专利名称：细胞的识别和分选方法及其装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞的识别和分选方法，尤其是涉及仅使用透射光的信息，或者使用 透射光的信息和侧方散射光的信息来进行的细胞的识别和分选方法及其装置，其中，上述 透射光的信息主要反映包括细胞尺寸、形状等的细胞形态上的特征和包括细胞核、细胞质 等的细胞内部结构的特征上的至少一方，上述侧方散射光的信息反映细胞内部结构的特 征。
背景技术：
正在使用通过将细胞悬浮液高速流动、照射激光光进行测定，从而对细胞1个1个 地解析的被称为流式细胞术的方法。已知利用流式细胞仪时，通过细胞1个1个的相对大 小或形状、内部结构的不同，进而进行荧光标记，来测定荧光强度、荧光的种类，可以在短时 间内进行细胞的鉴定、解析构成细胞群的各种细胞的存在比率。S卩，将细胞悬浮液流入到高流速的鞘液(鞘流)的中心，将其通入圆锥状的流路从 而被挤细，按照细胞1个1个地完全在同一线上流动的方式进行设定。当如此向在同一线上 流动的细胞照射激光时，则由通过的细胞发出散射光和荧光。另外，细胞被照射激光的时间 为数微秒的范围内，是完全不会有损害的。对从细胞发出的散射光而言，检测射向与激光束 相同方向的前方散射光(FSCforward Scatter)和射向与激光束呈90度方向的侧方散射 光(SSC:Side Scatter)。前方散射光(FSC)反映细胞的大小而进行光强度的变化，侧方散 射光(SSC)反映细胞的内部结构的复杂性而进行光强度的变化。荧光(FL=Fluorescence) 通过利用光学滤光器对向与侧方散射光(SSC)相同的90度方向放射的光进行分光、抽取， 来检测各自的波长成分。例如，使用激光作为激发光，向细胞照射光，检测荧光色素。荧光色素吸收某波长， 将其高能量光(短波长)转换成更低能量光(长波长)。各荧光色素分别具有各自特有的 激发波长分布和发光波长分布。即，吸收一定范围的光波长，发出一定范围的波长的放射光 (荧光)。利用检测器测定所得荧光的强度(荧光强度Fluorescent Intensity)，对所得 的值进行数字转换，与其他细胞的荧光强度一起表示成散点图(sitegram)、直方图。例如， 散点图是将从1个细胞中获得的散射光、荧光的信息表示到二维坐标上，直方图例如将横 轴表示为光强度、将纵轴表示为细胞数。如上所述，以往利用流式细胞仪(FCM =Flow Cytometer)，如图8所示，取得散射光 测量值进行解析，识别细胞的尺寸以及内部结构的不同。散射光在前方和侧方分别取得。细胞周期是经细胞分裂而生成的子细胞再成为母细胞而进行细胞分裂，直到产生 新的子细胞的过程。细胞周期可以分为Gl期、S期、G2期及M期，尤其是在G2期及M期中， 由于染色体数量增多，因此具有细胞核或细胞尺寸增大的特征。另外已知，包括干细胞的一部分特殊细胞中，细胞中细胞核所占的尺寸比例比一 般细胞高。专利文献1 日本专利第四73387号公报(特开平6-323987号公报)
非专利文献1 株式会社秀润社发行中内启光监修“细胞工学別冊実験7 α卜 ^ - ^ 丨J 一文新版流式细胞术自由自在-7 力，一解析力…” 口一 一歹^ > 夂i ^ _(细胞技术附刊实验规程系列新版流式细胞术自由自在-自多色分析到克隆分 类-)”P11
发明内容
以往的细胞解析装置例如流式细胞仪，通过前方散射光信息来解析细胞尺寸，但 存在其解析精度低、不能明确地识别细胞尺寸的问题。因此，在细胞周期的解析中，必需对 细胞核的DNA进行染色。但是，如对细胞核的DNA进行染色时，则存在因染色而杀灭细胞的 问题。即，存在无法在细胞周期的各个期以无染色的方法将细胞高精度地分选、无法对处于 细胞周期的特定期中的活细胞进行分选的问题。另一方面，在再生医疗、药品的开发中必要的干细胞/癌干细胞的分选是利用了 将荧光化学物质排出到其细胞外的这一干细胞/癌干细胞具有的特征，对该细胞进行分 选。但是，由于出现因荧光化学物质造成的对干细胞/癌干细胞的损害，因此对干细胞/癌 干细胞的分化/诱导造成不良影响。再者，以往的细胞识别/解析是通过细胞表面的抗原-抗体反应来进行的。但是存 在如下的问题即使在细胞表面的抗原-抗体反应中，抗原-抗体反应也对细胞造成损害， 而且如果没有抗体就不能进行细胞的识别。因此，本发明的目的在于，提供一种不对细胞核进行染色、不杀灭细胞、而且不对 细胞造成损害的可以对活细胞的细胞周期、包括干细胞的特殊细胞进行识别、分选的细胞 的识别和分选方法及其装置。发明人为了解决上述以往的问题，反复进行了认真的研究。结果确定了，在向流动 池(flow cell)内照射SM(单模)光，通过对在任意区域接受到包含照射光的通过细胞的 光的信号进行解析，或者对在任意区域接受到包含照射光的通过细胞的光的信号与侧方散 射光的受光信号进行一并解析，可以不进行细胞的核染色就能对活细胞的细胞周期或异倍 体核细胞/多倍体核细胞进行识别和分选。这种情况下，将通过流路的SM光、通过细胞的光、被细胞反射/散射/衍射的光全 部一并称作透射光。在对透射光进行受光的任意区域，始终在对SM光进行受光，但细胞测 定时，SM光受光功率会发生变动。将其变动图形(=信号)的峰、幅度、面积等称为透射光 fn息ο另外，认为因细胞流动的位置不同会出现幅度值的偏差(=流速不均)，但通过对 具有几乎相同流速数据的透射光信息进行解析，可以使精度提高。特别是确认了，可以对细胞周期中细胞的染色体稳定的Gl期和染色体的数量增 大、细胞核或细胞尺寸增大的M期进行识别、分选。本发明的细胞的识别和分选方法的第1方式，为一种细胞的识别和分选方法，其 特征在于，利用向细胞照射光而得到的反映包括细胞尺寸、形状等的细胞形态上的特征以 及包括细胞核、细胞质等的细胞的内部结构上的特征中的至少一方的透射光的信息，对某 特定的细胞集团或该特定的细胞集团的一部分活细胞进行识别和分选。本发明的细胞的识别和分选方法的第2方式，为一种细胞的识别和分选方法，其特征在于，使用上述透射光的信息以及反映细胞内部结构特征的侧方散射光的信息，来对 上述活细胞进行识别和分选。本发明的细胞的识别和分选方法的第3方式，为一种细胞识别和分选方法，其特 征在于，上述特定的细胞集团的一部分活细胞是细胞周期(CellCyCle)Gl期的细胞的一部 分。本发明的细胞的识别和分选方法的第4方式，为一种细胞的识别和分选方法，其 特征在于，上述细胞周期Gl期的一部分活细胞，是与在由横轴所示的透射光信息所形成的 细胞的直方图、或者由横轴所示的透射光信息及纵轴所示的侧方散射光信息所形成的细胞 的解析分布图中S期的最小细胞相比更小的细胞，S卩，是上述解析分布图中的曲线的所谓 左侧下摆部分的细胞。本发明的细胞的识别和分选方法的第5方式，是一种细胞的识别和分选方法，其 特征在于，上述特定的细胞集团的一部分活细胞是细胞周期M期的细胞的一部分。本发明的细胞的识别和分选方法的第6方式，为一种细胞的识别和分选方法，其 特征在于，上述细胞周期M期的一部分活细胞，是在由横轴所示透射光信息所形成的细胞 的直方图或者由横轴所示透射光信息及纵轴所示侧方散射光信息所形成的细胞的解析分 布图中S期的最大细胞相比更大的细胞，S卩，是上述解析分布图中的曲线的所谓右侧下摆 部分的细胞。本发明的细胞的识别和分选方法的第7方式，是一种细胞的识别和分选方法，其 特征在于，与上述特定的细胞集团的一部分活细胞有无细胞表面抗体/抗原反应、包括细 胞内的荧光蛋白表达的荧光处理无关，在不进行核染色的荧光标记处理的情况下，对上述 特定的细胞集团或该细胞集团的一部分活细胞进行分选。本发明的细胞的识别和分选方法的第8方式，为一种细胞的识别和分选方法，其 为至少使用透射光信息识别包括干细胞的一部分特殊细胞，对包括干细胞的特殊细胞即上 述解析分布图中的曲线的所谓右侧下摆部分的细胞进行分选，所述包括干细胞的特殊细胞 与在由横轴所示透射光信息所形成的细胞的直方图或者由横轴所示透射光信息及纵轴所 示侧方散射光信息或透射光的幅度信息、荧光信息等所形成的细胞的解析分布图中S期的 最大细胞相比更大。本发明的细胞的识别和分选方法的第9方式，为一种细胞的识别和分选方法，其 特征在于，从上述特定的细胞集团的一部分活细胞内将一个细胞分选至一个孔中。本发明的细胞的识别和分选方法的第10方式，为一种细胞的识别和分选方法，其 将在某特定的细胞集团的透射光信息中偏离最大值以内区域的细胞作为异倍体核细胞 或多倍体核细胞进行识别、分选。本发明的细胞的识别和分选方法的第11方式，为一种细胞的识别和分选方法，当 从上述区域的平均值(mean)减去其4ο得到的值大于上述某特定的细胞集团的透射光 信息的平均值(mean)时，作为异倍体核细胞或多倍体核细胞对细胞进行识别、分选。本发明的细胞的识别和分选方法的第12方式，为一种细胞的识别和分选方法，当 从上述区域的平均值(mean)减去其4 ο得到的值大于上述某特定的细胞集团的透射 光信息的平均值(mean)、且上述区域的细胞的标准偏差(ο)除以平均值(mean)的值 (CV)为8%以上时，作为异倍体核细胞或多倍体核细胞对细胞进行识别和分选。
本发明的细胞的识别和分选方法的第13方式，为一种细胞的识别和分选方法，上 述某特定的细胞集团，是与一部分活细胞是否有细胞表面抗体-抗原反应、包括细胞内的 荧光蛋白表达的荧光处理无关，在不进行核染色的荧光标记处理的情况下进行了分选的血 液细胞。通过对原本不应存在于血液中的多倍体核细胞、异倍体核细胞进行识别，可以应用 于癌症诊断。例如，癌细胞多为具有很多细胞核的多倍体核或异倍体核。通过测定血液中的多 倍体核、异倍体核细胞的数量，还可作为预测癌症的预后或治疗效果的方法应用。本发明的细胞分选装置的第1方式是一种细胞分选装置，其具备光照射部，其向 细胞照射光；细胞测量部，其能够获得反映包括细胞尺寸、形状等的细胞形态上的特征和包 括细胞核、细胞质等的细胞内部结构上的特征中的至少一方的透射光信息与反映细胞内部 结构特征的侧方散射光的信息；解析部，其对所测量的透射光和侧方散射光的信息进行解 析；以及细胞分选部，其对通过所述解析部获得的细胞的某特定的集团或该特定的细胞集 团的一部分活细胞进行分选。本发明的细胞分选装置的第2方式是一种细胞分选装置，其中，所述细胞的分选 部具有下述功能，即，将由横轴所示的透射光信息所形成的细胞直方图或由横轴所示的透 射光信息及纵轴所示的侧方散射光信息所形成的细胞解析分布图中的规定区域的1个或 多个活细胞，分选至规定孔内。根据本发明，通过向流动池内照射SM(单模)光、对在任意区域接受到包含照射光 的通过细胞的光的信号进行解析，或者通过向流动池内照射SM(单模)光、对在任意区域接 受到包含照射光的通过细胞的光的信号和侧方散射光的受光信号一并进行解析，可以不进 行细胞的核染色就能对活细胞的细胞周期进行识别和分选。可以不对细胞进行染色，以存活的状态仅将细胞周期Gl期或M期的细胞或者多倍 体核细胞或异倍体核细胞与其他分离进行分选，由此能够有助于细胞的研究，特别是有助 于细胞的分化/诱导的研究。另外，还可对应于所分选的活细胞的经历，再次进行分选，可 有助于细胞的实时研究。而且，由于可以不使用荧光化学物质，就将干细胞/癌干细胞取 出，因此能够壁面对细胞的多余伤害，可有助于细胞的分化/诱导。


图1是检测本发明的透射光信息并用横轴表示透射光信息的峰而制成的直方图。图2示出检测包括HeLa细胞的细胞周期的所有时期的透射光信息并用横轴表示 透射光信息的峰后的直方图。图3是将透射光信息和侧方散射光信息以散点化的状态而示出的图像图。图4为本发明的细胞分选装置的测量原理图。图5为表示分选部的构成的图。图6为表示以往的前方散射光信息的直方图。横轴表示前方散射光信息的峰。图7为表示利用细胞的核染色(PI)所进行的细胞周期解析结果的图。图8为表示利用以往的流式细胞仪进行散射光的测量/解析的图。图9为表示作为透射光信息的参数的峰值、幅度值及面积值的示意图。图10为通过透射光信息的峰值和处于一定流速范围的透射光信息的幅度值而确定的包括干细胞的特殊细胞的确定方法的示意图。图11为表示抽取基本相同的流速数据后进行解析的结果。图12为表示横轴为透射光信息的透射光峰、纵轴为侧方散射光信息的透射光峰 的散点图。图13为表示图12所示的区域Rl中横轴表示细胞核的荧光强度的直方图。图14为表示图12所示的区域Rl内的数据中，横轴表示透射光信息的透射光峰的
直方图。图15为表示在用区域R3进行了设门的区域内，横轴表示细胞核的荧光强度的直 方图。图16示出测定多种细胞混存的母集团的直方图。横轴表示透射光信息的峰。符号说明1-流动池，2-样品流，3-鞘流，4-光连接器，5-激光器6_细胞，7_透 射光受光装置，8-光纤，9-侧方散射光受光装置，10-荧光装置。
具体实施例方式一边参考附图，一边对本发明的细胞的分选方法及其装置进行说明。本发明的细胞的识别和分选方法的一个方式是以下的细胞的分选方法，其中，使 用对细胞照射光而得到的反映包括细胞尺寸、形状等的细胞形态上的特征的透射光的信 息，或者合并使用对细胞照射光而得到的反映包括细胞尺寸、形状等的细胞形态上的特征 的透射光的信息以及反映细胞的内部结构特征的侧方散射光的信息，对某特定的细胞集团 或该特定的细胞集团的一部分活细胞进行识别和分选。上述的特定的细胞集团的一部分活 细胞为例如细胞周期(细胞周期)Gl期或M期的细胞的一部分。有丝分裂的时期称为M期，大部分的细胞约1小时左右结束，不过是整个周期的一 小部分。M期与下次M期之间的期间称为间期(interphase)，细胞在间期合成必要的物质、 生长，大部分的蛋白质、其他物质在间期一直持续合成。间期还可分为Gl期、S期、G2期。S 期是核的DNA发生复制的时期。将M期结束至S期开始的期间作为Gl期、即最初的间期。 分裂旺盛的细胞在Gl期期间将DNA合成所必需的酶活化。通过该活化，细胞通常可进入S 期。未持续分裂的细胞不进入S期，而是停留在脱离周期之外被称作GO期的与Gl期相类 似的状态。完成S期后，细胞进入作为第2个间歇期的G2期。此时，分裂准备的最终阶段 开始，蛋白质的合成增加。M期还可分为前期、中期、后期和终期。前期中，发生染色体的凝缩、此时在显微镜 下可观察到染色体。进入中期时，核膜消失、染色体排列在赤道面上。纺锤体也在此时期完 成。在后期，在着丝点(着丝粒Centromere)附近结合的姊妹染色体以被纺锤体牵引的形 态分离、开始向极向移动。在终期，凝集的染色体被打开、再次形成核膜。从该时期开始，细 胞质分裂开始、细胞分裂结束。本发明的细胞的识别和分选方法中，如上所述S期是基因的扩增/修复期，由于不 稳定，因此进行染色体稳定的Gl期、M期的识别/分选。透射光作为其信息，反映包含细胞尺寸、形状等的细胞形态上的特征。侧方散射 光作为信息，反映细胞的内部结构的特征。通过透射光或组合这2个信息，识别细胞周期 (cell cycle)的特定时期。以往，如图7所示，通过细胞的核染色(PI)进行细胞周期的解析。结果如图7所示，明确识别了 Gl期、S期、M期。但是，由于细胞的核染色会，细胞会受 到损害(某种的核染色不会杀灭细胞，但会对细胞造成损害)、杀灭，无法用于活细胞。图4为本发明的细胞识别和分选装置的测量原理图。在流动池1中，形成样品(细 胞)浮游流2和鞘液流3的层流。鞘液和样品液均通过压缩机等的压力被挤出。此时，当 处于样品液侧的压力稍低于鞘液侧的压力的状态时，样品液在形成与鞘液的层流阶段会发 生流体力学缩窄，鞘流所包裹的样品流的流径变得非常细，细胞排成1列。如此通过调整压 力差，1个1个的细胞变成1列，形成1个1个按顺序在流动池中流动的状态。按照从两侧夹持流动池1的方式设置1对规定的光连接器(例如多芯连接器)4， 将来自激光5的光照射于通过流动池1内的细胞6，按照透过细胞6的透射光被透射光受 光装置7受光的方式，配置激光器5和光纤8进行固定。即，来自激光器5的在SM(单模) 光纤8中传播的SM光，照射于流动池1。按照将该SM光横截断的方式操作，细胞6如上所 述1个1个地按顺序流过。光纤8的一端与激光器5相连，在另一端侧配置有透射光受光 装置7。作为透射光信息的参数，获取透射光信息的峰值、透射光信息的幅度值及透射光信 息的面积值。进而，当细胞6在流动池1内有激光通过时，细胞6使激光散射(经荧光标记时， 由荧光色素发出荧光)。设置对来自于细胞6的散射光中的向与激光束成90度方向散射的 侧方散射光(SSC)进行检测的侧方散射光受光装置9。还设置使用光学滤光器在与侧方散 射光(SSC)相同的90度方向上进行分光、对各个波长成分进行检测的荧光装置10。通过了流动池的样品悬浮液和鞘液，形成液滴，被分选到规定的孔中。需要说明的 是，图中鞘液和样品液由下朝上流动，但也可以由上朝下流动。在通常的分选中，由上朝下 地流动。当需要多个激发波长时或者需要特殊波长时，可以搭载多个激光器，根据目的进行 替换。进而还具备测定样品液的流动速度的测定部。受光装置受到光照时，产生电流，该电流由于脉冲处理，因此被转换成电压脉冲。 电压脉冲被A/D转换(电压脉冲为模拟值、通常以1024分割的比例(尺度)对其进行计 算、置换成0 1023的任一整数值，将该过程称作模拟/数字转换(A/D转换))、使用各参 数的数值数据，通过计算机(解析软件)制作各种直方图。图1为检测出本发明的透射光 信息而制作的直方图。对于上述的透射光信息，将其示意图示于图9。图9表示作为透射光信息参数的峰 值、幅度值及面积值。在透射光受光区域上始终对SM(单模)光进行受光，具有某一定的受 光水平(功率)。当细胞通过时，其受光水平(功率)如图示的二次曲线那样变动。当为相 同的幅度值时，峰值大的细胞，其透射光的透射率小，例如表示细胞核大(细胞核的透射率 小于细胞质)。图1中横轴表示透射光信息的峰，纵轴表示频率。越向横轴右侧移动，则样品(细 胞)的尺寸越大。越向横轴左侧移动，则样品(细胞)的尺寸越小。首先，当如此对细胞照射激光、检测其透射光进行解析时，明示了细胞分裂的各周 期的细胞尺寸。实际上，细胞尺寸从处于细胞分裂周期的较稳定状态的Gl期经过过渡期S 期到染色体数量增加、细胞核或细胞尺寸增大的M期会发生变化。图1明确地表示上述细 胞尺寸的变化。即，各期的大小关系如下所述，与实体相一致。Gl < S < G2/M
接着，以图1中央所示的细胞分裂周期的S期曲线为基准，观察处于较为稳定的状 态的Gl期的曲线时，可以确认在Gl期有从S期左端部向左侧进一步扩展的曲线的左侧下 摆部分。因而，对在Gl期左侧露出的曲线的左侧下摆部分(全体的约3%)进行分选时，可 以确实可靠地仅将Gl期的活细胞与其它分离，进行分选。同样地，以细胞分裂周期的S期曲线为基准，观察染色体数量增多、细胞核或细胞 的尺寸增大的M期曲线时，可以确认有从M期右端部向右侧进一步扩展的曲线的右侧下摆 部分。因而，对在M期右侧露出的右侧下摆部分(全体的约进行分选时，可以确实可 靠地仅将M期的活细胞与其它分离，进行分选。需要说明的是，本发明中由于对活细胞进行分选，因此所分选的细胞继续反复进 行细胞分裂，随着时间的经过显示具有图1所示特征的G1、S、M的各期。进而，在能够识别 的各期的全部区域中，可以进行分选(例如并不仅能对Gl期的左侧下摆部分进行分选，还 可以在全部区域内进行分选)。图6表示以往的前方散射光信息的直方图。横轴表示前方散射光信息的前方散射 光峰。如图6所示，根据以往的前方散乱信息，G1、S、M各期的尺寸的相关关系不清楚。因 而无法进行活细胞的各期的分选。图2表示包含HeLa细胞的细胞周期的所有时期的透射光信息的直方图。横轴表示 透射光信息的峰。图2所示的用虚线表示的边界线与图1所示的边界线相同。如此，即便 在包含细胞的细胞周期的所有时期的透射光信息中，曲线的左侧下摆部分表示Gl期，曲线 的右侧下摆部分表示M期。因而，当对在Gl期左侧露出的左侧下摆部分(全体的约1%) 进行分选时，可以确实可靠地仅将Gl期的活细胞与其它分离，进行分选，当对在M期右侧露 出的右侧下摆部分(全体的约7%)进行分选时，可以确实可靠地仅将M期的活细胞与其它 分离，进行分选。图3为表示将透射光信息和侧方散射光信息散点化的状态的图像图。纵轴表示侧 方散射光信息、横轴表示透射光信息。越向横轴右侧移动，则形状变得越大。图3(a)表示 Gl期的信息，图3(b)表示S期的信息，图3 (c)表示M期的信息。如图所示，G1、S、M各期 显示逐渐增大的状态。图3(d)表示重叠了 Gl期、S期、M期的信息。图3(d)所示的虚线的 边界线对应于S期的大小。如图所示，在将透射光信息和侧方散射光信息散点化的状态下， 左侧下摆部分表示Gl期、右侧下摆部分表示M期。进而，不进行包括细胞的抗原和抗体反应的相对于细胞的荧光色素的染色处理， 用透射光信息识别包括干细胞的一部分特殊细胞。由于包括干细胞的一部分特殊细胞的内 部的大部分为核，因此透射率低于通常的细胞，因而透射光的信号增强(变大)(衰减信号 的原因)。与上述同样，当利用透射光信息制作直方图时，包括干细胞的一部分特殊细胞的 区域相当于曲线的右侧下摆部分的区域。对于包括干细胞的一部分特殊细胞而言，也可同 样地通过透射光与散射光等其它光信息的组合来制作解析分布图。对被上述右侧下摆部分 区域确定了的干细胞进行分选。此时，特殊细胞是指具有自身复制能力或多分化能力的干 细胞或者癌干细胞等细胞和成为多倍体核的癌的细胞。癌细胞多是具有很多细胞核的多倍 体核，结果具有核占细胞中的比例增大、光的透射率降低的性质，与上述干细胞相同。而且，本发明还可用于多倍体核细胞、异倍体核细胞的识别和分选。即，根据透射 光信息进行多倍体核细胞、异倍体核细胞的识别和分选。在染色体的分裂后进行的细胞质分裂中，细胞质分裂失败的细胞具有通常的2倍数量的核(或染色体数为2倍的1个核)。 其中，出现了免于细胞死亡但具有染色体数量异常的结果等各种异常的细胞。将它们称作 多倍体核细胞、异倍体核细胞。对将核染色了的HeLa细胞进行测定并对其结果进行分析 时，判定偏离G2/M区域中心为3σ (σ为标准偏差)以上的区域为多倍体核细胞/异倍体 核细胞区域。根据其结果可知，多倍体核细胞/异倍体核细胞区域是横轴表示透射光信息 的峰的图14所示直方图中表示的上位的细胞区域、即偏离细胞尺寸大者量为的区 域(图14的右端部分、R3区域)。本发明中，当使用透射光信息对透射光信息的峰的直方 图中表示的上位的区域的细胞进行分选时，能够以高精度将多倍体核细胞、异倍体核细 胞与其它分离进行分选。进而，当从透射光信息的峰的直方图所示的上述区域的平均值(mean)减去其 4σ得到的值大于上述HeLa细胞的透射光信息的峰平均值(mean)时，上述的的细胞为 多倍体核细胞或异倍体核细胞。其原因在于，上述直方图的全体平均值(mean)偏离上位
的区域的平均值(mean)为4σ。进而，当从透射光信息的峰的直方图所示的上述1 %的 区域的平均值(mean)减去其4 σ得到的值大于上述直方图的全体平均值(mean)、l%的细 胞的标准偏差(σ)除以平均值(mean)得到的值(CV)为8%以上时，上述的细胞为多 倍体核细胞或异倍体核细胞。即，通过使细胞的标准偏差(σ)除以平均值(mean)的值 (CV)为规定值以上，提高精度。如上所述，可以利用透射光信息，在不对细胞进行染色、以存活的状态直接将多倍 体核细胞或异倍体核细胞与其他分离进行分选，由此可有助于细胞的研究、特别是细胞的 分化/诱导的研究。由此，通过识别原本不应该存在于血液中的多倍体核细胞、异倍体核细 胞，可应用于癌症诊断。例如，癌细胞多是具有很多细胞核的多倍体核或异倍体核。通过测定血液中的多 倍体核、异倍体核细胞的数量，还可作为预测癌症的预后、治疗效果的方法进行应用。图5为表示分选部的构成的图。分选部进行识别/废弃和分选。对各个状态进行 说明。即，对于至检测出目标细胞之前的状态和检测了目标细胞的状态而言，操作不同。(1)识别/废弃的状态如图5所示，样品液在箭头方向上连续流动，在识别部中对在流动池中流动的细 胞照射激光，根据透射光的信息或透射光的信息和侧方散射光的信息，进行是否是目标细 胞的识别。在检测出目标细胞之前，将分注喷嘴插入到废液槽中，将非目标细胞废弃到废液 槽中。(2)分选状态根据透射光的信息或透射光的信息以及侧方散射光的信息，在检测出目标细胞 时，计算至目标细胞到达分注喷嘴前端的时间。在所计算的到达时间时，以细胞到达喷嘴 前端的时机撤掉废液槽，然后将台子(培养板)上升。如此，将分注喷嘴的前端插入到各孔 (well)中，将目标细胞分注。需要说明的是，至细胞到达喷嘴前端的时间的计算方法如下所述。以亚微粒的精度在样品行进方向上设置多个光信号的检测部(光纤)(测定部的 间隔已知)。由通过各检测部的间隔和各测定部的时间差计算流速。由于检测部至喷嘴前 端的距离是已知的，由此计算目标细胞至喷嘴前端的到达时间。
通过实施例说明本发明的细胞分选方法。实施例1使用可按照图4所示的测量原理进行细胞分选的细胞分选装置，向通过流动池的 HeLa细胞照射激光，检测透过细胞的光、透过细胞的光和被细胞向侧方散射的光，制作透射 光信息的峰所形成的直方图。图1表示利用透射光信息所形成的直方图。如图1所示，HeLa 细胞的Gl期、S期、M期分别由图la、图lb、图Ic测量、解析。图1横轴所示的透射光信息的峰反映细胞形态上的信息。横轴越向右移动，则尺 寸变得越大；越向左移动，则尺寸变得越小。纵向以虚线表示的边界线大致对应于S期的细 胞尺寸。如图1所示，图Ia的Gl期是下摆部分从图Ib的S期向左侧扩展。因此，就图Ia 的Gl期而言，由图Ib的S期可知，图Ia的左侧下摆部分(全体的3% )确实为HeLa细胞 的Gl期，确定为细胞周期的Gl期。图2表示HeLa细胞(包含细胞周期的所有时期)的透射光信息的峰所形成的直 方图。对图1和图2所示的横轴的左侧下摆部分(全体的3%、1%)设门(gating)，将1 个 多个细胞分选至规定的孔中。结果，可以仅将处于细胞较稳定状态的Gl期分选。由此， 可以仅将活细胞的Gl期细胞分选，可大大有助于细胞的分化和培养的研究。实施例2同样地使用可按照图4所示的测量原理进行细胞分选的细胞分选装置，向通过流 动池的HeLa细胞照射激光，检测透过细胞的光和被细胞向侧方散射的光，制作透射光和侧 方散射光信息所形成的解析分布图。图3表示其图像的图。如图3所示，HeLa细胞的Gl 期、S期、M期分别由图3a、图北、图3c测量、解析。图3横轴所示的透射光信息反映细胞形态上的信息，纵轴所示的侧方散射光信息 反映细胞内部结构上的信息。横轴越向右移动，则形态变得越大；越向左移动，则形态变得 越小。图3(d)中纵向以虚线表示的边界线大致对应于S期的细胞尺寸。如图3(d)所示， M期从S期的右端部向右侧露出(对应于直方图的右侧下摆部分)。因此，M期从S期露出 的右侧露出部分确实为HeLa细胞的M期，确定为细胞周期的M期。对图3所示横轴的右侧露出部分设门，将1个 多个细胞分选至规定的孔中。其 结果，可以仅将处于细胞分裂期的较不稳定状态的M期分选。由此，可以仅将活细胞的M期 细胞分选，可大大有助于细胞的分化和培养的研究。实施例3图4表示能够测量透射光信息和侧方散射光信息的测量部的构成。通过使用具备 该测量部的细胞分选装置，利用设置在细胞流动方向上的测定点，除了能够测量细胞的荧 光信息、透射光信息及侧方散射光信息之外，还可利用多个测量点的透射光信息计算细胞 的流速信息。图5表示能够从规定的细胞集团将1个 多个细胞分选至规定孔中的分选部的构 成。通过使用具备该分选部的本发明的细胞分选装置，就成为分选对象的细胞而言，根据其 流速信息可知到分注喷嘴的时间，因此通过对应该时间将分注喷嘴从废液槽移动至规定的 孔中，可以将所有时期的靶细胞分选。实施例4将实施例1和实施例2中分选的Gl期和M期的细胞在规定条件下培养后，再次进行实施例1和实施例2的解析，进行细胞的分选。其结果，实施例1和实施例2可获得大致 相同的结果。实施例5图10为利用透射光信息的峰值和处于一定流速范围的透射光信息的幅度值而确 定的包括干细胞的特殊细胞的确定方法的示意图。只要是一定流速范围以内的透射光信息 的幅度值，则表示细胞尺寸为基本相同的大小，其中的透射光信息的峰值大的区域细胞反 映透射率小于细胞质的细胞核。即，在相同细胞尺寸下，细胞核越大，则透射光信息的峰值 越大，包括干细胞的特殊细胞的可能性越高。对于流速而言，如图9所示因细胞流过的受光 面截面的位置而不同，因此同等程度的流速是指通过大致相同的受光面截面的位置。干细胞或癌干细胞由于具有核的尺寸大且为普通细胞的2倍左右这一显著特征， 因此利用以往的将荧光化学物质(HoeChst333^)排出至细胞外的特性，但具有会担心荧 光化学物质对细胞的影响或确实性的问题。本实施例中，利用干细胞/癌干细胞的核大这 一细胞自身的特征，特别是利用横轴表示的透射光信息的直方图的右侧(大值)或横轴表 示的透射光信息的峰值的右侧(大值)、和纵轴表示的透射光信息的幅度值或者反映侧方 散射光信息的细胞形态上和内部结构上的信息的解析分布图，实施确定了透射光信息大的 集团的分选，将干细胞或癌干细胞的候补者取出。此时，认为细胞流动位置的不同而幅度值有偏差(=流速不均)，如图11所示通过 在抽取基本相同流速数据后进行解析，可以提高精度。实施例6通过测定对核进行了染色的Hela细胞，如下确认从透射光信息(透射光波形的 峰)最大值(即，图2所示透射光信息的峰的直方图所示的右端)偏离的区域的细胞的 大约半数为异倍体/多倍体核细胞。即通过测定对核进行了染色的HeLa细胞而确认了以 下内容。即确认了根据测定了经核染色的HeLa细胞的结果和基于透射光信息的识别之间 的相关关系，根据透过信息，以高精度进行识别分选。首先，利用图5的流式细胞仪对进行了核染色的HeLa细胞进行测定。首先，将横 轴表示透射光的峰、纵轴表示侧方散射光的峰的散点图示于图12。透射光反映细胞尺寸，细 胞尺寸越大则得到越大的值。侧方散射光反映细胞的内部结构，内部结构越复杂(核很大、 具有多个等)则获得越大的值。图12中，将左下部分作为噪音信息(细胞片等)除去。将 除去了该噪音信息的剩余区域作为R1。本技术以单一细胞集团的测定为前提，当在测定时怀疑有细胞的凝集、由所测定 的细胞混入微小细胞片等时，还可加入确认透射光/散射光信号的信号幅度的工序。当这 些信号幅度的值相对于平均值脱离2σ范围时，认为是多个细胞的凝集或细胞片，有无法 解析来自单一细胞的信号的可能。因而，通过除去透射光/散射光信号的信号幅度的值相 对于平均值脱离2 ο范围的数据，解析精度进一步提高。接着，在上述区域Rl中，将横轴表示细胞核的荧光强度的直方图示于图13。大峰 表示Gl期的细胞核的荧光强度，小峰表示G2/M期的细胞核的荧光强度。认为比G2/M期的 峰大的区域是异倍体/多倍体核细胞的区域。这里，将比G2/M期的峰大的区域定义为从G2/ M区域的中心偏离3 σ以上。使该区域为R2，对R2区域内的数据数进行研究，结果为205 数据(即全体的1.34%)。
接着，对上述区域Rl内的数据而言，将横轴表示透射光信息的透射光峰的直方图 示于图14。将偏离值大的一方(图的右端)为的区域作为R3时，R3区域内的数据数 为巧4数据。该R3区域的平均值(mean)为673. 9、标准偏差(σ )为69. 9。此时的标准偏 差(σ )相对于平均值(mean)的比例(CV)为10. 4%。另一方面，图14的总平均值(mean) 为371. 5，全体的平均值(mean)位于从R3区域的平均值(mean)偏离4 σ的位置。接着，对在区域R3内设门的区域内，将横轴表示细胞核荧光强度的直方图示于图 15。图15中表示与图13中所决定的区域R2相同的区域，将该区域作为R4。此时，区域R4 内的数据数为74，为在区域R3内设门的数据的48. 1%。由以上可以确认从透射光信息(透 射光波形的峰)大的区域偏离的区域的大约半数为异倍体/多倍体核细胞。因此，可以 根据透射光信息以高精度进行异倍体/多倍体核细胞的识别、分选。需要说明的是，以上为测定单一细胞种的母集团的例子，但考虑多种细胞混存的 情况。图16表示测定多种细胞混存的母集团的直方图。横轴表示透射光信息的峰、纵轴表 示频率。在图16的峰的直方图中，只要能够分离各细胞的母集团，则可从其中任意地决定 某区域，对该区域内的细胞母集团应用上述解析。即，从多种细胞混存的母集团中任意地决 定R，对于存在于该区域R内的集团2可以应用本实施例中进行的解析。需要说明的是，实施例1 6中使用了透射光信息和散射光信息的峰，也可使用透 射光信息的峰、幅度及面积，散射光信息的峰、幅度及面积。如此，通过本发明，与有无包含细胞表面抗体/抗原反应、细胞内的荧光蛋白表 达、核染色的荧光处理无关，可进行特定的活细胞集团的解析。进而，如实施方式1 6所 示，与有无上述荧光处理无关，可以在不进行核染色的荧光标记处理的情况下，对上述特定 的细胞集团或该细胞集团的一部分活细胞进行识别和分选。如上所述，在本发明的细胞的识别和分选方法中，通常将在进入检测器之前用束 掩模等阻断的、不发生散射而通过流动池前进的激光作为透射光信息进行利用，可以对活 细胞的细胞周期的特定时期的活细胞和异倍体/多倍体核细胞进行识别和分选。
权利要求
1.一种细胞的识别和分选方法，其特征在于，利用反映向细胞照射光而得到的包括细胞尺寸、形状等的细胞形态上的特征以及包括 细胞核、细胞质等的细胞的内部结构上的特征中的至少一方的透射光的信息，对某特定的 细胞集团或该特定的细胞集团的一部分活细胞进行识别和分选。
2.根据权利要求1所述的细胞的识别和分选方法，其特征在于，使用所述透射光的信息以及反映细胞内部结构特征的侧方散射光的信息，对所述活细 胞进行识别和分选。
3.根据权利要求1或2所述的细胞的识别和分选方法，其特征在于，所述特定的细胞集团的一部分活细胞，是细胞周期的Gl期的细胞的一部分。
4.根据权利要求3所述的细胞的识别和分选方法，其特征在于，所述细胞周期的Gl期的一部分活细胞，是与在由横轴所示的透射光信息所形成的细 胞的直方图或者由横轴所示的透射光信息及纵轴所示的侧方散射光信息所形成的细胞的 解析分布图中S期的最小细胞相比更小的细胞。
5.根据权利要求1或2所述的细胞的识别和分选方法，其特征在于，所述特定的细胞集团的一部分活细胞，是细胞周期的M期的细胞的一部分。
6.根据权利要求5所述的细胞的识别和分选方法，其特征在于，所述细胞周期的M期的一部分活细胞，是与在由横轴所示的透射光信息所形成的细胞 的直方图或者由横轴所示的透射光信息及纵轴所示的侧方散射光信息所形成的细胞的解 析分布图中S期的最大细胞相比更大的细胞。
7.根据权利要求1或2所述的细胞的识别和分选方法，其特征在于，与所述特定的细胞集团的一部分活细胞有无细胞表面抗体-抗原反应、包括细胞内的 荧光蛋白表达的荧光处理无关，对所述特定的细胞集团或该细胞集团的一部分活细胞进行 分选。
8.根据权利要求7所述的细胞的识别和分选方法，其至少使用透射光信息识别包括干 细胞的一部分特殊细胞，对包括干细胞的特殊细胞进行分选，所述包括干细胞的特殊细胞 与在由横轴所示的透射光信息所形成的细胞的直方图、或者由横轴所示的透射光信息及纵 轴所示的侧方散射光信息或透射光的幅度信息、荧光信息等所形成的细胞的解析分布图中 S期的最大细胞相比更大。
9.根据权利要求1 8中任一项所述的细胞的识别和分选方法，其特征在于，从所述特定的细胞集团的一部分活细胞内将一个细胞分选至一个孔中。
10.根据权利要求1或2所述的细胞的识别和分选方法，其在所述某特定的细胞集团 的透射光信息中将偏离最大值的区域的细胞作为异倍体核细胞或多倍体核细胞进行识 别、分选。
11.根据权利要求10所述的细胞的识别和分选方法，当从所述区域的平均值 (mean)减去其4σ得到的值大于所述某特定的细胞集团的透射光信息的平均值(mean)时， 作为异倍体核细胞或多倍体核细胞对细胞进行识别、分选。
12.根据权利要求11所述的细胞的识别和分选方法，当从所述1%区域的平均值 (mean)减去其4 σ得到的值大于所述某特定的细胞集团的透射光信息的平均值(mean)、且 所述区域的细胞的标准偏差(ο )除以平均值(mean)得到的值(CV)为8%以上时，作为异倍体核细胞或多倍体核细胞对细胞进行识别和分选。
13.一种细胞的识别和分选方法，权利要求10 12中任一项中所测定的细胞集团，为 权利要求7所述方法中的血液细胞。
14.一种细胞的识别和分选装置，其具备光照射部，其向细胞照射光；细胞测量部，其能够获得反映包括细胞尺寸、形状等的细胞形态上的特征和包括细胞 核、细胞质等的细胞内部结构上的特征中的至少一方的透射光信息与反映细胞内部结构特 征的侧方散射光的信息；解析部，其对所测量的透射光和侧方散射光的信息进行解析；以及，细胞分选部，其对通过所述解析部获得的细胞的某特定的集团或该特定的细胞集团的 一部分活细胞进行识别和分选。
15.根据权利要求14所述的细胞的识别和分选装置，其特征在于，所述细胞的分选部具有下述功能，即，将由横轴所示的透射光信息所形成的细胞直方 图或由横轴所示的透射光信息及纵轴所示的侧方散射光信息所形成的细胞解析分布图中 的规定区域的1个或多个活细胞，分选至规定孔内。
全文摘要
提供了一种细胞的识别和分选方法，其中，利用反映包括细胞尺寸、形状等的细胞形态上的特征的透射光的信息，或利用透射光的信息和反映细胞的内部结构上的特征的侧方散射光的信息，对某特定的细胞集团或该特定的细胞集团的一部分细胞进行识别和分选。上述特定的细胞集团的一部分细胞是细胞周期的G1期或M期的一部分。G1期的一部分细胞位于由横轴所示的透射光信息所形成的解析分布图的左侧下摆区域。另外M期的一部分细胞位于由横轴所示的透射光信息所形成的细胞的解析分布图的右侧下摆区域。
文档编号G01N33/48GK102076841SQ20098012470
公开日2011年5月25日 申请日期2009年6月19日 优先权日2008年6月27日
发明者徐杰, 月井健, 高桥亨 申请人:古河电气工业株式会社