专利名称：用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒，具体地说，涉及一种用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺 的检测试剂盒。
背景技术：
肿瘤标志物(Tumor Markers)是指由肿瘤组织产生或机体对肿瘤组织的反应而产 生的异常表达的活性物质，包括激素、酶、特异性和非特异性的糖蛋白或糖脂等。它们或不 存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的 含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞 功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。
多胺作为细胞的生长因子之一，其异常增加可诱发肿瘤，癌症患者尿液中多胺含 量明显高于正常人。精脒/精胺-Ni-乙酰转移酶(SSAT)可以降解多胺，其含量随多胺的 增多而增多，以降解多胺，维持多胺在体内的平衡。
金刚烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒药，美国于1966年批准其作为预防 药。1998年被批准用于甲型流感病毒感染性疾病的治疗，也一直作为帕金森病的治疗药。 正常人口服金刚烷胺后，在SSAT作用下可以转化成乙酰金刚烷胺，因此检测尿液中乙酰金 刚烷胺的浓度，可以反应体内SSAT的表达量，对恶性肿瘤的预测有重要意义。
然而，潜在肿瘤、体内炎症和心肌缺血等病症都能导致乙酰金刚烷胺浓度升高，为 此，本发明采用组合方法检测尿液中的乙酰金刚烷胺，可以排除体内炎症和心肌缺血病症 的假阳性干扰，使恶性肿瘤的预测准确性更高。
C-反应蛋白(C-Reactive Protein,简称CRP)是一种能与肺炎链球菌C多糖体反 应的急性时相反应蛋白，由肝细胞合成。广泛分布于人体，如胸水、腹水、心包液、关节液、血 液等处。C反应蛋白是细菌感染和严重组织损伤的一项诊断指标。其升高可见于组织损 伤、感染、外科手术、肿瘤、心肌梗塞及一系列急慢性炎症性疾病，如风湿性关节炎、全身性 血管炎、多肌痛风湿病等。可采用C-反应蛋白测定试剂盒(透射比浊法)检测人血清中的 CRP0检测原理人血清样品中的CRP与适量的特异性抗体结合，形成不溶性免疫复合物，使 反应液吸光度改变，在抗体量一定的条件下，吸光度改变的大小与人血清样品中的CRP含 量成正相关。
心肌肌钙蛋白I (Cardiac Troponin I，简称cTnl)是肌钙蛋白的三个亚单位之一。 心肌肌钙蛋白I具有心肌特异性，仅存在于心肌收缩蛋白的细肌丝上，在心肌收缩及舒张 过程中起重要的调节作用。心肌肌钙蛋白I的分子量为23，876Da。心肌损伤时cTnl极易 释放于血液循环。急性心肌受损后，cTnl立即进入血液循环，这个过程一般持续7-10天。 在发生急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI) 4-6小时，应用灵敏的免疫学方 法，即可在血液中检测到cTnl。cTnl在正常人血清中几乎探测不到，AMI病人的血中cTnl 可高达lOOng/ml 300ng/ml。临床上可采用心肌肌钙蛋白I检测试剂盒(胶体金法)定 性检测人血清中cTnl的浓度，与其它诊断方法一起用于评估心肌梗死引起的心肌损伤。检测原理心肌肌钙蛋白I检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术。检测过程包括在cTnl试 剂盒反应装置的加样孔中加入3-4滴约140 μ 1-180 μ 1血清，样品扩散通过附着彩色颗粒 包被的抗体的滤膜，并与附着在抗体固化带内的抗体接触，如果血清cTnl浓度大于0. 3ng/ ml，在检测区cTnl颗粒被抗-cTnl抗体捕获，出现一条彩色区带。cTnl浓度越高，检测区出 现色带的速度越快，色带越深。
CN101581704中公开了一种采用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术来测 定样品中乙酰化金刚烷胺浓度的方法。该方法操作繁琐且需要昂贵仪器，不利于广泛推广 使用。另外，潜在肿瘤、体内炎症和心肌缺血等病症都能导致人体内乙酰金刚烷胺浓度的升 高，该方法无法分辨乙酰金刚烷胺的浓度升高是由哪种疾病导致，受试者如果有体内炎症 和心肌缺血等病症，也会被错误的判定为有肿瘤或潜在肿瘤。发明内容
本发明旨在将检测乙酰金刚烷胺的免疫学方法和检测CRP、肌钙蛋白的生物化学 方法联合应用，以排除体内炎症和心肌缺血病症对肿瘤预测的假阳性干扰，使通过检测乙 酰金刚烷胺早期预测癌症的方法特异性更强。
为了实现本发明目的，本发明的一种用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的检测试剂 盒，所述试剂盒包括包被有抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A的载体和带有标记物的抗乙 酰金刚烷胺的单克隆抗体B;
其中，所述抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B是以乙酰金刚烷胺为 抗原，免疫兔子得到，所述抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B分别结合乙酰金 刚烷胺的不同位点上，所述载体为微孔板或磁珠；单克隆抗体A和B的包被量为5μ g/ml， 50 μ Io
前述的检测试剂盒，所述标记物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
前述的检测试剂盒，还包括显色液，成分为鲁米诺10g/l，对碘苯酚300g/l，PBS 0. 01mol/l，以水配制。
前述的检测试剂盒，还包括检测CRP的试剂。其中，检测CRP的试剂包括三羟甲基 氨基甲烷和羊抗人C-反应蛋白抗体。
前述的检测试剂盒，还包括检测cTnl的试剂。其中，检测cTnl的试剂包括心肌肌 钙蛋白I单克隆抗体和羊抗鼠多克隆抗体。
本发明还提供一种用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的免疫学检测方法，其是通过向 人体给药金刚烷胺，从人体中获取液体样品，采用双抗体夹心法来测定样品中乙酰金刚烷胺。
前述的检测方法，还包括检测样品中的CRP浓度。
前述的检测方法，还包括样品中的cTnl浓度。
前述的检测方法，所述双抗体夹心法具体包括使从人体中获取的液体样品与包 被有抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A的载体反应，然后加入带有标记物的抗乙酰金刚烷胺 的单克隆抗体B，通过标记物的显色检测样品中的乙酰金刚烷胺浓度。其中，所述抗乙酰金 刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B是以乙酰金刚烷胺为抗原，免疫兔子得到，所述抗乙 酰金刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B分别结合乙酰金刚烷胺的不同位点上，所述载体为微孔板或磁珠；单克隆抗体A和B的包被量为5 μ g/ml，50 μ 1。
前述的检测方法，所述标记物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
前述的检测方法，可以采用C-反应蛋白测定试剂盒(透射比浊法)检测样品中的 CRP浓度。
前述的检测方法，可以采用心肌肌钙蛋白I检测试剂盒(胶体金法)检测样品中 的cTnI浓度。
乙酰金刚烷胺的免疫学检测结果呈阴性，表明受试者体内没有癌症发生的迹象。
乙酰金刚烷胺的免疫学检测结果呈阳性，表明受试者可能具有以下的3种病情之
(1)有癌症发生的迹象；
(2)体内有炎症反应，如肠炎、咽炎等；
(3)有心肌缺血方面的疾病。
需要进一步检测CRP和肌钙蛋白，通过CRP检测可确定是否有体内炎症反应，通过 肌钙蛋白检测可确定是否有心肌缺血方面的疾病。
如果受试者乙酰金刚烷胺的免疫学检测结果呈阳性，又排除了体内炎症反应和心 肌缺血方面的疾病，则表明受试者体内有癌症发生的迹象，需要进一步全面的身体检查，以 确定癌症发生的部位及病情进展情况。
此外，本发明还可以采用其它免疫学检测方法如竞争法等检测乙酰金刚烷胺。因 此，所有用抗体来检测乙酰金刚烷胺的免疫学检测方法都属于本发明的范围。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果
(1)使用本发明试剂盒检测用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺，具有简便、快速、灵敏、 成本低的优点，易于大规模推广使用。
(2)通过检测乙酰金刚烷胺来预测癌症时，可以有效排除体内炎症和心肌缺血给 检测结果带来的假阳性判断，提高了检测结果的特异性。
(3)乙酰金刚烷胺的免疫学检测方法具有简便、快速、灵敏、成本低的优点，比高效 液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术更易于大规模推广使用。


图1为本发明采用双抗体夹心法测定样品中乙酰金刚烷胺的反应原理示意图。
图2为本发明较佳实施例采用心肌肌钙蛋白I检测试剂盒(胶体金法)检测样品 中cTnl的结果示意图，a表示结果呈阳性，b表示表示结果呈阴性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B的制备
抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B的制备过程如下
1.免疫以乙酰金刚烷胺为抗原，免疫兔子。
2.融合取出被免疫兔子的脾脏，研碎，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，融合后的杂 交瘤细胞具有脾细胞分泌抗体的能力和骨髓瘤细胞无限增值的能力。
3.筛选及克隆将融合的杂交瘤细胞分到6个96孔板中培养，取细胞培养上清 液，ELISA方法检测是否含有抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体。取含有抗乙酰金刚烷胺单克 隆抗体的细胞培养孔进行有限稀释法克隆杂交瘤细胞，获得能分泌抗乙酰金刚烷胺单克隆 抗体的杂交瘤细胞株。本发明共获得8种抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体，分别命名为al a80
4.筛选抗不同位点的单抗对将其中一种单克隆抗体al标记亲和素，分别与其他 7株单抗组成抗体对，筛选能用于夹心ELISA检测乙酰金刚烷胺的抗体对。
筛选流程如下
乙酰金刚烷胺包被酶标板一分别加7种单抗一标记生物素的单抗一辣根过氧化 物酶标记的亲和素一酶标仪读数
结果判断
(1)如果单克隆抗体al与其他单抗结合位点不同，则ELISA结果为阳性。
(2)如果单克隆抗体al与其他单抗结合位点相同，则ELISA结果为阴性。
5.筛选结果单克隆抗体al与另7种单抗中的a5和a8能够组合，ELISA结果为 阳性。将a5标记亲和素与另7种组合，结果表明除a8外其它均能组合。将al作为本发明 的单克隆抗体A，a5作为本发明的单克隆抗体B，因此，单克隆抗体A与单克隆抗体B可以 组合成一对用于夹心ELISA检测乙酰金刚烷胺的抗体对。
实施例2用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的检测试剂盒
试剂盒的制备方法
1.包被在微孔板内注入100 μ 1包被液(5 μ g/ml碳酸盐缓冲液)，4°C，过夜。单 克隆抗体A的用量为5 μ g/ml，50 μ 1/孔。
2.封闭将已包被好的微孔板取出放置室温平衡30分钟。用洗板机洗板1次，拍 干剩余的水分，在微孔板内注入150 μ 1封闭液(2g/ml的胎牛血清)，于4°C过夜。
3.干燥将已封闭好的微孔板取出放置室温平衡30分钟。弃去封闭液后，拍干剩 余的水分，于干燥间内干燥至孔内残余液体挥发干净。然后放入铝箔袋内，用真空封口机封 口，贴上标签，置于4°C中冷藏保存。
样品检测过程
1.受试者口服200mg盐酸金刚烷胺片。服药两小时后取中段尿样，用试剂盒对尿 样进行乙酰金刚烷胺的含量测定。
2.对照孔加阴性对照(0. Olmol/1磷酸盐缓冲液)、阳性对照(0. lng/ml乙酰金刚 烷胺溶液)各100 μ 1，样品孔加100 μ 1尿样，并反复吸打，振荡20秒钟后，于37°C水浴或 恒温培养箱中温育30分钟。
3.倒掉孔内液体，拍干。每孔加0. Olmol/1磷酸盐缓冲液300 μ 1，浸泡20秒以上，拍干。重复洗板5次。
4.除空白孔，每孔加酶标抗体B 100 μ 1 ；振荡20秒钟后，于37°C水浴或恒温培养 箱中温育20分钟。
酶标抗体B的制备方法为单克隆抗体B通过离心、透析和层析柱的方法标记了辣 根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
5. 二次清洗同步骤3。
6.每孔加发光底物液100μ1(成分为鲁米诺10g/l，对碘苯酚300g/l，PBS 0. Olmol/1)，振荡混勻，室温避光放置5 10分钟。
7.用化学发光分析仪测量每孔的RLU值。结果分析如表1所示
表1乙酰金刚烷胺的检测结果(RLU值)
人数乙酰金刚烷胺最 高浓度乙酰金刚烷胺最 低浓度乙酰金刚烷胺平 均浓度正常人24人0.9 ng/ml0 ng/ml0.1 ng/ml确诊的肺癌患者6人43.4 ng/ml2.3 ng/ml6.9ng/ml
结果表明正常人的尿液中乙酰金刚烷胺最高浓度上线为0. 9ng/ml，而确诊的癌 症患者尿液中乙酰金刚烷胺的最低浓度为2. 3ng/ml。正常人和癌症患者之间有明显的浓度 界限，因此，本品是理想的癌症早期预测试剂盒。
实施例3 检测乙酰金刚烷胺的免疫学方法和检测CRP、肌钙蛋白的生物化学方 法联合应用
1.乙酰金刚烷胺的免疫学检测方法双抗体夹心法。
具体方法如下
(1)将抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A固定在载体上。其中，所述抗乙酰金刚烷胺 的单克隆抗体A，所述载体为微孔板或磁珠。
(2)加入待测样品(受试者尿液50 μ 1)，使乙酰金刚烷胺与固定在载体上的单克 隆抗体A结合。
(3)磷酸盐缓冲液洗涤上述载体，洗三次，每次300 μ 1。
(4)向洗涤后的载体中加入标记了辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗乙酰金刚烷 胺的单克隆抗体B 50μ 1，其中，所述抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体B，使单克隆抗体B结合 于乙酰金刚烷胺分子上。(由于单克隆抗体A和单克隆抗体B能分别结合在乙酰金刚烷胺 分子的不同部位上，因此双抗体的结合不会互相干扰)
(5)向上述反应体系中加入显色液50μ 1(成分为鲁米诺10g/l，对碘苯酚300g/l， PBS 0. 01mol/l,以水配制)，与标记在单克隆抗体B上的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶发 生反应，将单克隆抗体B的信号放大，以利于判断检测结果。用化学发光仪检测发色信号， 依据阴性对照(0. Olmol/1磷酸盐缓冲液)和阳性对照(乙酰金刚烷胺溶液)的结果判断 待测样品。双抗体夹心法的反应原理如图1所示。
2. CRP检测方法采用C-反应蛋白测定试剂盒(透射比浊法)检测血清样品中CRP 的浓度。C-反应蛋白测定试剂盒购自中生北控生物股份有限公司。检测方法如表2所示
表2 CRP 检测
权利要求
1.用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被 有抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A的载体和带有标记物的抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体 B ；其中，所述抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B是以乙酰金刚烷胺为抗原， 免疫兔子得到，所述抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A和单克隆抗体B分别结合乙酰金刚烷 胺的不同位点上，所述载体为微孔板或磁珠。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶或 碱性磷酸酶。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，单克隆抗体A和B的包被量各为 5 μ g/ml, 50 μ 1。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括显色液，成分为鲁米诺IOg/ 1，对碘苯酚300g/l, PBS 0. 01mol/l,以水配制。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括检测CRP的试剂。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，检测CRP的试剂包括三羟甲基氨基 甲烷和羊抗人C-反应蛋白抗体。
7.根据权利要求1-4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括检测cTnl的试剂。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，检测cTnl的试剂包括心肌肌钙蛋 白I单克隆抗体和羊抗鼠多克隆抗体。
全文摘要
本发明提供了一种用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的检测试剂盒，试剂盒中包括包被有抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体A的载体和带有标记物的抗乙酰金刚烷胺的单克隆抗体B，其是基于免疫学原理来测定样品中的乙酰金刚烷胺。使用本发明试剂盒检测用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺，具有简便、快速、灵敏、成本低的优点，易于大规模推广使用。此外，本发明将检测乙酰金刚烷胺的免疫学方法和检测CRP、肌钙蛋白的生物化学方法联合应用，以排除体内炎症和心肌缺血病症对肿瘤预测的假阳性干扰，使通过检测乙酰金刚烷胺早期预测癌症的方法特异性更强。
文档编号G01N33/577GK102043058SQ201010562240
公开日2011年5月4日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者吴乐斌, 张志栋 申请人:中生北控生物科技股份有限公司