专利名称：宫颈细胞的细胞学分析方法
技术领域：
本发明涉及用于分析宫颈细胞染色体异常的方法和试剂盒。
背景技术：
宫颈癌是世界范围内最常见的女性高死亡率癌症之一。如果能够早期诊断，宫颈癌及其预兆性病变(precursor lesions)是能够得到有效治疗的。主要的宫颈癌筛查方法是Pap检查，该方法采用形态分析法来确定可疑细胞。然而，单纯细胞检测的灵敏度、再现性和可靠性相对较低。宫颈刮片(Pap)检查中约6%诊断为显著性未明的非典型性鳞状细胞(AS⑶S)，需要随访检查，5-10%的AS⑶S患者没有测出癌症。目前建议患者随访Pap检查、人乳头瘤病毒(HPV)检查和/或阴道镜检。HPV感染与宫颈癌相关，许多患者在获得AS⑶S Pap检查结果后进行HPV检查。高灵敏HPV检查的优点在于其极高的阴性预测值，该项检查为阴性的女性很少患上宫颈癌。 然而，HPV检查的阳性预测值不高，只有少数HPV阳性的早期病损发展为高度异常增生和癌症。因此，即使与细胞形态学检查联用，HPV检查的特异性仍然较低。此外，约3%的Pap检查诊断为低度鳞状上皮内病变(LSIL)。目前建议患者进一步监测和/或阴道镜检。临床研究显示，这些患者大多为HPV+。AS⑶S/HPV+或LSIL患者有发展为更严重宫颈疾病的显著风险，在首次检查后两年内需要手术治疗。形态和HPV感染无法确定这些高危患者。已发现的宫颈癌早期的遗传变异能够预测病变的风险。这些变异包括DNA含量(例如染色体倍性)的总体改变以及3 号染色体上基因座3明6部分和5号染色体上基因座5pl5部分的扩增，基因座3明6包含一 TERC基因，该基因编码端粒酶蛋白的一亚基，基因座5pl5包含一 TERT基因，该基因编码端粒酶蛋白的另一亚基，两者都与细胞的无限增殖相关。研究表明，多色荧光DNA探针可通过荧光原位杂交(FISH)检测倍性异常以及检测3q和5p拷贝数异常，其灵敏度和特异性均高于其他方法。发达国家中宫颈癌筛查计划的推进极大降低了发病率和死亡率。然而，由于单纯细胞学检查的灵敏度欠高，所以需要经常性的随访检查。这可能是因为取样和解读误差，也可能是因为某些早期病变尚未具有可识别的表型改变。浸润性宫颈癌通过渐进诸阶段的宫颈非典型增生(cervical dysplasia)发展成宫颈上皮内瘤(CIN) 1、CIN2、CIN3，和原位癌， 这被认为是真性(bona fide)癌前病变，需要手术干预。然而，所有低度异常增生中只有约 15%遵循这样路径发展。Pap和HPV检查时检测宫颈非典型增生或宫颈癌的间接方法。所以，仍然需要用分子标记来直接确定异常增生或宫颈癌并监测疾病进展的方法。发明概述本发明提供监测宫颈细胞遗传变异从而在普遍症状出现前数年或数月预测发病可能性的方法，该方法采用FISH、CISH、流式细胞术等各种细胞学方法或其它业内已知方法来检测杂交和遗传变异。显示染色体非整倍性和特定癌症-相关基因拷贝数改变已经成为细胞学样品的
5常规形态学分析的重要补充。该方法在生物学上是可靠且成功的，因为染色体非整倍性及其所致的基因组失衡是癌细胞特异性的，随癌症不同而不同，并且出现于病程的早期。像许多人类癌症一样，宫颈癌是由基因组失衡引起的。在人乳头瘤病毒高危亚型感染之外，宫颈鳞状上皮细胞循序转化需要获得超拷贝的染色体臂3q和5p，以及其他细胞遗传变异。本发明内容之一，鉴定低度宫颈异常增生中的5pl5扩增和3q26扩增能够提供关于各病变发展为高度宫颈非典型增生和癌症可能性的信息。内容之一，本发明提供一种评定患者宫颈细胞异常状况的方法，所述异常包括宫颈非典型增生或宫颈癌，所述方法包括在患者的样品中检测染色体3q的基因组扩增；染色体5p的基因组扩增；和作为对照的染色体7着丝粒(CEN7)的存在和/或扩增。检测到染色体3q和染色体5p的基因组扩增显示患者病情向高度宫颈非典型增生转化。检测到染色体7基因组扩增可度量宫颈细胞的整体染色体倍性。通常，宫颈癌变早期不发生染色体7 拷贝数变化。如果出现染色体7基因组扩增则表示出现了非整倍性，这是一种与晚期癌前和癌症相关的状态。该方法能够评估低度宫颈非典型增生向高度宫颈非典型增生或宫颈癌的转变。本发明还提供一种监测由低度向高度宫颈非典型增生转变的方法。本发明所揭示的方法包括评估低度宫颈非典型增生向高度宫颈非典型增生的转变；确定患者产生浸润性宫颈癌的风险；和评估维持低度宫颈非典型增生或消退到低度宫颈非典型增生或正常的情况。
具体实施方式
之一中，本发明所述方法还包括在检测染色体3q和5p上的扩增之外检测以下染色体上的扩增lq、20q、12q、19q、llq、6q、17p、7、8q(见于细胞病变晚期)、 9q、16q、2q、9p、10q、18p，以及它们的各种组合。更具体的实施方式中，所述方法检测3q26 基因座和5pl5基因座的扩增。除了检测基因座3q26和5pl5扩增之外，还可以检测以下染色体基因座的扩增lq21-31、20ql2、12ql3-24、19ql3、llq21、7qll-22、8q24(在晚期异常增生中检测)、9q33、_34、16q23 ；2q32、9p22、10q21_24、18pll，以及它们的各种组合。本发明的方法还可以包括在样品中检测染色体3q和/或染色体5p有无遗传扩
+飽
+曰ο本发明还提供指向所述染色体区域的探针，以及用于实施本发明方法的试剂盒。以下表述和附图将有助于更好地理解本发明的以上及其它内容。然而，以下表述展示本发明优选实施方式及其诸多细节仅是为了说明本发明而非限定其范围。根据本发明的要旨，其范围内还包括诸多改变和调整。


图1A、B和C显示宫颈癌各阶段3q26染色体拷贝数的扩增。图2显示显示宫颈癌各阶段3q26和5pl5染色体拷贝数的扩增。图3展示以宫颈癌检测为目的的Pap检查后病员管理流程。图4是一例3q异常单项液基细胞检查阴性报告。图5是一例3q异常单项液基细胞检查阳性报告。图6是一例3q和5p异常液基细胞检查阳性报告。图7是一例3q和5p异常液基细胞检查阴性报告。
图8A和B是一例3q异常单项组织活检阴性报告。图8A为Cim组织活检结果， 图8B为CIN2组织活检结果。图9A、B和C 一例3q异常单项组织活检阳性报告。图9A为Cim组织活检结果， 图9B为CIN2组织活检结果，图9C为CIN3组织活检结果。图10显示一例3q和5p异常组织活检结果。图11显示一例四倍体细胞3q异常单项液基细胞检查结果。图12显示一例四倍体细胞3q和5p异常液基细胞检查结果。图13显示染色体基因座3明6的基因组组成，包括TERC以及其他众多基因的位置，以及适合用来制备标记DNA探针的BAC克隆。图14显示染色体基因座5pl5的基因组组成，包括TERT和TRIP13以及其他众多基因的位置，以及适合用来制备标记DNA探针的BAC克隆。图15显示用来在5pl5. 33带内鉴定探针的克隆排列以及适合制备TRIP 13特异性标记DNA探针的特异性BAC克隆。图16A、B、C和D列明了本发明用于检测宫颈细胞内染色体异常的特异性探针所靶向的基因。详细说明本发明的基础是宫颈癌相关染色体区域拷贝数增益的测定。癌症是一种遗传疾病，在病变细胞内可发现遗传变异。这些变异可用细胞学方法来观测，例如根据某些基因区域的增减来判断遗传变异。并且，癌细胞中某些基因表达明显有差异，因此，生物标记表达测量值可作为细胞病变状态的诊断指标，不论这种表达差异能够通过细胞学检查测得。本发明所述方法采用结合染色体上变异区域的荧光标记探针，能够直接确定宫颈细胞的DNA 异常。如果一份细胞样本的测得信号数量高于或低于预期值，则可将其诊断为病变，于是可在早期诊断宫颈非典型增生而不必等到发展至细胞检查可见。发生这些异常的患者可能预后不良，也可能是晚期宫颈病的高危患者。本发明方法可在AS⑶S/HPV+或LSIL Pap检查之后进行，也可以取代ASCUS/HPV+或LSIL Pap检查，在细胞检查所得其它病变报告中，提供更具有针对性的关于疾病进展风险的信息。本发明中，“宫颈非典型增生”、“宫颈病变”或“宫颈疾病”表示宫颈癌变，未见上皮内病变或恶性(NILM)，人乳头瘤病毒(HPV)阳性，显著性未明的非典型性鳞状细胞 (ASC-UQ，低度鳞状上皮内病变(LSIL)，非典型鳞状细胞，HSIL(ASC-H)，显著性未明的非典型腺细胞(AGUS)，高度鳞状上皮内病变(HSIL)，宫颈非典型增生，初癌(pre-cancer)， 恶化前病变(pre-malignant legion)，宫颈癌，宫颈腺癌，宫颈鳞状细胞癌，宫颈上皮内瘤 1 (CINl)，宫颈上皮内瘤2 (CIN2)，宫颈上皮内瘤3 (CIN3)，原位癌，浸润性宫颈癌，以及细胞的细胞学和遗传学变异。并且，本文中，“疾病”、“细胞病变”或“病变”包括但不限于各种细胞的细胞学或遗传学变异。本发明方法能够直接鉴定形态正常和异常细胞内的遗传变异，提供关于疾病进展的预后信息，并且灵活适用于鳞状宫颈细胞和腺性宫颈细胞。拷贝数增益在人乳头瘤病毒(HPV)向宿主基因组内整合之外，3q拷贝数增加也已被关联到 CIN2或CIN3向宫颈癌转化，因此，二者看来是宫颈非典型增生向浸润性癌转化中的重要相关事件。Hopman等，J. Pathol.(病理学杂志)，2006，Dec 210(4) :412_9。晚期肿瘤或淋巴结转移病患中可见更多的染色体失衡，包括3q、Iq和8q拷贝数增益，llq、3q、6q和2q丢失。淋巴结转移中，3qll_q22和3q26_qter增益更为多见。Huang, K. F.等，J. Formos Med Assoc.(台湾医学会杂志)，2007，Nov ;106(11) :894_902。浸润性宫颈癌中的3q增益，尤其是人端粒酶基因(TERC)的增益，已用于开发FISH 探针组作为诊断工具在Pap涂片检查中检测TERC增益。已有人提出，TERC增益预示CINl/ CIN2 向 CIN3 和浸润性癌的转化。Heselmeyer-Haddad 等，Am Journal of Pathology (美国病理学杂志),2005,166 1229-1238。5p也是常见的于癌症中发生结构变异的染色体.。Atkin，N. B 1997，Elsevier, 95 :33-39。Arias-Pulido,H.等 2002，Mol. Cancer (分子学与肿瘤)，1 :3。Huang F. Y.，等， 2005Cancer Gen.和 Cyto (肿瘤、基因与细胞学)，157 :46_47。Macville Μ.，等，1999Cancer Res.(肿瘤研究)，59 :141_50。Heselmeyer K.等，1997Genes 染色体 s Cancer (基因、染色体和肿瘤)，19 :233-40。Rao P. H.等，2004BMC Cancer (BMC 肿瘤)，4 :5。5p 增益可见于向癌晚期转化的过程中，常常涉及整条染色体臂的扩增。Heselmeyer K.等，1997GeneS染色体s Cancer (基因、染色体和肿瘤)，19 :233_40。用表现出5q扩增的癌细胞系已鉴定到位于5pl3.33的最小变异区域，该区域编码人端粒酶反转录酶(hTERT)基因。Lockwood, W.等，Int. J. Cance (世界肿瘤学杂志)， 2006,120 :436-443。最后，还确定了一个 HPV 整合位点，即 5pll_15。Lockwood,ff.等 Int. J. Cance (世界肿瘤学杂志)，2006 ；120 :436_443。端粒酶活化是肿瘤细胞无限增殖的重要因素之一。Takuma，Y.等，2004 Journal of Gastroenterology 禾口 !fepatology (消化道禾口肝脏杂志)，19 :1300-1304。Takahashi S.等，2000，Eur. Jour. Of Cancer (欧洲肿瘤学杂志)，36 :496-502。Toshikuni, N.等，2000，Br. J. Cancer (英国肿瘤学杂志)，82 ；833-837。 已知，hTERT是端粒酶的催化性亚基。Takahashi S.等，2000，Eur. Jour. Of Cancer (欧洲月中瘤学杂志)，36 :496-502。已在包括宫颈癌在内多个癌症细胞系中发现hTERT表达，其中，有些癌症细胞系表现为，hTERT不在非癌性组织而在癌性病变中高表达。Takahashi S.等，2000，Eur. Jour. Of Cancer (欧洲肿瘤学杂志)，36:496-502。虽然这一差异表达是在肝癌中发现的而非宫颈癌，但研究结果表明，hTERT表达发生于肝癌早期。Takahashi S.等，2000，Eur. Jour. Of Cancer (欧洲肿瘤学杂志)，36 :496-502。并且，在联合HPV感染的宫颈癌中，5p hTERT基因扩增与hTERT mRNA表达增强密切相关。Zhang A.等，2000，Cancer Res.(肿瘤研究)， 60 :6230-6235。Zhang A.等，2002，Genes Chromosomes Cancer (基因、染色体与肿瘤)，34 269-75。目前一直认为，5p是一条在癌变过程不同阶段发生结构改变的染色体。而这些结构改变看来都影响到5q上编码的TERT基因。已在浸润性宫颈癌中发现5p增益。Scotto等，Molecular Cancer (分子学与肿瘤)，2008。如果在样品中不但发现3q尤其是3q26增益，还发现5p增益，这可以作为疾病状态由宫颈非典型增生向浸润性宫颈癌恶化的标志。采用3q上某区域的特异性探针，尤其是染色体3q26带的特异性探针，联合至少一种对照探针(例如CEP3、CEN7)，以及5p上某区域的特异性探针，尤其是5pl5特异性探针，发现，拷贝数增益先于宫颈上皮内瘤向浸润性癌的恶变，还伴有AS⑶S或Cim向CIN2或CIN3和CIN2或CIN3向原位癌再向浸润性宫颈癌的转化。并且，鉴定到3q和5p双增益表明AS⑶S或Cim向CIN2或CIN3以及CIN2或 CIN3向原位癌再向浸润性宫颈癌的加速转化。本发明的方法通过比较目标染色体例如5p、3q或二者与正常对照相比的拷贝数增益能够确定潜在的宫颈细胞病变。本发明中，“正常”指哺乳动物细胞的染色体双倍性，例外在于原本为双倍体的细胞处于细胞周期的四期(tetraphase)因而呈现四倍性。所有细胞都具有正常互补的23对染色体，这样的状态称之为双倍体。然而，当细胞增长和分裂时，它们会生成另一套23对染色体，这两套染色体将分别进入分裂产生了两个子细胞。此时称为四倍体。虽然四倍性是机体各组织、各器官内周期性出现的一个自然过程，但总体说来是低频的。癌症的特征之一是失调的细胞生长和复制。这通常是因为细胞染色体上的多发异常使得细胞的一逃脱正常细胞内正常复制控制系统的监控。染色体中的这些多发异常导致称为“非整倍性”的状态，即染色体组全数不再是23对。通常，非整倍体细胞的某些染色体的拷贝多于正常，而有些则丢失，甚至因两个或两个以上染色体融合而产生杂合染色体。非常活跃的细胞分裂和四倍性为非整倍体细胞的形成提供了基础。所以，四倍体可能是一个过渡状态，表明发展为非整倍体细胞以及更严重细胞病变的高度风险。所以，本发明的这些方法能够检测四倍性，确定宫颈细胞病变和可能的向宫颈癌转化。方法本发明方法可用作宫颈非典型增生的诊断标记或预后标记。倍性异常和/或3q 和/或5p拷贝数升高的患者预后不良，且罹患晚后期宫颈疾病的风险高。本发明的实施方式之一是在宫颈细胞学样品中用对染色体5p和3q上基因座特异性以及对CEN7特异性的多色FISH探针检测DNA含量和3q+5p拷贝数的变变化，更具体地说，所述探针是5pl5特异性和3明6特异性的。一优选实施方式中，不同目标的探针具有不同颜色的荧光，从而能分辨目标。本发明实施方式之一是评估患者的宫颈非典型增生或宫颈癌情况的方法，该方法包括在患者的样品中检测染色体3q上的基因组扩增，染色体5q上的基因组扩增，CEN7和 /或其扩增。测得染色体3q和染色体5p基因组扩增提示低度向高度宫颈非典型增生的转化。本发明方法可由采自患者的样品监测低度向高度宫颈非典型增生的转化染色体 3q上的基因组扩增，染色体5p上的基因组扩增，CEN7的存在和/或其扩增。测得染色体3q 和染色体5p基因组扩增提示患者情况向高度宫颈非典型增生转化。在检测染色体3q和5p上的扩增之外，本发明方法还可包括检测以下染色体的扩增:lq，20q，12q，19q，llq，6q，17p，7，8q(可见于晚期发育异常)，9q，16q，2q，9p，IOq, 18p， 以及它们的任意组合。按照本发明的特定实施方式可检测3明6基因座和5pl5基因座带上的扩增，包括 Cri du Chat区域的。其它一些实施方式中，在对39沈和5pl5基因座的检测之外，还可以检测以下染色体基因座上的扩增:lq21-31，20ql2，12q 13-24，19q 13，llq21，7qll_22， 8q24(可见于晚期发育异常)，9q33_34，16q23，2q32，9p22，10q21-24,18pll，以及它们的任
思组合。本发明方法可进一步包括确定样品中没有染色体3q和/或染色体5p基因组扩增。与确定了非整倍性和宫颈细胞病变的状态相比，染色体扩增消失表明细胞病变的消退，
9甚至可能是疾病的消退。本发明方法可用于评估和监测晚期发育异常，所述方法包括检测染色体3q、以及 5p和8q(尤其是8q24)上的基因组扩增。8q拷贝数和/或5p拷贝数增益并且3q增益提示可能是宫颈上皮内瘤变向浸润性癌的恶变，还伴有AS⑶S/Cim向CIN2/CIN3和CIN2/CIN3 向原位癌再向浸润性宫颈癌的转化。并且，测得3q和5p双增益提示AS⑶S/Cim向CIN2/ CIN3和CIN2/CIN3向原位癌再向浸润性宫颈癌的加速转化。本发明方法还提供了一套特异性探针，包括3q和5p染色体的特异性探针，还可进一步包括以下特异性的探针lq，20q, 12q，19q，llq，6q，17p，7，8q (可见于晚期发育异常)， 9q，16q，2q，9p，10q，18p，以及这些探针的任意组合。按照本发明关于上述探针组的某些特定实施方式，可采用39沈基因座和5pl5基因座的特异性探针，包括Cri du Chat区域的，还包括以下染色体基因座特异性的探针lq21-31，20ql2，12ql3-24，19ql3，llq21，7qll-22， 8q24(可见于晚期发育异常)，9q33_34，16q23，2q32，9p22，10q21-24,18pll，以及这些探针的任意组合。本领域技术人员可制备与本文所述基因座序列互补的核酸探针。并且，许多此类探针可通过商业渠道获得。最近的临床研究表明解释了 HPV感染在肛门癌形成中的作用。事实上，医疗保险和医疗补助服务中心(CMS)已开始将部分肛门样本细胞学检查和HPV检查纳入医保和医疗补助范围之内。由于宫颈癌和肛门癌在发生上的生物学相似性，这种相似性包括相似的细胞类型和病毒引发，都发生3q和5p以及其它基因座上的基因组异常和拷贝数改变。因此， 本发明的实施方式还包括分析肛门细胞样本，检测3q和5p及其它染色体的拷贝数改变，从而确定是否罹患肛门疾病。所以，本发明方法可用于分析肛门样本并提供关于肛门癌发生的有价值的临床信息。探针有多种方法可用于确定与本发明所述特定基因座特异性杂交的探针。例如，可如下获得探针对染色体特异性文库中的克隆进行随机选择，然后用数字成像显微镜作图。参见美国专利第5，472，842号。可通过商业途径获得覆盖整套染色体的各种文库，例如伊鲁米纳公司(Illumina Inc.) 0可从伊利诺斯州德斯普雷恩城阿伯特分子技术公司(Abbot Molecular, Inc. , Des Plaines.，IL)购得与特定染色体基因座杂交的探针。简而言之，用限制酶消化或机械剪切基因组或染色体的特定DNA，产生至少约 20kb的DNA序列，约401Λ至3001Λ的更好。序列部分消化技术已为业内所述之。见，例如， Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd Ed.(分子克隆手册，第二版)， Wiley N. Y. (1998)。将所得序列连接到载体上并导入合适的宿主。适用于此的宿主有例如粘粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)和Pl噬菌体。还可从，例如基因组系统(Genome Systems)购得覆盖整套染色体的各种文库。探针文库建成后，可对选定染色体物理绘制探针亚组的位图。可采用FISH和数字图像分析进行选定染色体上的克隆定位。简而言之，用FITC作为荧光团，通过对正常细胞的间期涂片作FISH而获得克隆的位图。可对染色体进行复染以显现其轮廓，例如采用可染色DNA而无视其碱基组成的染料(例如DAPI或溴丙定)。着染的间期涂片在荧光显微镜下成像，荧光显微镜需配有多色分束器以防图像色彩偏移。用CCD相机获取不同的彩色图像，数字化的图像储存在计算机中。然后，用程序计算染色体轴，将两个(单拷贝序列)FITC信号垂直投影在该轴上，计算距离某指定位点(一般是P-端粒)的平均分段长度。这一方法可参见美国专利第5，472，842号。本发明确定的基因的序列信息可用于设计出高特异性的杂交探针或扩增引物，用于检测这些基因中的把序列。如前所述，这些基因的全序列是众所周知的。检测基因内特定DNA序列的手段是众所周知的。例如，可采用与基因内选定子序列互补的寡核苷酸探针。 或者，可以在用探针检测之前先用各种DNA扩增技术(例如聚合酶链反应、连接酶链反应、 转录扩增等)扩增选定的序列或子序列。扩增DNA提供了更多拷贝的潜在目标子序列，由此可提高检测的灵敏度。此外，通过在扩增过程中采用标记引物，可在扩增的同时标记DNA 序列。实施方式之一中，本发明探针至少结合3q26. 2带处的TERC基因和5pl5. 3处的 TERT或TRIP 13。具体地说，可采用光谱金(spectrum gold)标记的约495kb的3q26处 TERC的特异性探针和光谱绿(spectrum green)标记的5p 15的特异性探针。这些探针可从伊利诺斯州德斯普雷恩城阿伯特分子技术公司购得。然而，本发明的探针可包括3q26和 5pl5上的各个基因，包括Cri du Chat区域内的各基因，图16A-D中显示的那些，以及3q26 或5pl5上各基因的组合或片段。
具体实施方式
之一中，探针的可检测标记能发出荧光信号，或者，探针可以是生色的。采用原位荧光杂交法(FISH)进行探针杂交。FISH是一项细胞遗传学技术，用于检测或定位染色体上的特定DNA序列。FISH采用的荧光探针结合染色体上序列与之高度近似的部分。可用荧光显微镜来验看探针结合在染色体的哪个部位。原位杂交技术能够在细胞制备物中展现特定的核酸序列。具体地说，FISH包括荧光标记的单链DNA探针与互补靶序列的精确退火。用荧光显微镜直接检测可目测观察探针与细胞DNA位点的杂交。如果需要对其它遗传材料进行检测，可用聚合酶链反应(PCR)进行基因组扩增或检测。本发明的另一实施方式是对液体细胞学样本，例如SUREP ΑΤΗ 或 THINPREP 样本实施FISH的程序，实现本发明方法实施过程中DNA探针的成功杂交。SUREP ΑΤΗ 可购自马里兰州斯帕克斯的BD公司(Becton-Dickinson, Sparks, MD)。THINPREP 可购自马萨诸塞州贝德福德的豪氏实验室(Hologic Laboratories, Bedford, ΜΑ)。本发明还涉及在检测取样细胞内基因扩增之前用抗体从液基细胞学样本中分离出鳞状细胞和腺细胞。分离不同细胞类型可提高鳞癌和腺癌的检出率，并提高宫颈癌的检出率，这些宫颈癌表现出来3q26扩增、5ρ15扩增或这两者的双扩增但很难被Pap检查检出。本发明的方法能将荧光标记的核酸探针用于原位杂交试验。这样的标记探针组可以由至少三色、三探针混合物构成，所述探针为DNA探针，序列分别与染色体3、5和7上的特定区域以及其它染色体区域同源。本发明中，“标记”(单数或复数)，指各种能用光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的组成物(例如探针)，这些手段包括但不限于荧光染料(例如荧光素、罗丹明、德州红(Texas Red)等)，酶，高密电子染剂(electron dense reagents)，磁力标记等等。并非直接检测而是采用间接标记进行检测的标记有生物素，地奥新宁(dioxigenin)，半抗原和能产生抗血清或单克隆抗体的蛋白质。标记核酸和探针的方法是众所周知的。本发明优选适用于原位杂交的标记。可在杂交前对核酸探针进行可检测标记。或者，可采用与杂交产物结合的可检测标记。这些可检测标记包括各种具有物理或化学可检测性的材料， 免疫检测领域已开发出来大量此类标记。根据本发明的方法的另一实施方式，可用患者样品中的宫颈鳞状细胞和/或腺细胞来评估染色体异常。通常，宜采用多色FISH法例如作为优选实施方式的三色FISH法来检测染色体异常，其中采用以不同荧光染料标记的三个探针。优选实施方式中，与目标区域杂交的两个测试探针用不同的染料标记，结合不同区域的对照探针用第三种染料标记。也可采用三种以上探针，但各自需以不同染料标记。优选杂交目标染色体上稳定区域例如着丝粒的核酸探针作为对照探针，这样就可以比较不同样品之间的杂交效率差异。可将自患者样本或样品中收集或分离得到的细胞固定在玻片上。可用业内已知的各种方法来提取样本。实施方式之一，可从THINPREP 和/或SUREP ΑΤ 样品中提取样本。SUREPATH 是一种用于筛选宫颈癌的Pap检查。SUREPATH 有多种采集装置用来自患者采集Pap样品。有些装置具有容纳样品的可拆卸端头，将这些端头直接拆下后放入小管送去筛选，可使样品100%得到处理。有一种采用薄层细胞制备技术的液基 Pap检查称为BD SUREPATH 液基Pap检查，称其检出率高于传统Pap涂片检查，该检查与SUREPATH 采样装置，例如带可拆卸端头的刷/刮片或帚样装置联用，参见美国专利申请第11/521，144号，其全部内容通过引用纳入本文。THINPREP pap是一种液基细胞学方法。将宫颈细胞样品洗入小管而不是涂在玻片上，由此避免了细胞堆积。在实验室中除去血液和粘液而分离出细胞，然后将待研究的细胞涂在玻片上检测癌细胞。样品还可包含来自宫颈组织活检、钻取组织活检、包括LEEP和子宫切除等手术、 CONE活检和ECC等的组织。可由取自宫颈，阴道或外阴的组织或细胞制备样品。杂交实施方式之一中，采用原位杂交鉴定本发明所述区域。一般说来，原位杂交包括以下主要步骤(1)固定待分析的组织或生物结构；(2)预杂交处理所述生物结构以提高目标 DNA的可访度并降低非特异性结合；(3)核酸混合物与生物样品或组织的核酸杂交；(4)杂交后洗涤，去除杂交反应中没能结合的核酸；( 检测杂交了的核酸。本发明的杂交方案可参见美国专利第6，277，563号，其全部内容通过引用纳入本文。可先将样品的目标DNA变性为单链，然后与本发明方法的探针杂交。杂交后，未结合的探针被一系列洗涤洗去，细胞核则用DNA特异性染料DAPI (4 ‘，6-二脒基-2-苯基吲哚)复染。可用配有激发滤光片(excitation)和发射滤光片(emission)的荧光显微镜来观察DNA探针的杂交，这样的显微镜能够看到浅蓝绿色(aqua)和金色的荧光信号。通过对细胞核的显微镜检来进行CEN 7、5pl5和3明6信号的计数。本发明所述的临床检查可联用多种生物标记以实现宫颈癌的早期诊断，这具有重大意义，因为目前基于形态学的筛选和检测方法存在严重制约。检测3明6和5pl5等扩增及其它细胞遗传变异能够更准确、更精确地鉴定出具有宫颈癌发生危险的患者，帮助他们及早治疗。图像分析
本发明实施方式之一是实现本发明方法的自动图像分析和记分(scoring)。原位杂交技术能够在细胞制备物中展现特定核酸序列。具体地说，DNA荧光原位杂交(FISH)涉及荧光标记的单链DNA探针与互补靶序列的精确退火。用荧光显微镜直接检测可观察到探针与细胞DNA位点的杂交。本发明方法采用的是用于原位杂交的荧光标记的核酸探针。 优选实施方式之一中，探针组由三色三探针的DNA探针序列混合物组成，所述序列与染色体3、5和7的特定区域同源。探针混合物由分别对染色体3明6、5 15和染色体7的着丝粒 (CEN7)特异性的基因座特异性探针组成。本发明实施方式之一是实现FISH探针信号的自动化图像分析。显微镜可自动获取载物台上样本/玻片范围内视野的数字图像。此类显微镜的制造商包括卡尔蔡司(Carl kiss)、莱卡(Leica)、尼康(Nikon)和欧林巴斯(Olympus)等。本发明方法还提供了用于自动化图像分析的软件平台，例如康涅狄格州IS公司(Ikonisys)、马萨诸塞州和德国的MS 公司(Metasystems)、加州的BI公司(Bioimagene)、马萨诸塞州的BV公司(Bioview)和以色列等开发的显微镜软件系统。这些自动化系统可用于单独观察患者样品内的3q染色体或组合观察3q染色体和5p异常。可将自样本中回收的细胞固定在玻片上。将靶DNA变性成单链形式，然后与探针杂交。杂交后，通过一系列洗涤去除未结合的探针，用DNA特异性染料DAPI (4'，6-二脒基-2-苯基吲哚)复染细胞核。可用配有激发滤光片和发射滤光片的荧光显微镜来观察 DNA探针的杂交，这样的显微镜能够看到三荧光信号。通过对细胞核的显微镜检来进行CEN 7、5pl5和信号的计数。可在配备有100-瓦水银灯和以下滤光片的落射荧光显微镜(印i_fluorescence microscope)上检查探针组和DAPI复染DAPI、光谱浅蓝绿(7号染色体着丝粒)、光谱绿 (5pl5上的基因座)和光谱橙(3明6上的基因座)，或本领域已知和本文所述的其它标记和探针。采用DAPI滤光片和100倍放大率能够快速扫描患者玻片的样品区，确定细胞的数量和质量。分析从目标区域的左上象限开始。用63倍油镜(oil objective)从左向右、从上向下扫描视野，同一区域不重复扫描。该系统可清点总计1000个细胞。本发明方法还包括细胞计数的自动记分。玻片分析程序的临床意义虽然样本上FISH实验室程序的性能很有希望，但其后所需的程序分析必须以疾病为背景，并且必须确定技术结果与临床实践之间的相关性。本发明方法的设计目的是直接评估宫颈细胞病变相关基因座的染色体拷贝数。远癌症发生之前，在宫颈癌筛选样本(例如Pap检查)中存在这些遗传变异可提示对这些患者进行控制和治疗。基于FISH的样本分析结果可纳入临床看护指导和程序的考虑之内。对于每一份临床样本来说，测定至少800、优选1000个细胞内的染色体拷贝数可算是足够的采样规模。就本发明系统而言，少于800或超过1000也可以。本发明方法和系统克服了取样偏差和玻片制备方法的局限。本发明方法和系统与专业医学组织(ACMG)建议的确定样本染色体拷贝改变有和无之间阈值的方法是一致的。Wolf，D.J.等(2007)，原位杂交检查中焚光周期导弓I (Period Guidelines for flurosence in situ hybridization Testing)。本发明自动化方法和系统的阳性样本准确率至少90%，能够确定高风险患者。本发明方法和系统的准确率还可高达95%以上。
原位杂交技术能够在细胞制备物中展现特定的核酸序列。传统上，探针信号的展现通常由受过专门训练的人手工完成。然而，采用本发明的方法就能够实现图像获取和分析的自动化。目前市场上的显微镜，例如卡尔蔡司、莱卡、尼康和欧林巴斯等制造的显微镜， 能帮使用者获取显微镜载物台上样本/玻片内视野的数字图像。有些制造商提供自动获取样本/玻片图像的软件。此外，有些企业(IS公司，MS公司，BI公司，BV公司，埃普里奥公司(Aperio)，凡塔娜公司(Ventana)等等)开发出专用于商业实验室的软件平台。有些还提供包括显微镜平台和自动化成像软件的系统，例如IS公司的Uoniscope数字显微镜系统禾口 MS 公司的 Metafer 禾口 Metacyte。待分析样本的类型和来源直接影响分析过程和方法。各组织类型有其本身的生物学和结构特征，再加上各癌症发展各异，有许多因素影响癌形成速度。所以，本发明提供多种对样本自动化成像和分析的方法。本发明系统和方法的实施方式之一是用于悬浮液形式的样本，可将这样的样本在显微镜玻片上涂成均勻的细胞单层，这包括液基细胞学样本，例如THINPREP 和 SUREPATH 、各种细针穿刺抽吸(FNA)、痰检或拭子采样样本。该自动化方法筛查FISH制备玻片上细胞覆盖的全部区域，并用DAPI-染色来确定细胞核。然后，该系统清点DAPI-着染区域内各探针的信号，记录测得的各探针的拷贝数。软件系统继续对细胞和各细胞内染色体拷贝数自动计分，直到获得至少800个细胞的结果。一旦达到了 800细胞的阈值，所述软件就可以根据各确知染色体的拷贝数对已成像和计数的各细胞进行分类。探针3q26， 5pl5和CEN7A各含两拷贝的正常细胞归为2，2，2类。可根据探针信号模式鉴定出病变细胞。 例如，含两拷贝CEN7探针、5拷贝3明6探针和3拷贝5pl5探针的细胞可归为2，5，3类。全部细胞归类完毕，就可以比照阳性/阴性疾病阈值对样本进行评估。对于所有被自动成像系统认定为病变的细胞，可以先由专业人员手工复查和验证，然后才将检查结果交给医生。 本发明的方法和系统还可进一步包括自动化的复查。具体的细胞阈值数量可根据样本类型和采集方法而不同。此外，可对软件进行调整，使之反映出生物学差异(细胞形状、细胞大小、细胞核的DNA含量、细胞彼此的接近性、细胞类型等)或疾病相关差异(数量异常的基因座数目、单个细胞内某基因座上的病变数量、病变与存活率和治疗应答性之间的关系)。 本发明的方法和系统可用于玻片上细胞覆盖区域的代表性取样，而非整个覆盖区，一般如下进行根据细胞密度轨迹取像或多视野取像，直到达到最低成像细胞阈值。本发明系统和方法的另一实施方式可用于悬浮液形式的样本，可将这样的样本在显微镜玻片上涂成均勻的细胞单层，这包括液基细胞学样本，例如THINPREP 和 SUREPATH 、各种细针穿刺抽吸(FNA)、痰检或拭子采样样本。该自动化方法筛查FISH制备玻片上细胞覆盖的全部区域，并用DAPI-染色来确定细胞核。然后，该系统清点DAPI-着染区域内各探针的信号，记录测得的各探针的拷贝数。软件系统继续对细胞和各细胞内染色体拷贝数自动计分，直到获得玻片上全部细胞的结果。全部细胞成像后，所述软件就可以根据各确知染色体的拷贝数对已成像和计数的各细胞进行分类。例如，探针3明6，5 15和 CEN7A各含两拷贝的正常细胞归为2，2，2类。可根据探针信号模式鉴定出病变细胞。例如， 含两拷贝CEN7探针、5拷贝3明6探针和3拷贝5pl5探针的细胞归为2，5，3类。全部细胞成像、计数和归类后，所述软件找出病变数最大的细胞，进行高度病变细胞的降序排列。可参照阳性/阴性疾病阈值对样本的该高度病变细胞的降序排列进行评估。通常，但并非一定，对于所有被自动成像系统认定为异常的细胞，可以先由专业人员手工复查和验证，然后才将检查结果通过本领域已知的方法以电子形式交给医生。具体的细胞阈值数量可根据样本类型和采集方法而不同。此外，可对软件进行调整，使之反映出生物学差异(细胞形状、 细胞大小、细胞核的DNA含量、细胞彼此的接近性、细胞类型等)或疾病相关差异(数量异常的基因座数目、单个细胞内某基因座上的病变数量、某种病变与存活率和治疗应答性之间的关系)。本发明的实施方式可用于玻片上细胞覆盖区域的代表性取样，而非整个覆盖区，一般如下进行根据细胞密度轨迹取像或多视野取像，直到达到最低成像细胞阈值。可以只对排序病变细胞内的亚组比照阳性/阴性检测阈值进行评估，条件是该亚组的临床和疾病意义已知。通常，所述亚组为样本中病变最严重的25或50个细胞，也可鉴定和采用其它亚组，这取决于样本来源、采样方法和具体疾病。本发明系统和方法的另一实施方式可用于组织样本，例如组织活检或手术中的样本。此外，该系统和方法可采用来自同一组织样本的苏木素-伊红(H&E)染色的相伴玻片 (companion slide)。该自动化方法筛查FISH制备玻片上组织样本覆盖的全部区域，并用 DAPI-染色来确定细胞核。然后，该系统清点DAPI-着染区域内各探针的信号，记录测得的各探针的拷贝数。软件系统继续对细胞和各细胞内染色体拷贝数自动计分，直到全部组织样本接受了检查。然后由软件评估玻片上至少含25个DAPI染色检出的细胞核的分区 (sub-section)。根据H&E相伴玻片上的各种疾病指标(disease indicators)来选定分区的位置。每个样本一般至少选取两个分区。然后由软件根据各确知染色体的拷贝数对已成像和计数的各细胞进行分类。例如，探针3明6，5 15和CEN7A各含两拷贝的正常细胞归为 2，2，2类。可根据探针信号模式鉴定出病变细胞。例如，将有两拷贝CEN7探针、5拷贝3明6 探针和3拷贝5pl5探针的细胞归为2，5，3类。全部成像细胞归类后，将检出探针信号数与系统计得的细胞核总数相比，得出每一个基因座的染色体拷贝数与计得细胞数之比。确定了各染色体基因座的这一比值后就能够比照疾病阳性/阴性阈值对样本进行评估。对于自动成像系统认定为比值异常的样本分区，可以先由专业人员手工复查和验证，然后才将检查结果交给医生。具体的分区大小和清点的细胞核数量可根据样本类型和采集方法而不同。此外，可对软件进行调整，使之反映出生物学差异(细胞形状、细胞大小、细胞核的DNA 含量、细胞之间的距离、细胞类型等)或疾病相关差异(数量异常的基因座数目量、单个细胞内某基因座上的病变数量、某种病变与存活率和治疗应答性之间的关系、组织样本的病变位置等)。本发明系统和方法的另一实施方式可用于组织样本，例如组织活检或手术中的样本。该自动化方法筛查FISH制备玻片上组织样本覆盖的全部区域，并用DAPI-染色来确定细胞核。然后，该系统清点DAPI-着染区域内各探针的信号，记录测得的各探针的拷贝数。 软件系统继续对细胞和各细胞内染色体拷贝数自动计分，直到全部组织样本接受了检查。 然后由软件评估玻片上至少含25个DAPI染色检出的细胞核的分区(sub-section)。每个样本一般至少选取两个分区。然后由软件根据各确知染色体的拷贝数对已成像和计数的各细胞进行分类。例如，探针3q ，5pl5和CEN7A各含两拷贝的正常细胞归为2，2，2类。可根据探针信号模式鉴定出病变细胞。例如，将含两拷贝CEN7探针、5拷贝3明6探针和3拷贝5pl5探针的细胞归为2，5，3类。全部成像细胞归类后，将检出探针信号数与系统计得的细胞核总数相比，得出每一个基因座的染色体拷贝数与计得细胞数之比。确定了各染色体基因座的这一比值后就能够比照疾病阳性/阴性阈值对样本进行评估。对于自动成像系统认定为比值异常的样本分区，可以先由专业人员手工复查和验证，然后才将检查结果交给医生。具体的分区大小和清点的细胞核数量可根据样本类型和采集方法而不同。此外，可对软件进行调整，使之反映出生物学差异(细胞形状、细胞大小、细胞核的DNA含量、细胞之间的距离、细胞类型等)或疾病相关差异(拷贝数异常基因座的数量、单个细胞内某基因座上的病变数量、某种病变与存活率和治疗应答性之间的关系、组织样本的病变的位置等)。可如下分析分值数据(scoring data)计数信号(如3q、5p或CEN7)之一的数量， 将其除以计分细胞核的总数；将所得数值记录在图表中分值单(Score Sheet)的首行。对任一探针，结果大于2则记作发生了扩增.如下分析分值数据加和信号(如3q、5p或CEN7)之一的信号数，将其除以计数细胞核的总数；将所得数值记录在图表中分值单(Score Sheet)的首行。对制定探针，结果大于2则记作发生了扩增。图像以样本编号和玻片编号来命名，保存。本发明还提供用于检测本文中所述区域内染色体异常的试剂盒。优选实施方式之一中，试剂盒包括一种或多种针对本文中所述区域的探针，以及本发明探针的任意组合。试剂盒还可以包括教导如何用试剂盒的内含物来检测遗传变异的使用说明。试剂盒也可以包括一种或多种以下成分协助探针检测的各种标记或标记试剂，缓冲液等用于杂交的试剂， 相间带(interphase spread)，牛血清白蛋白，包括封闭探针在内的其它封闭试剂，包括细针、拭子、抽吸器等在内的取样装置，阳性和阴性杂交对照以及本领域所知的其它对照。以下给出关于附图和相关实施例的解释是为了便于更好地理解本文尤其是实施例中频繁使用的一些术语。给予这些解释是为方便起见而非对本发明的限制。实施例实施例1在事先制备好的薄层、液基细胞学样品(马萨诸塞州莫尔伯勒市塞提克公司 (Cytyc, Marlborough, ΜΑ)的THINPREP )上进行 FISH。由THINPREP 小管制备玻片，然后进行预处理，包括蛋白酶消化、甲醛固定、洗涤后脱水。用双色多靶相间FISH探针试剂盒(阿伯特分子技术公司)进行杂交。该试剂盒包括直接标记的针对CEN7-浅蓝绿、 3明6基因座(3q_橙)和5pl5基因座(5p-绿)的探针。用荧光显微镜进行细胞检查。样品至少含800个供分析的细胞。测试阳性显示非整倍性和(1) 1. 0%或以上的被检细胞内测得3q拷贝数或5p拷贝数增益；(幻0. 9%或以上的被检细胞内测得仅3q拷贝数增益；或03)0. 7%或以上的被检细胞内测得仅5p拷贝数增益。测试阴性显示正常倍性和⑴低于1. 0%被检细胞发生3q拷贝数和5p拷贝数都增加；(2)低于0. 9%被检细胞内测得仅3q拷贝数增益；或(3)低于0.7%被检细胞内测得仅5p拷贝数增益。倍性异常和/ 或3q拷贝数升高的样品被认为晚期宫颈病风险高和预后不良。上述结果可作为宫颈非典型增生的诊断标记和预后标记。倍性异常和/或3q拷贝数和5p拷贝数都升高的样品被认为晚期宫颈病风险高和预后不良。实施例2图6的评述该样本显示ITERC基因和5pl5上Cri du Chat基因座拷贝数异常。1000个被检细胞中，986个细胞正常，8个检出TERC (3q)拷贝数异常升高，2个检查 Cri du Chat (5p)拷贝数异常升高，4个检出TERC和Cri du Chat (3q和5p)拷贝数都异常升高，病变细胞百分比为1.40%。实施例3图7的评述该样本显示ITERC基因和5pl5上Cri du Chat基因座的拷贝数正常。1000个被检细胞中，998个正常，2个检出TERC(3q)拷贝异常增多，OfCri du Chat (5p)拷贝异常增多，0个TERC和Cri du Chat (3q和5p)拷贝异常增多，病变细胞百分比为0. 20%。实施例4用荧光原位杂交(FISH)和染色体区域3明6上TERC基因的特异性探针分析人端粒酶基因(TERC)，3c^6。并且，用CEN7特异性探针评估DNA倍性。将宫颈细胞固定在玻片上，用这些荧光探针杂交。对杂交结果进行分析，评估正常细胞和病变细胞。实施例5图5的评述该样本显示TERC基因拷贝数异常。所附的是代表性的TERC基因拷贝数异常细胞照片。1030个被检细胞中，1012个正常，18个检出异常，异常细胞百分比为 1. 85%。实施例6图4的评述TERC基因拷贝数正常。未检出3明6上的基因扩增，并且，对染色体 7着丝粒的检查显示为正常二倍体细胞。但这并不能排除前文所述之外的位点发生其它异常的可能性。所附的是代表性的TERC基因拷贝数正常的细胞照片。800个被检细胞中，799 个正常，1个检出异常，病变细胞百分比为0. 1%。实施例7 JiKFISH由福尔马林固定、石蜡包封的(FFPE)组织样本切取4-微米厚的组织切片，在该切片上进行FISH。(图8和9)对玻片进行预处理，包括蛋白酶消化、洗涤和脱水。用双色 FISH探针组进行杂交，所述探针组含直接标记的CEN7特异性浅蓝探针和3明6基因座特异性探针(3q_橙)(探针由阿伯特分子技术公司提供)。用DAPI复染切片，用荧光显微镜分析细胞。分析每份样品最少50个细胞的倍性状态。如果选定细胞的3明6探针信号与细胞核之比大于等于2. 0，则认为该样品为非整倍性。如果选定细胞的3明6探针信号与细胞核之比小于2. 0，则认为该样品为正常倍性。如果患者倍性异常和/或3q拷贝数升高，则认为其预后不良，且晚期宫颈病风险高。可将上述结果作为宫颈非典型增生的诊断标记和预后标记。如果样品倍性异常和 /或3q拷贝数升高，则认为预后不良，且晚期宫颈病风险高。实施例8由福尔马林固定、石蜡包封的(FFPE)组织样本切取4-微米厚的组织切片，在该切片上进行FISH。(图10)对玻片进行预处理，包括蛋白酶消化、洗涤和脱水。用三色FISH探针组进行杂交，所述探针组含直接标记的CEN7特异性探针-浅蓝和3明6基因座特异性探针(3q_橙)以及5pl5基因座异性探针(5p-绿)(探针由阿伯特分子技术公司提供)。用 DAPI复染切片，用荧光显微镜分析细胞。分析每份样品最少50个细胞的倍性状态。如果符合以下条件，将样品判为非整倍性(1)选定细胞的3明6探针信号与细胞核之比大于等于2. 0 ； (2) 5pl5探针信号与细胞核之比大于等于2. 0 ； (3) 3q26和5pl5探针信号与细胞核之比大于等于2. 0。如果选定细胞的3明6或5pl5或3明6&5pl5两者的探针信号与细胞核之比小于2，则将样品判为倍性正常。如果样品倍性异常和/或3q拷贝数升高，则认为预后不良，且晚期宫颈病风险高。可将上述结果作为宫颈非典型增生的诊断标记和预后标记。如果样品倍性异常和 /或3q或5p拷贝数升高，则认为预后不良风险高，且晚期宫颈病风险高。实施例9 工作试剂的准备混合以下试剂制成甲醛溶液2. 7mL 37%甲醛溶液，97. 3mL IX PBS，定容至 IOOmL,充分混合。就该溶液倒入科普林氏缸(Coplinjar)。混合以下试剂制成2X SSC IOOml 20X SSC, 900ml dH20，定容至 IOOOml。实施例10:乙醇洗涤液用100%的乙醇和dH20配制70%和90%的稀释液。所得稀释液可用1周，除非出现蒸发或溶液应使用过多而变稀。不用时应常温下加盖保存。混合以下试剂制成0.4X SSC/0.3 % NP-40 :20ml 2xSSC，77.7ml dH20, 0.;3mlNP-40，定容至100ml，充分混合。每日结束时处理掉废液。混合以下试剂制成 2XSSC/0. 1% NP-40 :99. 9ml 2xSSC,0. Iml NP-40，定容至 100ml，充分混合。混合以下试剂制成 2X SSC :900ml dH20,100ml 20x SSC，定容至 1000ml。IX PBS :900ml dH20,100ml IOx PBS，定容至 IOOOml0 0. IM HCl :1ml IN HCl，9ml dH20，定容至 100ml。胃蛋白酶(储备液) (100MG/ML)胃蛋白酶5g，无菌水50ml。充分混合。冰上保存，分成50 μ 1的小份，-20°C 保存。胃蛋白酶(工作溶液，新鲜制备)95.5ml dH20,0. 5ml IM HCl0 37°C预热(约15分钟)。在干净的科普林氏缸(Coplin jar)中加入20毫升胃蛋白酶储备液，并加入预热的 0. IM HCl。实施例11 :DNA杂交过程第一天1.THINPREP机器(THINPREP 2000S0P)上制作玻片；2.制备并预热所有需要的试剂；3.将玻片在2X SSC中放置5分钟，常温；4.将玻片在蛋白酶溶液中放置10分钟，37°C (消化步骤)；5.将玻片在磷酸盐缓冲液(PBQ中放置5分钟，常温(洗涤)；6.将玻片在甲醛中放置5分钟，常温(固定)；7.将玻片在Ix磷酸盐缓冲液(PBQ在中放置 5分钟，常温(洗涤)；8.将玻片在70% EtOH中放置1分钟，常温；9.将玻片在90% EtOH 中放置1分钟，常温；10.将玻片在ΙΟΟ^ΚΟΗ中放置1分钟，常温；11.干燥玻片；12.漩涡搅拌和离心DNA探针并分成适当等体积的小份；13.在每个目标区域加10微升探针；14.盖上22mm正方形盖玻片，以胶布(rubber cement)密封；15. 72°C变性2分钟；16.玻片在加湿仓中37°C孵育14-16小时(过夜)。第二天制备和预热洗涤溶液1.从加湿仓中取出玻片；2.小心地去除胶布，将玻片浸在hSSC中，常温，以去除盖玻片；3.将玻片在0. 4XSSC/0. 3% NP-40中放置1分钟， 65°C；4.取出后在2XSSC/0. 1% NP-40中放置1分钟，常温；5.取出后将玻片立即放在暗箱 (dark drawer)中干燥；6.在目标区域加一滴DAPI/抗褪色(antifade)溶液，在DAPI染液之上盖一张盖玻片Oh50mm)，不要引入气泡；7.玻片避光保存，直至信号检测。实施例12 分析用配有100-瓦水银灯和以下滤光片的落射荧光显微镜来检查DNA探针组和DAPI 复染，所述滤光片包括DAPI、浅光谱浅蓝绿(染色体7着丝粒)、光谱橙(3明6上的基因
18座)、光谱绿(5pl5上的基因座)滤光片。用DAPI滤光片和100倍放大率快速扫描患者玻片的样品区来确定细胞的数量和质量。分析从目标区域的左上象限开始。用63倍油镜从左向右、从上向下扫描视场，同一区域不重复扫描。数出总计1000个细胞(用1个或2个读数仪)。可将该步骤自动化以提高分析通量。扫描开始时用光谱橙滤光片。清点并记录 3明6探针信号为正常值2的细胞。在已经进行了 3明6扫描的各视野内，换用光谱绿滤光片重新扫描5pl5探针信号。当发现3明6或5pl5信号超过2的细胞时，换用浅蓝绿频道 (channel)扫描CEN7信号。所有3明6或5pl5信号超过2的细胞都认为是病变细胞。在记分单上的对应栏目内填入细胞数。3明6或5pl5信号值为4且CEN7信号为4的细胞记录为四倍体。用双色探针组进行以上分析时，扫描、成像和信号记录应做相应调整以反应实际所用的双色探针组。图7样本评述表明3明6和5pl5染色体区域拷贝数正常。在被检的细胞中，未检出3明6和5pl5处的基因座扩增，染色体7着丝粒检测显示样本倍性正常。实施例13 适应自动化分析和评分的方法和样本选择在NeoDiagnostix受试人群中，总共20份样本的细胞学、HPV和双色法检查结果为阴性。此外，这20样本均取样1000个细胞，以尽可能避免分析偏差。这些三阴性样本被认为是疾病阴性的，因此，FISH认定的病变细胞将被视作“假阳性”。在确定上述20个样本中的“假阳性”数量后，就可以用所述BETAINV算法来确定正常样本和病变样本之间的阈值。结果对20份三阴性样本的FISH检查结果进行复查以确定每一样本中各染色体基因座的“假阳性”细胞总数。有一样本被FISH检出有5个细胞3明6和5pl5基因座双异常，这是测得的单份样本“假阳性”细胞数最大值。将这一结果用到BETAINV算法中，确定置信度95%的正常与病变之间的阈值。方程中的细胞总数为1000。BETAINV算得，阈值为 0. 0104(1.0% )，或者，每1000个计数细胞中10个细胞。另据计算，99%置信度的阈值为 0. 0129(1. 3% )或 13/1000 细胞。此外，对20份三阴性样本的FISH检查结果进行复查以确定每一样本中仅染色体基因座5pl5上的“假阳性”细胞总数。经FISH鉴定，该样本有3个细胞5pl5异常，这是测得的单份样本“假阳性”细胞数最大值。将这一结果用到BETAINV算法中，确定置信度95% 的正常与病变之间的阈值。方程中的细胞总数为1000(来自ND10107B)。BETAINV算得，阈值为0. 0077(0. 7% )，或者，每1000个计数细胞中7个细胞。另据计算，99%置信度的阈值为 0. 0099 (0. 9% )或 9/1000 细胞。按照ACMG指南，确定正常与病变样本之间的阈值是为了用于宫颈DNADtex诊断测试。据测定，每份样本的置信度95%的阈值为10/1000个细胞或1.0%病变细胞。所以，将 FISH检出1.0%或更多细胞病变的样本认为是病变样本，表明患者恶化的风险较高。这些情况下将发出阳性诊断检查结果。如果某样本的病变细胞数低于1.0%，则发出阴性诊断检
查报告。实施例14 宫颈组织活检样本FISH 试剂可采用硫氰酸钠(Kreatech LK-064A)， 二甲苯(Mallinckrodt 8668-04，500ml)，蛋白酶(XXIV 细菌型)(Sigma P8038，100ml)。工作试剂的准备预处理液(1M硫氰酸钠)每次用前新鲜制备2g硫氰酸钠，50ml去离子水， 温热至80°C。蛋白酶K:将0. 025g蛋白酶K在Iml水中制成悬浮液，用作25mg/ml的储备液， 用前于-20°C保存，最多存放一周。每次用前新鲜制备500微升蛋白酶K储备液；49.5ml 2xSSC ；温热至 450C :2xSSC ； 100ml 20xSSC ；900ml dH20 ；定容至 1000ml。乙醇洗涤液用100%乙醇和dH20制备70%和90%的稀释液。所得稀释液可用1周，除非出现蒸发或溶液应使用过多而变稀。不用时应常温下加盖保存。探针混合物光谱金标记的IX TERC ；光谱绿标记的 IX Cri du Chat ；光谱浅蓝绿标记的 0. IX CEP 7 ；2x SSC/0. 1% Tween-20 (65°C 预热)。混合以下组分:20ml 2xSSC ；77. 7ml dH20 ；0. 3ml NP-40 ；定容至100，充分混合。第一天的实验过程(1)65°C烘60分钟。(2)切片在二甲苯中浸2次，每次10分钟，以去除石蜡。⑶用ΙΟΟ^ΚΟΗ脱水，2次，每次5分钟。(4)瞭干。(5)玻片在预热的预处理液中80°C孵育8分钟。(6)常温去离子水洗涤3分钟。(7)玻片用70^^90%和100% KOH脱水，各1分钟。(8)晾干。(9)玻片在hSSC中孵育5分钟。(10)玻片在预热的蛋白酶K溶液中45°C孵育10分钟。[可将步骤5至10换成玻片在预热的蛋白酶K溶液中 45°C孵育55分钟。然后进行第11步，并继续。](11)玻片用&SSC淋洗5分钟。(1 玻片用70^^90%和100% EtOH脱水，各1分钟。(13)晾干.(14)加探针混合物(略微离心)， 盖上盖玻片，用胶布密封。根据组织切片的尺寸采用尽可能小的、合适的盖玻片。注意组织切片很容易包含气泡，将探针混合物直接滴加中载玻片的组织切片上可以尽可能避免气泡。(15)72°C共变性5分钟。(16)于加湿仓内37°C孵育过夜。第二天的实验过程⑴预热并洗涤2X SSC/0. TWeen-20，65°C。(2)将玻片浸中^cSSC中，让盖玻片浮起，为尽可能减少剪切力，不要通过用抽拉的方式取下盖玻片。(3)玻片在2XSSC/0. 1 % Tween-20中洗涤两次，65°C，每次5分钟。(4)玻片用常温 2XSSC/0. 1% NP-40淋洗1分钟。( 取出玻片，竖直放在暗箱内干燥。(6)加上含抗褪色 w/DAPI (24x50mm)的盖玻片，4°C保存。根据以上对具体实施方式
的充分说明，结合现有技术，很容易发现可以在本发明的总体构思范围内对所述具体实施方式
加以改变和调整从而使用不同的应用目的，因此， 这些改动后调整同样属于在本文所述的具体实施方式
或其等效形式。应当理解，本文中的词语或术语仅用于描述，不作为限定。附图和说明书中的实施方式仅是举例，就具体词语而言，除非格外说明都取其常用意义，除描述之用外不具有限定意义，因此，权利要求的范围不受此限制。并且，本领域技术人员可以看出，前文所述的方法中，步骤的次序可以改变，有些步骤可以合并。所以，权利要求的范围不限于所述的具体实施方式
。本发明明确通过援引引入提及的各篇专利申请和专利，这些专利申请和专利所援引的文献(包括专利申请过程中引入的文献；“申请中引用的文献”)，以这些专利申请和专利为优先权基础或与之对应的各PCT和外国申请或专利，以及这些申请援引的文献所援引的文献。一般说来，本文中对文献的引用可见于后文文献列表中，或者正文中；并且，本发明明确通过援引引入这些文献(“本文引用的文献”)以及本文引用的文献所引用的文献 (包括制造商的说明书，使用说明等)。参考文献Fitzpatrick, MA 等，Gynecology Oncol (妇产科护理学和肿瘤学)，2006，103 458-462。Hopman, AHN 等，J Pathol (病理学杂志)，2006，210 :412_419。Heselmeyer-Haddad, K 等，Am J Pathol (美国病理学杂志)，2005，166 1229-1238。Huang, FY 等，Cancer Genet Cytogenet (肿瘤遗传学与细胞遗传学)，2005，157 42-48。Heselmeyer-Haddad, K 等，Am J Pathol (美国病理学杂志)，2003，163 1406-1416。Rao，PH 等，BMC Cancer (BMC 肿瘤)，2004，4 :5_13。Heselmeyer 等，Genes, chromosomes&Cancer (基因，染色体与月中瘤)，1997，19 233-240 οHeselmeyer 等，PNAS (美国科学院院刊)，1996,93 :479_484。Andersson 等，British Journal of Cancer (英国肿瘤杂志)，2006，1_8。Atkin, N. B.，1997 Elsevier ；95 :33_39。Arias-Pulido, H. et. al. 2002 Mol. Cancer (肿瘤的分子学)；1 :3。Huang F. Y. et al. 2005 Cancer Gen.和 Cyto.(肿瘤遗传学与细胞遗传学)，157 46-47。Macville M.等 1999 Cancer Res.(肿瘤研究)，59 141-50。Heselmeyer K.等 1997Genes, chromosomes&Cancer (基因，染色体与月中瘤)，19 233-40。Rao P. H.，等 2004BMC Cancer (BMC 肿瘤)；4 :5。Lockwood W.等 Int. J. Cancer (世界肿瘤学杂志)2006 ；120 :436-443。Takuma, Y.等 2004 Journal of Gastroenterology and Hepatology (消化道与肝脏)；19 1300-1304。Takahashi S.等 2000 Eur. Jour. Of Cancer (欧洲肿瘤学杂志)，36 :496_502。Toshikuni, N.等 2000 Br. J. Cancer (英国肿瘤学杂志)；82 ;833_837。Zhang A.等 2000 Cancer Res.(肿瘤研究)，60 :6230-6235。Zhang A.等 2002 Genes, chromosomes&Cancer (基因，染色体与月中瘤)，34 269-75。Huang, K. F.等，J. Formos Med. Assoc (台湾医学会杂志)· 2007 Nov. ；106(11) 894-902。Hopman, A. H.等，J. Pathol (病理学)· 2006Dec ;21(K4) :412_9。Jee, K. J.等，Mod Pathol.(当代病理学)2001 May; 14 (5) :377-81。Caraway, N. P.等，Gynecol. Oncol.(妇科肿瘤)2008 July ；110(1) :37-42. Epub 2008 Apr. 22。Heselmeyer-Haddad,K.等，American Journal of Pathology (美国病理学杂志)， 2005 ； 166 :1229-1238。Cao, Y.等，Cancer Sci 2008 June ；99 (6) :1092-1099Wolf, D. J.等(2007) Period Guidelines for f iurosence in situ hybridization Testing(原位杂交检查中荧光周期导引)。
权利要求
1.一种在样品中检测染色体异常，从而确定是否存在宫颈细胞病变的方法，所述方法包括将患者的样品与核酸探针杂交，所述探针结合染色体5p上的靶核酸序列； 将患者的样品与核酸对照探针杂交，所述对照探针结合染色体7的着丝粒(CEN7)；和检测染色体5p和CEN7上形成的杂交复合物，其中检测到所述杂交复合物表明染色体拷贝数与正常细胞相比升高，并与宫颈细胞病变的存在相关。
2.一种在样品中检测染色体异常，从而确定是否存在宫颈细胞病变的方法，所述方法包括将患者的样品与核酸探针杂交，所述探针结合染色体3q上的靶核酸序列； 将患者的样品与核酸对照探针杂交，所述对照探针结合染色体7的着丝粒(CEN7)；和检测染色体3p和CEN7上形成的杂交复合物，其中检测到所述杂交复合物表明染色体拷贝数与正常细胞相比升高，并与宫颈细胞病变的存在相关。
3.一种在样品中检测染色体异常，从而确定是否存在宫颈细胞病变的方法，所述方法包括将患者的样品与核酸探针杂交，所述探针结合染色体3q上的靶核酸序列； 将患者的样品与核酸探针杂交，所述探针结合染色体5p上的靶核酸序列； 将患者的样品与核酸对照探针杂交，所述对照探针结合染色体7的着丝粒(CEN7)；和检测染色体5p、染色体3p和CEN7上形成的杂交复合物，其中检测到所述杂交复合物检测表明染色体拷贝数与正常细胞相比升高，并与宫颈病是存在相关。
4.如权利要求1所述的方法，所述宫颈细胞病变包括以下一种或多种宫颈癌变、未见上皮内病变或恶性(NILM)、人乳头瘤病毒(HPV)阳性、显著性未明的非典型性鳞状细胞 (ASC-US)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)、非典型鳞状细胞、HSIL(ASC-H)、显著性未明的非典型性腺细胞(AGUS)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)、宫颈非典型增生、初癌、恶化前病变、宫颈癌、宫颈腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈上皮内瘤I(Cim)、宫颈上皮内瘤2 (CIN2)、宫颈上皮内瘤3(CIN3)、原位癌和浸润性宫颈癌。
5.如权利要求2所述的方法，所述宫颈细胞病变包括以下一种或多种宫颈癌变、未见上皮内病变或恶性(NILM)、人乳头瘤病毒(HPV)阳性、显著性未明的非典型性鳞状细胞 (ASC-US)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)、非典型鳞状细胞、HSIL(ASC-H)、显著性未明的非典型性腺细胞(AGUS)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)、宫颈非典型增生、初癌、恶化前病变、宫颈癌、宫颈腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈上皮内瘤I(Cim)、宫颈上皮内瘤2 (CIN2)、宫颈上皮内瘤3(CIN3)、原位癌和浸润性宫颈癌。
6.如权利要求3所述的方法，所述宫颈细胞病变包括以下一种或多种宫颈癌变、未见上皮内病变或恶性(NILM)、人乳头瘤病毒(HPV)阳性、显著性未明的非典型性鳞状细胞 (ASC-US)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)、非典型鳞状细胞、HSIL(ASC-H)、显著性未明的非典型性腺细胞(AGUS)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)、宫颈非典型增生、初癌、恶化前病变、宫颈癌、宫颈腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈上皮内瘤I(Cim)、宫颈上皮内瘤2 (CIN2)、宫颈上皮内瘤3(CIN3)、原位癌和浸润性宫颈癌。
7.如权利要求1所述的方法，所述探针结合5p15上的靶核酸。
8.如权利要求2所述的方法，所述探针结合3q27或3明6上的靶核酸。
9.如权利要求3所述的方法，所述探针结合5pl5和3明6上的靶核酸。
10.如权利要求3所述的方法，所述探针结合5pl5和3明6上的靶核酸。
11.如权利要求3所述的方法，所述探针结合5pl5和3明6上的靶核酸序列。
12.如权利要求1或3所述的方法，所述5p上的靶核酸序列包含位于以下所述基因座的靶标:5pl5. 33、5pl5. 32、5pl5. 31、5pl5. 2、5pl5. 1，或其部分区域，或它们的组合。
13.如权利要求2或3所述的方法，所述3q上的靶核酸序列包含位于以下所述基因座的靶标:3q26. I、3q26. 2、3q26. 31、3q26. 32、3q26. 33。
14.如权利要求1或3所述的方法，所述染色体臂5p上的靶核酸序列包含源自TERT基因的核酸序列。
15.如权利要求2或3所述的方法，所述染色体臂3q上的靶核酸序列包含源自TERC基因的核酸序列。
16.如权利要求1或3所述的方法，所述染色体臂5p上的靶核酸序列包含源自TRIP13 基因的核酸序列。
17.如权利要求2或3所述的方法，所述靶核酸包含PIC3CA或GLUT2。
18.如权利要求1或3所述的方法，所述靶核酸序列位于5pl5的Cridu Chat基因座。
19.如权利要求1、2或3所述的方法，还包括靶向一条或多条以下染色体臂的探针 lq、20q、12q、19q、llq、6q、17p、7、8q、9q、16q、2q、9p、10q、18p，以及它们的任意组合。
20.如权利要求1、2或3所述的方法，还包括靶向一个或多个以下区域的探针 Iq21-31、20ql2、12ql3-24、19ql3、llq21、7qll-22、8q24、9q33_34、16q23、2q32、9p22、 10q21-24U8pll,以及它们的任意组合。
21.如权利要求1、2或3所述的方法，其中，测得四倍性。
22.如权利要求1、2或3所述的方法，还包括用FISH、CISH、PCR、ELISA、CGH、阵列CGH 或流式细胞术进行检测。
23.如权利要求1、2或3所述的方法，所述样品包含自子宫、宫颈、阴道、阴道口、外阴、 卵巢或输卵管取样的细胞。
24.如权利要求1、2或3所述的方法，所述样品包含中期细胞或间期细胞。
25.如权利要求1、2或3所述的方法，所述含宫颈细胞的样品获自pap涂片检查、薄层细胞学样本、薄层悬浮液、细针抽吸、组织样本、穿刺组织活检、宫颈环形电切除术(LEEP)、 锥切活检、子宫切除术、宫颈内刮除术(ECC)。
26.如权利要求1、2或3所述的方法，所述样品来自人乳头瘤病毒感染阳性患者。
27.一种用于按照权利要求1、2或3所述检测染色体变异的试剂盒。
28.一种评估患者病情转变的方法，包括权利要求1、2或3所述方法的步骤。
29.如权利要求23所述的方法，还包括测定患者病情由低度宫颈非典型增生向高度宫颈非典型增生或宫颈癌转变。
30.一种评估患者发生宫颈细胞病变的风险、倾向性或可能性的方法，包括利要求1、2 或3所述方法的步骤。
31.一种评估患者病情稳定或向低度宫颈非典型增生或正常消退的方法，包括利要求 1、2或3所述方法的步骤。
32.一种确定一种或多种以下疾病状态的方法宫颈癌变、未见上皮内病变或恶性 (NILM)、人乳头瘤病毒(HPV)阳性、显著性未明的非典型性鳞状细胞(ASC-US)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)、非典型鳞状细胞、HSIL(ASC-H)、显著性未明的非典型性腺细胞(AGUS)、 高度鳞状上皮内病变(HSIL)、宫颈非典型增生、初癌、恶化前病变、宫颈癌、宫颈腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈上皮内瘤I(Cim)、宫颈上皮内瘤2 (CIN2)、宫颈上皮内瘤3 (CIN3)、原位癌和浸润性宫颈癌，所述方法包括利要求1、2或3所述方法的步骤。
33.如权利要求1、2或3所述的方法，所述方法检测、确认或证实对宫颈细胞病变的治疗获得成功。
34.如权利要求1、2或3所述的方法，所述方法定量评估宫颈细胞病变的程度和/或严重程度。
35.如权利要求1、2或3所述的方法，所述检测还包括对杂交复合物的自动成像分析。
全文摘要
本发明提供用于监测癌症特异性遗传变异的诊断检查，用于诊断宫颈细胞病变和预测可能发展成癌症的患者。本发明采用FISH分析法检测靶向3q和/或5p的探针来测定染色体3和染色体5的拷贝数，由此检定遗传变异。
文档编号G01N33/50GK102203283SQ200980136978
公开日2011年9月28日 申请日期2009年7月21日 优先权日2008年7月21日
发明者C·B·卡安, E·S·莱特, G·A·恩德斯, M·乌彭德 申请人:新诊断学股份有限公司