专利名称：利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测汞离子的荧光检测方法
技术领域：
本发明属于生物传感领域，特别涉及一种利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测金属离 子的荧光检测的方法。
背景技术：
自然界广泛存在着一些过渡金属和重金属离子，其中一些对生命过程起着非常重 要的作用，而另外一些则对生物体具有极强的毒性。其中最具代表性的是汞离子。汞是一 种具有严重生理毒性的化学物质，但是汞和汞盐在工业中的应用非常广泛。由于其具有持 久性、易迁移性和高度的生物富集性，使汞成为目前最受关注的环境污染物之一。发展检测 和去除汞的方法和材料是发现和控制污染的重要手段，因此迫切需要寻找快速、简便、高灵 敏度的方法来检测汞离子。随之，对汞离子的检测材料和方法的开发研究成为一个热点。近年来科学家们对核酸的研究受到越来越多的关注，特别是关于生物遗传分子机 理以及寡核苷酸分子的识别、测序等方面的研究。目前针对于核酸的新型分析方法已经在 生命科学研究、环境检测、药物毒性筛选和疾病分子诊断等领域得到迅速发展。科学家发现 核酸中的胸腺嘧啶碱基能特异性的与汞离子形成胸腺嘧啶-汞离子-胸腺嘧啶连接的复合 物，这一特点为汞离子的检测提供了新的途径。因此，一些富含胸腺嘧啶的寡核苷酸探针相 继被开发出来，并取得了较好的效果。氧化石墨烯以其特殊的力学、量子学和电学性质，颇受物理和材料学界重视。由于 其具有优异的电学性能、导热性好、比表面积大等优点，也为生物分子的检测提供了新的思 路。目前随着单壁碳纳米管在生物传感中的成功应用，氧化石墨烯也逐渐成为传感领域青 睐的对象。由于氧化石墨烯的特殊性质，使得检测过程操作简单、反应快速，这样大大减少 了实验的步骤，同时可以显著的提高检测的灵敏度和特异性。

发明内容
技术问题本发明要解决的技术问题是针对现有的金属离子检测方法存在的不 足，提供一种利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测汞离子的荧光方法，其具有较高特异性和灵 敏度。技术方案本发明的一种利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测汞离子的荧光检测方法 包括以下步骤a.将染料标记的寡核苷酸荧光探针加入到缓冲溶液中，以480nm为激发波长，进 行荧光检测，记录该探针的荧光发射谱带；b.将氧化石墨烯加入到上述溶液中，氧化石墨烯作为固相载体吸附自由卷曲状态 的寡核苷酸探针，形成寡核苷酸/石墨烯复合物，此时染料的荧光被氧化石墨烯猝灭；c.在寡核苷酸/石墨烯复合物中加入含汞离子的待检测物质进行反应；d.通过汞离子与胸腺嘧啶碱基之间的特异性作用，形成由胸腺嘧啶_汞离子_胸 腺嘧啶连接构成的茎-环结构，从而使结合汞离子的寡核苷酸探针脱离氧化石墨烯的表面，染料的荧光信号得以恢复；根据荧光信号恢复的程度实现对汞离子的定性及定量检测。其中步骤a)所述的将染料标记的寡核苷酸荧光探针加入到缓冲溶液中，用荧光分光 光度计进行检测，所用染料为荧光素(FAM)；染料标记在寡核苷酸探针的5’端；寡核苷酸荧 光探针的碱基组成为5，-FAM-CATTTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTTTCA-3’ ；所用缓冲溶液为20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2 pH = 7. 4 ；所用的荧光检测方法为，将一定量 的探针溶液加入到1. 6mL缓冲溶液中即可进行荧光检测，激发波长为480nm，扫描范围为 490-650nm。步骤b)所述的寡核苷酸/石墨烯复合物的形成，是通过非共价键相互作用使寡核 苷酸探针吸附到氧化石墨烯表面。将氧化石墨烯加入到含有寡核苷酸探针的缓冲溶液中后，室温放置5分钟，然后 进行荧光检测，激发波长为480nm，扫描范围为490-650nm。步骤c)所述的加入汞离子进行反应，所用的汞离子母液为用0. 5% HNO3进行溶解 的Hg (NO3) 2溶液，也可以是Hg (CH3COO) 2、HgCl2、Hg (ClO4) 2等汞离子盐的溶液。加入汞离子溶液后荧光信号恢复所用的时间为室温，35 45分钟。所述的荧光信号用岛津RF-5301荧光分光光度计进行检测，激发波长为480nm，发 射波长扫描范围为490-650nm。所述的寡核苷酸荧光探针为一段富含胸腺嘧啶碱基的单链寡核苷酸，染料标记在 5’端，或3’端，该探针能与汞离子进行特异性结合形成由胸腺嘧啶_汞离子-胸腺嘧啶连 接构成的茎-环结构。所述的染料标记是荧光素或异硫氰酸荧光素。有益效果根据本发明所述的荧光检测方法，最低可检测的汞离子浓度为187pM。 当体系中含有 Pb2+、Cd2+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+ 和 Ba2+ 等其它非靶金属离 子等时，仍然可以实现对汞离子的高灵敏度检测。因此，本发明方法有望应用于对湖水、雨 水等受环境污染的实际水体系的检测。


图1为汞离子与胸腺嘧啶形成的胸腺嘧啶-汞离子-胸腺嘧啶结构图。图2为本发明优选的利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测汞离子的荧光检测方法的 工作原理图。图3为检测过程中不同反应体系荧光强度结果对比图。a为染料标记寡核苷酸探 针；b为寡核苷酸探针+汞离子；c为寡核苷酸探针+氧化石墨烯；d为寡核苷酸探针+汞离 子+氧化石墨烯。
具体实施例方式一种利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测汞离子的荧光检测方法，包括以下步骤1)将染料标记的寡核苷酸探针加入到缓冲溶液中，对溶液进行荧光检测，记录该 探针的荧光发射谱带；该探针为一段富含胸腺嘧啶碱基的单链核酸，一端标记有荧光素，该 探针能与汞离子进行特异性反应形成由胸腺嘧啶_汞离子_胸腺嘧啶连接的茎_环结构。
2)将氧化石墨烯作为固相载体加入到缓冲溶液中，由于氧化石墨烯表面具有能与 寡核苷酸进行非共价键结合作用的化学基团，可以使染料标记的汞离子特异性探针吸附到 氧化石墨烯的表面，从而形成寡核苷酸/氧化石墨烯复合物，此时染料与氧化石墨烯之间 发生高效的能量转移，染料的荧光被氧化石墨烯有效的猝灭。3)在寡核苷酸/氧化石墨烯复合物中加入汞离子进行反应，通过汞离子与寡核苷 酸探针的特异性作用，形成由胸腺嘧啶_汞离子_胸腺嘧啶连接构成的茎_环结构。4)汞离子介导的茎-环结构的形成使其从氧化石墨烯表面脱离，此时染料基团与 氧化石墨烯之间的距离较远，不能发生有效的能量转移，标记在探针末端的染料的荧光信 号得到恢复，可以检测到较强的荧光信号。根据本发明，步骤1)为将染料标记的汞离子特异性探针加入到缓冲溶液中，对 溶液进行荧光检测；其中，本发明所述的汞离子特异性探针是一段富含胸腺嘧啶碱基的 单链核酸，能与汞离子进行特异性相互作用形成由胸腺嘧啶_汞离子_胸腺嘧啶连接的 茎-环结构。这种探针已经被用于生物活性物质以及环境中汞离子的检测。根据本发明，步骤2)中所述的将氧化石墨烯作为固相载体加入到缓冲溶液中，染 料标记的汞离子特异性探针吸附到氧化石墨烯表面的温度可以是室温，优选的是25°C左 右ο根据本发明，步骤2)中所述的汞离子特异性探针吸附到氧化石墨烯表面的速度 非常快，观察到荧光猝灭的时间约为2分钟左右。根据本发明，步骤3)中所述的在寡核苷酸/氧化石墨烯复合物中加入汞离子进行 反应的温度可以是室温，优选的是25°C左右。通过汞离子与该探针的特异性相互作用，形成 由胸腺嘧啶_汞离子_胸腺嘧啶连接的茎_环结构。根据本发明，步骤4)中所述的汞离子与汞离子特异性探针的特异性相互作用形 成由胸腺嘧啶_汞离子_胸腺嘧啶连接的茎_环结构后，从氧化石墨烯表面脱离的时间约 为40分钟左右。下面结合附图，用汞离子的检测实施例来进一步说明本发明。但本发明并不仅限 于检测金属离子，也并不受实施例中其他条件的限制。荧光检测所用的仪器为荧光分光度计(RF-5301，日本)。荧光光谱测量条件氙 灯激发，激发和发射狭缝宽度为5. Onm和10. Onm,电压为950V，响应时间2S，激发波长为 480nm，发射波长扫描范围490 650nm ；用3mL石英比色皿进行测量，样品体积1. 60mL ；室本发明实施例中所用的氧化石墨烯是根据文献(W. S. Hummers, R. Ε. Offeman， J. Am. Chem. Soc. 1958，80，1339-1339)中 Hummers 的方法合成的。本发明实施例中所用的寡核苷酸探针购自上海生物工程技术有限公司，序列为 (5' -CATTTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTTTCA-3')；所用的缓冲溶液成分为Tris-HCl (pH 7. 4， IOOmM NaCl，5mM KCl and 5mM MgCl2)。实施例1制备寡核苷酸/氧化石墨烯复合物将0.6yL浓度为1.6μΜ的荧光素标记的汞离子特异性探针加入到ImL的 Tris-HCl缓冲溶液中，再加入0. 6mL的水进行荧光检测；然后再加入3 μ L氧化石墨烯溶 液，该探针会迅速吸附到氧化石墨烯表面，并将荧光素的信号猝灭。
实施例2汞离子的检测检测1 将IyL浓度为ImM的汞离子加入到寡核苷酸/氧化石墨烯复合物中，汞 离子与寡核苷酸探针中的胸腺嘧啶碱基进行特异性的结合形成胸腺嘧啶-汞离子-胸腺嘧 啶连接的茎_环结构，从氧化石墨烯表面脱离，进行荧光检测(激发波长480nm，发射波长 490 650nm)，可以观察到荧光的恢复现象。同时，做如下试验作为对比。检测2 用等体积的水代替氧化石墨烯进行试验，作为空白对照，其它条件与检测 1中相同。检测3 用等体积的相同浓度的其他金属离子进行试验，作为阴性对照，其他条件 与检测1中相同。结果空白对照(即检测2)和寡核苷酸探针的荧光信号强度相比相差不大。可见汞离 子本身对实验的影响不大。其他金属离子(即检测3)的荧光信号强度远小于汞离子存在时的荧光强度。可 见本发明对汞离子的检测具有高度的特异性。
权利要求
一种利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测汞离子的荧光检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤a.将染料标记的寡核苷酸荧光探针加入到缓冲溶液中，以480nm为激发波长，进行荧光检测，记录该探针的荧光发射谱带；b.将氧化石墨烯加入到上述溶液中，氧化石墨烯作为固相载体吸附自由卷曲状态的寡核苷酸探针，形成寡核苷酸/石墨烯复合物，此时染料的荧光被氧化石墨烯猝灭；c.在寡核苷酸/石墨烯复合物中加入含汞离子的待检测物质进行反应；d.通过汞离子与胸腺嘧啶碱基之间的特异性作用，形成由胸腺嘧啶-汞离子-胸腺嘧啶连接构成的茎-环结构，从而使结合汞离子的寡核苷酸探针脱离氧化石墨烯的表面，染料的荧光信号得以恢复；根据荧光信号恢复的程度实现对汞离子的定性及定量检测。
2.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测汞离子的荧光检测方法，其 特征是步骤a)所述的将染料标记的寡核苷酸荧光探针加入到缓冲溶液中，用荧光分光光 度计进行检测，所用染料为荧光素(FAM)；染料标记在寡核苷酸探针的5’端；寡核苷酸荧 光探针的碱基组成为5，-FAM-CATTTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTTTCA-3’ ；所用缓冲溶液为20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2 pH = 7. 4 ；所用的荧光检测方法为，将一定量 的探针溶液加入到1. 6mL缓冲溶液中即可进行荧光检测，激发波长为480nm，扫描范围为 490-650nm。
3.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测汞离子的荧光检测方法，其 特征是步骤b)所述的寡核苷酸/石墨烯复合物的形成，是通过非共价键相互作用使寡核苷 酸探针吸附到氧化石墨烯表面。
4.根据权利要求3所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测汞离子的荧光检测方法，其 特征是将氧化石墨烯加入到含有寡核苷酸探针的缓冲溶液中后，室温放置5分钟，然后进 行荧光检测，激发波长为480nm，扫描范围为490-650nm。
5.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测汞离子的荧光检测方法，其 特征是步骤c)所述的加入汞离子进行反应，所用的汞离子母液为用0. 5% HNO3进行溶解的 Hg (NO3) 2 溶液，或是 Hg (CH3COO) 2、HgCl2, Hg (ClO4) 2 等汞离子盐的溶液。
6.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测汞离子的荧光检测方法，其 特征是加入汞离子溶液后荧光信号恢复所用的时间为室温，35 45分钟。
7.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测汞离子的荧光检测方法，其 特征是所述的荧光信号用岛津RF-5301荧光分光光度计进行检测，激发波长为480nm，发射 波长扫描范围为490-650nm。
8.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测汞离子的荧光检测方法，其 特征是所述的寡核苷酸荧光探针为一段富含胸腺嘧啶碱基的单链寡核苷酸，染料标记在5’ 端，或3’端，该探针能与汞离子进行特异性结合形成由胸腺嘧啶_汞离子_胸腺嘧啶连接 构成的茎-环结构。
9.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测汞离子的荧光检测方法，其 特征是所述的染料标记是荧光素或异硫氰酸荧光素。
全文摘要
本发明公开了一种利用富含胸腺嘧啶的寡核苷酸探针和氧化石墨烯来进行汞离子检测的荧光检测方法。该方法首先将氧化石墨烯作为固相载体用来吸附修饰有荧光素的寡核苷酸探针(染料标记的汞离子特异性探针)，形成寡核苷酸/氧化石墨烯复合物，使荧光猝灭。当溶液中存在汞离子时，汞离子会与寡核苷酸探针特异性结合形茎-环结构，使寡核苷酸探针从氧化石墨烯表面脱离并且游离在溶液中从而使荧光得以恢复，通过检测溶液中荧光强度的变化来达到检测汞离子的目的。本发明方法简便、快速、具有较高的灵敏度和选择性，在汞离子检测方面具有重要的意义。
文档编号G01N21/64GK101887020SQ20101022306
公开日2010年11月17日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日
发明者刘兴奋, 苗丽坤, 范曲立, 黄维 申请人:南京邮电大学