专利名称：一种毛细管液相色谱柱及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种液相色谱柱及其制备方法，特别是关于一种毛细管液相色谱柱及其制备方法。
背景技术：
毛细管液相色谱(μ-HPLC)是一种高效、快速的分离分析方法，与常规液相色谱(HPLC)相比，具有总分离效能高，固定相、流动相和样品消耗少，环境污染小，易与二级色谱系统和质谱等检测器在线联用等优点，在生化分析、医药等领域具有广阔的应用前景，因此成为色谱领域的重要研究方向之一。近年来，μ-HPLC作为蛋白质混合物的高效分离方法，与二维凝胶电泳互为补充，在蛋白组学研究中正在发挥着极为重要的作用。毛细管色谱柱的制备方法一直是μ-HPLC的难点之一，筛板的制备又是其中的关键。
与常规液相色谱柱不同，由于毛细管液相色谱柱的柱体积小，色谱系统内存在的死体积对柱效的影响很大，因此，柱尾与引出管连接处的设计非常关键，如设计不当将导致样品扩散，柱效降低。目前使用的毛细管液相色谱柱的柱尾设计主要有三种模式，第一种筛板3采用多孔聚四氟乙烯(如图1所示)，将内径小于毛细管柱1的石英毛细引出管4紧靠多孔筛板3，用环氧树脂6将毛细管柱1和石英毛细引出管4连接起来。在引出管4的适当位置制备检测窗口5，柱上检测。这样的连接方式不可避免地存在死区，样品扩散至死区后由于滞留的原因，造成柱效降低。第二种制备筛板的方式与电色谱的筛板相似，通过烧结色谱填料的方法制备筛板，但是，这种制备筛板的技术不易掌握，筛板的孔径很难控制均一，并且这类筛板与前一种筛板一样，往往只能在柱端口制备，带检测窗口的引出管需要另外连接。第三种筛板采用多孔聚四氟乙烯或多孔不锈钢材料，通过零死体积不锈钢两通连接柱体、筛板和引出管，但零死体积两通不易加工。

发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种毛细管液相色谱柱及其制备方法。
为实现上述发明目的，本发明采取以下技术方案一种毛细管液相色谱柱，它包括一无需粘接的整根弹性石英毛细管，所述毛细管的中部设置有一由有机聚合物原位聚合形成的筛板，所述筛板一侧的柱体内填充有采用高压匀浆填充法填充的固定相，所述筛板另一侧的引出管上，设置有将所述毛细管表面聚酰亚胺涂层烧掉2～3mm形成的检测窗口。
所述毛细管内填充的固定相为正相液相色谱填料，或反相液相色谱填料，或离子交换填料，或体积排阻色谱填料中的一种。
所述毛细管的内径为0.05～0.53mm。
一种制备上述毛细管液相色谱柱的方法，它包括以下步骤(1)选择一内径为0.05～0.53mm的弹性石英毛细管备用；(2)采用有机聚合物原位聚合方法在所述毛细管中形成色谱柱的筛板；(3)采用高压匀浆填充法将液相色谱填料装入所述筛板一侧的毛细管柱体中，得到固定相；(4)将所述毛细管外壁的聚酰亚胺涂层烧掉2～3mm，在所述筛板另一侧的毛细管上形成检测窗口。
所述筛板的制备方法如下(1)采用双官能团试剂对所述毛细管进行预处理；(2)将单体混合物与致孔剂按体积比2∶2～3混合；(3)再加入引发剂，超声混合，并通入氮气将所述反应混合溶液中的空气除去；(4)将步骤(3)中得到的反应混合溶液通入步骤(1)预处理后的毛细管形成2～3mm长的一段液柱，并使其位于毛细管中制备筛板的位置，在所述液柱的两端分别用空气充满，并用硅胶封住所述毛细管的两端，在40～80℃水浴中反应18～24小时，完成聚合反应，形成多孔的筛板。
采用双官能团试剂对所述毛细管进行预处理的步骤如下(1)将0.1M氢氧化钠、水、丙酮依次通过毛细管；(2)通入氮气，吹干毛细管；(3)将双官能团试剂充满经步骤(2)处理后的毛细管内，密封12小时；(4)清洗毛细管，氮气吹干。
所述双官能团试剂为30％的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷。
所述单体混合物为甲基丙烯酸丁酯和双甲基丙烯酸乙酯，其质量比为0.8～2∶1。
所述致孔剂为丙醇，丁二醇和水，其质量比为4～6∶3～5∶1。
所述引发剂为偶氮二异丁腈，其加入量为所述单体化合物质量的0.5～1％。
本发明由于采取以上设计，其具有以下优点1、本发明采用一根无须粘接的整根弹性石英毛细管制备液相色谱柱，既包含填充固定相的柱体，又包含筛板，引出管及检测窗口，特别是引出管与柱体是一体的，不需另外连接，避免了死区的形成，死体积减少，从而提高了柱效。2、本发明采用有机聚合物原位聚合方法制备的筛板，其不但孔径均一，而且可以在柱体的任何位置制备。3、本发明在制备筛板过程中由于引入双官能团试剂对毛细管内壁进行处理，因此可以保证筛板能够承受高压而不会从毛细管中滑脱。4、本发明采用常规的匀浆法制备固定相，与干法和电动装填相比，具有较高柱效，技术上也容易掌握。5、本发明的检测窗口是通过将弹性石英毛细管外壁的聚酰亚胺涂层烧掉2～3mm形成的，因此制备容易。本发明毛细管液相色谱柱的制备方法简单，特别适用于样品量少的生物、医药、环境等样品及用常规液相色谱难以分离的样品的分离分析。


图1是现有技术中胶粘接的毛细管液相色谱柱示意2是本发明的毛细管液相色谱柱结构示意3a～3d是制备筛板时将整体聚合混合物引入毛细管内的过程图4是7种样品在本发明毛细管液相色谱柱上分离的谱5是3种样品在本发明毛细管液相色谱柱上分离的谱图具体实施方式
如图2所示，本发明的毛细管液相色谱柱，包括柱体1，固定相(填料)2，筛板3，引出管4，检测窗口5，它们均存在于一整根无需粘接的弹性石英毛细管中。
本发明筛板制备方法包括以下步骤1、首先取一整根弹性石英毛细管，采用双官能团试剂γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷处理石英毛细管内壁。该双官能团试剂一端含烷氧基团，与毛细管的硅羟基反应；另一端含双键，在单体聚合时参与聚合反应。
2、将单体混合物甲基丙烯酸丁酯和双甲基丙烯酸乙酯(质量比0.8～2∶1)，及致孔剂正丙醇、丁二醇和水(质量比4～6∶3～5∶1)，按体积比2∶2～3在容器中混合。
3、加入偶氮二异丁腈作为引发剂，引发聚合反应，引发剂的加入量为上述单体混合物质量的0.5～1％。
4、超声混合，通入氮气将反应混合物的空气除去；5、将聚合混合物压入毛细管内(如图3a所示)，在毛细管内形成一小段液柱12(如图3b所示)，之后将空气压入毛细管中(如图3c所示)，带动液柱12向前移动直至液柱到达需要制备筛板的位置(如图3d所示)，迅速用硅橡胶封柱毛细管柱的两端，放在40～80℃水浴中加热18～24小时，完成聚合反应，形成多孔的筛板3(如图2所示)。
(6)用甲醇或乙腈等溶剂冲洗毛细管，除去残留的致孔剂等有机物。
本发明的固定相采用高压匀浆装柱法填装填料，具体方法是首先根据填料的性质不同，用适当的溶剂将填料制备成匀浆，超声混匀，装入匀浆罐中，用高压泵在一定压力(15～30MPa)下将匀浆液压入毛细管柱1中；填料装填到指定长度后，停泵，降压。
本发明检测窗口5的制备的采用以下方案在填好填料的筛板3另一侧毛细管外壁上，将毛细管表面的聚酰亚胺涂层烧掉2～3mm，并用乙醇擦洗，用作检测窗口5。
实施例一、本发明的毛细管液相色谱柱的制备1、毛细管柱的预处理取内径为0.32mm，长为60cm的弹性石英毛细管，利用真空泵的负压将0.1M氢氧化钠溶液通过毛细管2小时，用水冲洗毛细管，直到pH为7，将为毛细管体积50倍的丙酮通过毛细管，用氮气吹干2分钟，取30％的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液充满毛细管柱，两端用硅橡胶密封12小时，用丙酮冲洗，氮气吹干待用。
2、原位聚合筛板的制备将甲基丙烯酸丁酯、双甲基丙烯酸乙酯按质量比1.3∶1混合形成单体混合物，再将致孔剂混合物正丙醇、1，4-丁二醇和水以质量比5∶4∶1混合形成致孔剂混合物，将单体混合物与致孔剂混合物以体积比2∶3混合在一起，再加入质量为聚合反应单体质量1％的偶氮二异丁腈，超声混合均匀，在混合物中通入氮气2分钟以除去混合物中的氧气。如图3a～d所示，用一空管注射器7(内无液体)，插入带聚四氟乙烯螺纹盖8的棕色玻璃小瓶9，向小瓶9内压缩气体，使整体聚合混合物10压入毛细管11(用双官能团试剂处理过)，形成2mm聚合物液柱12。然后向上提毛细管11，使其脱离整体聚合混合物10溶液，再用空管注射器7向小瓶9内压缩空气，以将聚合物液柱12引入到毛细管11内需要制备筛板处，将毛细管11两端用硅橡胶密封，放在60℃水浴中加热20小时后取出，用甲醇冲洗毛细管柱。
3、固定相的填充取少量0.2g 5μmC18(十八烷基键合硅胶)，用1ml三氯甲烷配制成匀浆液，超声混合均匀，装入匀浆罐中，加压至20Mpa，将填料装入毛细管柱中，固定相2长20cm(如图2所示)；4、检测窗口的制备将筛板3另一侧的引出管4外壁的聚酰亚胺涂层烧掉2～3mm形成检测窗口5。
5、标样测试结果取硫脲、苯、甲苯、萘、联苯、菲、蒽的甲醇溶液200nl，流动相为甲醇/水(75/25)，流速为3μl/min，在254nm波长下，按照常规方法利用制备好的毛细管液相色谱柱分离，其结果如图4所示。图中各色谱峰的柱效依次为4.1，4.4，5.1，6.2，7.3，9.3万塔板每米。
实施例二制备筛板时，将单体混合物甲基丙烯酸丁酯、双甲基丙烯酸乙酯按质量比1.51∶1混合，其余的试剂用量同实施例一。筛板长度为3mm，内径为0.32mm，毛细管长50cm，固定相长15cm，填充5μmC18其它同实施例一。
标样测试结果取硫脲、甲苯和萘的甲醇溶液，在254nm波长下，利用制备好的毛细管高效液相色谱柱分离，其结果如图5所示。流动相为甲醇/水(50/50)，流速为4μl/min。图中各色谱峰的柱效依次为2.4，8.3，9.7万塔板每米。
权利要求
1.一种毛细管液相色谱柱，它包括一无需粘接的整根弹性石英毛细管，所述毛细管的中部设置有一由有机聚合物原位聚合形成的筛板，所述筛板一侧的柱体内填充有采用高压匀浆填充法填充的固定相，所述筛板另一侧的引出管上，设置有将所述毛细管表面聚酰亚胺涂层烧掉2～3mm形成的检测窗口。
2.如权利要求1所述的毛细管液相色谱柱，其特征在于所述毛细管内填充的固定相为正相液相色谱填料，或反相液相色谱填料，或离子交换填料，或体积排阻色谱填料中的一种。
3.如权利要求1或2所述的毛细管液相色谱柱，其特征在于所述毛细管的内径为0.05～0.53mm。
4.一种制备权利要求1或2或3所述的毛细管液相色谱柱的方法，它包括以下步骤(1)选择一内径为0.05～0.53mm的弹性石英毛细管备用；(2)采用有机聚合物原位聚合方法在所述毛细管中形成色谱柱的筛板；(3)采用高压匀浆填充法将液相色谱填料装入所述筛板一侧的毛细管柱体中，得到固定相；(4)将所述毛细管外壁的聚酰亚胺涂层烧掉2～3mm，在所述筛板另一侧的毛细管上形成检测窗口。
5.如权利要求4所述的毛细管液相色谱柱的制备方法，其特征在于所述筛板的制备方法如下(1)采用双官能团试剂对所述毛细管进行预处理；(2)将单体混合物与致孔剂按体积比2∶2～3混合；(3)再加入引发剂，超声混合，并通入氮气将所述反应混合溶液中的空气除去；(4)将步骤(3)中得到的反应混合溶液通入步骤(1)预处理后的毛细管形成2～3mm长的一段液柱，并使其位于毛细管中制备筛板的位置，在所述液柱的两端分别用空气充满，并用硅胶封住所述毛细管的两端，在40～80℃水浴中反应18～24小时，完成聚合反应，形成多孔的筛板。
6.如权利要求5所述的毛细管液相色谱柱的制备方法，其特征在于，采用双官能团试剂对所述毛细管进行预处理的步骤如下(1)将0.1M氢氧化钠、水、丙酮依次通过毛细管；(2)通入氮气，吹干毛细管；(3)将双官能团试剂充满经步骤(2)处理后的毛细管内，密封12小时；(4)清洗毛细管，氮气吹干。
7.如权利要求5或6所述的毛细管液相色谱柱的制备方法，其特征在于所述双官能团试剂为30％的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷。
8.如权利要求5或6所述的毛细管液相色谱柱的制备方法，其特征在于所述单体混合物为甲基丙烯酸丁酯和双甲基丙烯酸乙酯，其质量比为0.8～2∶1。
9.如权利要求5或6所述的毛细管液相色谱柱的制备方法，其特征在于所述致孔剂为丙醇，丁二醇和水，其质量比为4～6∶3～5∶1。
10.如权利要求5或6所述的毛细管液相色谱柱的制备方法，其特征在于所述引发剂为偶氮二异丁腈，其加入量为所述单体化合物质量的0.5～1％。
全文摘要
本发明涉及一种毛细管液相色谱柱及其制备方法，它包括一无需粘接的整根弹性石英毛细管，所述毛细管的中部设置有一由有机聚合物原位聚合形成的筛板，所述筛板一侧的柱体内填充有采用高压匀浆填充法填充的固定相，所述筛板另一侧的引出管上，设置有将所述毛细管表面聚酰亚胺涂层烧掉2～3mm形成的检测窗口。本发明的色谱柱是由整根毛细管制备而成，无须粘接，避免液流在死区内滞留造成柱效降低，本发明的制备方法简单，特别适用于样品量少的生物、医药、环境等样品及用常规液相色谱难以分离的样品的分离分析。
文档编号G01N30/60GK1588041SQ200410077960
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月21日 优先权日2004年9月21日
发明者丁明玉, 马继平, 徐燕, 陈令新 申请人:清华大学