间在各种情况中 为8分钟.使用的下一步试剂是"多联(MultiLink〉"抗体，其同样 培养8分钟，所述的"多联"抗体能够对抗小鼠和兔并且与生物素偶 联.这种抗体现在将结合全部三种先前培养的抗体并且大大提高了生 物素在初级抗体的反应位点处的量.下一步采用的试剂是抗生蛋白链 菌素-HRP(辣根过氧化物酶)，其在8分钟内加入并且与生物素结合. DAB(二氨基联苯胺)和作为该过氣化物酶底物的H202的加入进行检 测，同时这种底物被转化为褐色沉淀.
与上迷方法准确对应的第二种标记物的检测是从用1.5%山羊血 清封阻开始并且将第二种特异性初级抗体(p53，克隆DOl，得自 Oncogene Science/BAYER, 30叫/鹏1,存在于Ventana抗体稀幹緩冲 液中)培养30分钟，结束时，用抗生蛋白链菌素-ALP(威性磷酸蘇) 偶联物代替抗生蛋白链菌素-冊P偶联物.培养后，内源性威性磷酸 酶用左旋咪唑+ MgClz封阻.同时还加入ALP底物(坚牢红和萘酚〉. 此后，核用苏木精对比染色2分钟，进而切片在"蓝色试剂"中染色 2分钟.果后，显徵镜我玻片用MoviolTM(Hoechest〉夜j1. 自动检测组织样本中异常细胞的试验的描述，所述的细胞已通过同时 检测两种分子标记物染色
其中至少两种分子标记物已经按照上迷方法用抗体检測的活组 织用一个荧光显徵镜分析，所述的荧光显徵镜带有一 +可驱动的交叉
栽物台，栽物台至多可栽8个显微镜栽玻片(Olympus AX70,带有 肌lticontrol box 2000-3和"Modul Stage，，aimlySIS驱动软件)， 和Soft Imaging Systems GmbH(SIS)提供的analySIS3. 0软件的升 级版，其作为"Grabbit Dual Pro"SIS软件包包含附加模块，特別是 FFT(-"快速付里叶变换")模块、和MIA(-"多重困象校准(Multiple Image Alignment)")模块和C模块.用高分辦黑白(MV2 Slo霄Scan Camera, 12位，得自SIS)和彩色(DXC- 950P 3CCD芯片，得自Sony) 照相机记录田象.联用后，这些系统适于16位Grauton困象分析并 且适于RGB中彩色困象分析和HSI彩色空间，最离可达24位困象深 度.
校准可驱动交叉栽物台(analySIS Module Stage〉后，通过规定 "自动"菜单(analysis模块粒)中8个连续栽物台路径(stage path) 可以相对于"逻辑零点"记录最多8个显徵镜栽玻片的全部位置.生物 样本的总区域以综合方式分解为独立区域，所述的独立区城大小为 158,7pm x 119.6pm,其对应于用显徵镜部件放大的放大率为40倍 的相片的困象扇形区.各生物样本通过一个栽物台路径分析.各个栽 物台路径在水平方向上以曲折方式描绘出一系列的栽物台路径位 置，由此各个显徵镜玻片位置上的生物样本的各个区城是以邻接方式 而不是重叠方式、通过一个栽物台珞径位罝进行记录.规定相应的行 数和列数.在"自动"菜单中输入8个栽物台路径，使其能够以自动化 方式分析位于工作台上的所有标本，
各个栽物台珞径位置上的标本染色在透射光中成象，并且困像信 息在"操作"菜单中"色彩匹配"下"与PGB比较" 这确保了后继 的"测量"可以在"自动"菜单中进行.为了測量，通过"设定色彩 岡值"的方式规定"田像"茱单中最多8个不同混合色的阈值并用"象 素值/新"測定象素值.利用"测量"菜单中的"相分析"方式，借 助于色彩阈值測出各个栽物台路径位置的独立相片，所迷的色彩阈值 业已被定义，而且特定混合色的区城作为面积定童显示在Excel数振 文件中，当同时检測两个标记物时，检測反应的颜色，即"褐色"(DAB) 和"红色"(坚牢红)，以及其在样本区域中的混合("红-褐")特別令
人感兴趣.因此，对于各个独立栽物台路径(-样本)可以得到一个
Excel表，而且各列表示特定混合色的面积.Excel表的行相应于单 一样本区域的独立相片(-栽物台路径位置).
利用宏，将行(-栽物台路径位置〉中的各个值(-混合色的測量 面积)在各种情况中与规定的阈值对比，所迷的各列或混合色的阈值 已经预先测定.随后宏对独立值进行确认，如果行中的一个以上的独 立值大于各列中规定的混合色阈值，則该样本被定性为患病.
可以保存相应的困像位置，使它们能够为后续的視觉评估所利 用."自动"茱单中的"协议列表实用程序"记录卡可以用于自动保 存田像和各栽物台路径位置的其它数据.
尽管这些步碟可以手动进行，但它们也可以以自动化方式、通过
"附加"菜单中"记录宏"下创建的宏来进行，并且随后在"自动"菜 单中检索它们.最后，特定混合色的定量评估以面积值的形式(-生 物样本的面积，其作为用分子标记物染色的结果精确表现出规定的二
级色彩)获得.以这种方式，通过定量分析确认的混合色可以获得生 物样本的诊断性结论.
权利要求
1.用于鉴定癌细胞及其前体的自动化体外方法的用途，其特征在于同时检测细胞或组织样本中至少两种标记物，并且合并和汇总信号强度，并且至少一个分子标记物选自her2/neu、p16、p53、Ki67、MN、mdm-2、bc1-2和EGF受体。
2. 按照权利要求1的用途，其特征在于标记物的联合物是 her2/neu和Ki67、 her2/neu和p53、 her2/neu和bcl-2、 her2/neu 和MN、 her2/neu和mdm-2、 her2/neu和EGF受体、bc卜2和Ki67、 bcl-2和MN、 bcl-2和njdm-2、 bcl-2和EGF受体、her2/neu和bcl-2、 p53和bcl-2、 p53和MN、 p53和mdm-2、 p53和EGF受体、p16和p53、 p16和MN、 p16和迈dm-2、 p16和EGF受体、p16和Ki67、 p16和 her2/neu、 p16和bcl-2、 MN和mdm-2、 MN和EGF受体、mdm-2和EGF 受体.
3. 按照权利要求l的用途，其特征在于所述的自动化信息处理与 一个诊断专家系统连接，该系统将困像信息归纳为建议性诊断.
4. 按照权利要求1至3中任何一项的用途，其特征在于通过分析 组织样本的组成区域内的显色反应或荧光信号定量检测出所述的分子 标记物，其中将二级色彩或各个色彩的空间接近在使用至少两种标记 物提供附加信息时与单一染色比较.
5. 按照权利要求l-4中任何一項的用途，其特征在于检测乳腺、肺、子宫颈、结炀、皮肤和前列腺的肿瘤.
6. 按照权利要求1-5中任何一项的用途，其特征在于它包括反 射性试验.
7. 用于鉴定癌细胞及其前体的自动化体外方法，其特征在于同时 检测细胞或组织样本中至少两种标记物，并且合并和汇总信号强度， 并且至少一个分子标记物选自her2/neu、 p16、 p53、 Ki67、 MN、 mdm-2、 bcl-2和EGF受体.
8. 按照权利要求7的自动化体外方法，其特征在于标记物的联合 物是her2/neu和Ki67、 her2/neu和p53、 her2/neu和bcl-2、 her2/neu和MN、 her2/neu和mdm-2、 her2/neu和EGF受体、bcl-2 和Ki67、 bc卜2和MN、 bc卜2和mdm-2、 bc卜2和EGF受体、her2/neu 和bcl-2、 p53和bcl-2、 p53和MN、 p53和mdm-2、 p53和EGF受体、pl6和p53、 pl6和MN、 pl6和md迈-2、 p16和EGF受体、pl6和U67、 p16和her2/neu、 p16和bc卜2、 MN和mdm-2、 MN和EGF受体、幽-2 和EGF受体.
9. 按照权利要求7的方法，其特征在于所述的自动化信息处理与一个诊断专家系统连接，该系统将困像信息归纳为建议性诊断.
10. 按照权利要求7至9中任何一項的方法，其特征在于通过分 析组织样本的组成区域内的显色反应或荧光信号定量检测出所述的分 子标记物，其中将二级色彩或各个色彩的空间接近在使用至少两种标 记物提供附加信息时与单一染色比较.
11. 按照权利要求7-10中任何一項的方法，其特征在于检测乳 腺、肺、子宫頭、结肠、皮趺和前列腺的肿瘤.
12. 按照权利要求7-11中任何一項的方法，其特征在于它包括 反射性试验，
13. 用于实施权利要求7-12中任何一项的方法的试验试刑盒， 其中含有所有必要的试剂.
全文摘要
本发明涉及一种改进病变细胞的诊断的自动化方法，所述的标记物在与疾病相关的基因表达中显示出变化，该方法通过应用抗体和确认信号强度的联合同时使细胞或组织样本的组成区域中的至少两种不同分子标记物染色。
文档编号G01N21/64GK101105496SQ20071014265
公开日2008年1月16日 申请日期2001年12月18日 优先权日2000年12月18日
发明者B·舍珀, G·亨尼格, K·波曼, R·维尔茨 申请人:拜尔公司