专利名称：一种小轴海绵活性产物储存细胞的标记方法
技术领域：
本发明属于海洋生物技术领域，涉及海洋动物细胞的鉴定以及活性天然产物的代谢研究，具体地说是小轴海绵(Anixella sp.)中活性产物储存细胞(所指的储存细胞，其学名为“小球细胞”，英文为“Spherulous Cell”简称Sp细胞)的一种化学染色标记方法； 本发明可简便准确地鉴别该类细胞，并为细胞培养和活性产物代谢提供分化和调控指标。
背景技术：
海绵是海洋天然药源活性产物的重要来源，在海绵各种类型的细胞中，Sp细胞 (Sp细胞)是活性产物的重要贮存场所。我国南海小轴海绵(Axinellasp.)中发现的两种具有治疗骨关节炎和老年痴呆症活性的生物碱，debromohymenialdisine (DBH)和 hymenialdisine(HD)，也存在于该海绵的Sp细胞中。鉴于Sp细胞具有储藏次生代谢产物的特性，在目前的海绵细胞培养体系——细胞团培养的过程中，定向调控向Sp细胞分化，是具有应用前景的活性化合物生产方式。而对Sp细胞的分化跟踪和定性定量研究，需要找到一种其独有而稳定的标记方法。目前对海绵细胞种类的鉴定，主要以形态观察为主。电镜观察比较清晰准确，但制样过程较繁琐；光镜观察虽简便但有一定局限性。对于小轴海绵而言，虽然Sp细胞在光镜下有显著的深棕色特征，但细胞于玻片上干燥后再浸润，便会丧失其颜色特性而变透明 (由于溶胀导致内部小颗粒泄露所致)，不利于后续的观察鉴定。另外在小轴海绵中，除深棕色的Sp细胞外，还有部分内含颗粒的灰色细胞，在光镜观察时容易与Sp细胞混淆(图 Ι-a)。细胞化学染色方法能够原位显示细胞的内含物质，具有操作简便和显色稳定的特点， 可弥补电镜和光镜鉴定方法的不足。以往的海绵细胞化学染色研究多集中于对常规细胞内含物(如DNA、RNA、糖原、月旨肪等)的检测，此外也有关于海绵细胞的酸性磷酸酶和脂酶的活性报道。然而相关资料表明，迄今为止尚未能对海绵中的某类细胞建立特异性的染色标记。使用细胞化学染色方法表征小轴海绵种活性产物储藏细胞(Sp细胞)，具有重要的理论研究和实际应用价值。

发明内容
本发明的目的在于提供一种小轴海绵中活性产物储存细胞(Sp细胞)的简便可靠的鉴别方法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为小轴海绵活性产物储存细胞(Sp细胞)的标记方法，使用3，3' _ 二氨基联苯胺 (DAB)染色液对固定后的海绵细胞染色，光学显微镜下观察，颗粒状着染的细胞为小轴海绵活性产物的储存细胞(Sp细胞)。具体操作步骤为取小轴海绵细胞，使用含2-4%甲醛或2-3%戊二醛的无钙镁海水(CMFASW) (CMFASW中可含10-30mMEDTA)固定0. 5-1. 5小时，离心收集细胞，加入CMFASW调整细胞 悬液密度约为IO7个/ml，涂于载玻片，细胞涂片干燥后用蒸馏水浸泡除去盐分，向玻片上的细胞区域滴加3，3' _ 二氨基联苯胺(DAB)染色液，室温染色5-8分钟，洗掉染色液，光学显微镜放大400倍以上观察，细胞内含有深棕色着染颗粒(直径1-3 μ m)的，为小轴海绵活性产物的储存细胞(Sp细胞)。所述的海绵细胞可以是海绵组织离散的细胞，也可以是细胞团培养不同阶段的细胞；无钙镁海水，可以是常规配方的不含钙镁离子的人工海水，其中NaCl含量30-35g/L ；3， 3' _ 二氨基联苯胺(DAB)染色液的组成为3，3' - 二氨基联苯胺(DAB)2.5-10g/L，过氧化氢(H2O2) 0. 1_1%，三羟甲基氨基甲烷(Tris-Base) 3-10g/L，ρΗ7· 2-7. 4。本发明的优点如下1.本方法简便易行，与电子显微镜观察鉴定相比，避免了使用复杂的制样流程和昂贵的试剂仪器，节约了操作成本和时间。2.光学显微镜下观察，小轴海绵中除了深棕色的Sp细胞(图Ι-a箭头所指)以夕卜，还有部分深灰色细胞(图Ι-a三角所指)，两者易于混淆；本方法使用化学染色法显示小球细胞内部独有的过氧化物酶体，与单纯的外观观察相比，结果更准确可靠。3.过氧化物酶是广泛存在于动植物中的一类酶，但很多细胞的酶活水平不足以在化学染色中显色(如图5所示的繁茂膜海绵，就无明显着染细胞)，本发明充分利用了小轴海绵Sp细胞与其它类别细胞在酶活性质上的巨大差异，以DAB染色方法，清晰地显示了活性产物储存 细胞，便于在细胞分化和代谢调控研究中的大规模计数和统计。4.细胞经染色后可长期保存和观察。


图1为小轴海绵组织固定后离散，细胞经DAB染色的照片(图中箭头指示Sp细胞， 三角指示外观易与Sp细胞混淆的灰色细胞)(a)组织固定后初离散，(b)细胞经DAB染色后(比例尺=50 μ m)；图2为小轴海绵不同类型细胞的DAB染色照片(a)富集的Sp细胞，(b)富集Sp 细胞的DAB染色，(c) 29g离心的大细胞，掺杂个别Sp细胞(箭头所指为Sp细胞)，(d) 29g 离心大细胞的DAB染色，掺杂的Sp细胞阳性着染(箭头所指为Sp细胞)，(e) IlOg离心的小细胞，不含Sp细胞，(f) IlOg离心的小细胞的DAB染色，不含Sp细胞，染色结果为阴性， 比例尺25 μ m ；图3为小轴海绵不同类型细胞蛋白提取物的非变性凝胶电泳(native-PAGE)富集的Sp细胞、29g和IlOg离心细胞的蛋白提取物考马斯亮蓝(CBB)和DAB染色，显示了 Sp 细胞的特有DAB阳性条带(CB)；图4小轴海绵细胞团培养5天离散后DAB染色照片(a)离散的细胞，(b)离散细胞的DAB染色(箭头所指为Sp细胞，三角所指为吞噬Sp细胞后的原细胞)，Sp细胞为颗粒状着染，吞噬Sp细胞后的原细胞为弥散状着染(不含阳性染色颗粒)，两者易于区分，比例尺 50 μ m ；图5繁茂膜海绵细胞的DAB染色照片(a)离散的细胞，(b)离散细胞的DAB染色 (如图所示，繁茂膜海绵中并无明显的细胞着染，DAB颗粒状着染是小轴海绵中Sp细胞的特异性标志)，比例尺50 μ m。
具体实施例方式下面通过操作实例对本发明进行进一步说明，小轴海绵采集自中国南海西沙海域，使用显微照相技术进行染色观察。实施例1海绵组织离散后DAB染色显示活性产物储藏细胞(Sp细胞)取新鲜的小轴海绵组织，于含IOmM EDTA的CMFASW中浸泡10分钟，弃去浸泡液， 加入含4%甲醛的CMFASW，1. 5小时后轻轻挤压组织块，得到的细胞液29g离心，弃上清，力口入CMFASW成为细胞悬液，取20 μ 1涂片，干片后浸入蒸馏水，取出后向细胞区域中滴加DAB 染色液(DAB 10g/L, H2O2O. 1%, Tris-Base 9. 68g/L，ρΗ7· 4)，染色 5min，自来水洗掉染液， 光镜下观察，细胞内含有深棕色着染颗粒的为Sp细胞(图1)。实施例2 小轴海绵不同细胞组分的DAB染色取细胞分离得到的不同组分富集的Sp细胞(图2-a)、29g离心的大细胞(含个别Sp细胞，图2-c)和IlOg离心的小细胞(不含Sp细胞，图2-e)，加入含2. 5%戊二醛的 CMFASff,固定0. 5小时，离心收集细胞，细胞悬液涂片，干燥后用蒸馏水浸泡除去盐分，向玻片上的细胞区域滴加DAB染色液(DAB 2. 5g/L，过氧化氢l%，Tris-Base 3. 63g/L，pH7. 2)， 染色8分钟，洗掉染色液，光学显微镜放大400倍以上观察，富集的Sp细胞内含有深棕色着染颗粒(图2-b)，500rpm大细胞中含个别颗粒状着染的Sp细胞(图2_d)，IOOOrpm小细胞中不含Sp细胞(无着染，图2-f)；将这几类细胞的蛋白提取物进行非变性电泳，发现参与 DAB反应的酶只存在于Sp细胞中(图3)。该实施例充分表明，在小轴海绵中只有Sp细胞具有DAB颗粒状着染的特征，并且相关的过氧化物酶为Sp细胞的特征蛋白。实施例3小轴海绵细胞团培养过程中的细胞DAB染色取培养5天的小轴海绵细胞团，于含30mM EDTA的CMFASW中离散，加入甲醛至终浓度2 %，固定1小时后细胞离心，弃上清，加入CMFASW成为细胞悬液，取20 μ 1涂片，干燥后浸入蒸馏水，取出后向细胞区域中滴加DAB染色液(DAB 5g/L，H2O2 0.4%, Tris-Base 6. 05g/L，pH7. 2)，染色5min，自来水洗掉染液，光镜下观察，部分吞噬了 Sp细胞的原细胞呈整体弥散状着染，不符合Sp细胞的特征，易于与Sp细胞区分，而细胞内含有深棕色着染颗粒的为Sp细胞(图4)。该实施例表明，DAB颗粒状着染鉴定Sp细胞的方法，不仅适用于组织刚离散得到的细胞，还适用于细胞培养的过程，该方法能很好地将Sp细胞与吞噬Sp细胞后的原细胞区分开。对比例繁茂膜海绵细胞的DAB染色取新鲜的繁茂膜海绵组织，于含IOmM EDTA的CMFASW中浸泡10分钟，轻轻挤压组织块使细胞离散，得到的细胞液IlOg离心，加入含2. 5%戊二醛的CMFASW固定1小时， 取20 μ 1涂片，干片后浸入蒸馏水，取出后向细胞区域中滴加DAB染色液(DAB 10g/L, H2O2 0. 1%, Tris-Base 9. 68g/L，pH7. 4)，染色5min，自来水洗掉染液，光镜下观察，无明显着染细胞(图5)。本对比例说明，虽然过氧化物酶是一类广泛存在的酶，但并非能使各类细胞染色和区分，小轴海 绵中Sp细胞的DAB染色具有特异性。
权利要求
1.一种小轴海绵活性产物储存细胞的标记方法，其特征在于海绵细胞经固定液固定后，使用3，3' -二氨基联苯胺染色液染色，光学显微镜下观察，颗粒状着染的细胞为小轴海绵活性产物的储存细胞。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于所用的固定液为含体积浓度2-4%甲醛或2-3 %戊二醛的无钙镁海水，无钙镁海水中可含10-30mM乙二胺四乙酸二钠，固定时间 0. 5-1. 5 小时。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于海绵细胞染色过程3，3'-二氨基联苯胺染色液的组成为3，3' - 二氨基联苯胺2.5-10g/L，过氧化氢体积浓度0. 1-1%，三羟甲基氨基甲烷 3-10g/L, ρΗ7· 2-7. 4。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于光学显微镜下观察时，放大>400倍，含有深棕色着染颗粒的细胞，为小轴海绵活性产物的储存细胞。
全文摘要
本发明涉及一种小轴海绵(Anixella sp.)活性产物储存细胞的标记方法，该方法是使用3，3′-二氨基联苯胺(DAB)细胞化学染色法对海绵细胞染色，光学显微镜下观察颗粒状着染的细胞，即为小轴海绵中活性产物Debromohymenialdisine和Hymenialdisine的储存细胞。该方法弥补了目前单纯通过电子显微镜和光学显微镜进行细胞鉴定的不足，具有简便清晰、稳定可靠的特点。
文档编号G01N1/30GK102221494SQ20101014835
公开日2011年10月19日 申请日期2010年4月16日 优先权日2010年4月16日
发明者宋悦凡, 张卫, 张锦友, 曲翊, 曹旭鹏 申请人:中国科学院大连化学物理研究所