专利名称：一种利用适配体识别量子点标记结合流式细胞术同时检测两种致病菌的方法
技术领域：
本发明涉及食源性致病菌分析检测领域，尤其涉及利用适配体识别技术和荧光量 子点标记结合流式细胞术同时检测副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的方法。
背景技术：
流式细胞术(FCM)是利用流式细胞仪对细胞或其他微小生物颗粒的多种物理、生 物学参数同时进行定量分析的技术，它能在单细胞水平辨认细胞形态、大小和荧光特性，具 有检测速度快、采集数据量大、能同时进行多参数检测等优良特性，广泛应用于肿瘤学、免 疫学、毒理学研究。然而，由于细菌体积微小、各种菌体成分含量相对较低，利用传统突光染 料作为标记物，其荧光强度已难以满足高灵敏检测的需要，而且有机荧光染料的光谱学性 质是窄波长激发宽波长发射，因此它需要多波长激发来实现多色标记，从而限制了它在同 时检测多种目标物中的应用。相比于传统荧光染料，量子点具有诸多优点得以应用于生物 标记宽波长激发窄波长发射的光谱学特性可应用于同时激发和多色标记；荧光强度高， 光稳定性好，适用于实时和长时间监测生物学过程。
目前利用流式细胞术进行的分析检测，大多采用抗原/抗体的识别结合模式，然 而利用抗体来分析细菌有一定的缺陷，表现在细菌表面的抗原通常不仅仅只在一种细菌 上有表达，在其他细菌表面也会有表达，从而产生假阳性信号，降低了检测的准确度和灵敏 度；而且在抗体上标记荧光染料或者荧光纳米材料很困难，甚至会影响到抗体的活性。近些 年来，由于寡核苷酸适配体(aptamer)较之抗体有诸多优点成本低，稳定性好，易于修饰 等等，因此被作为抗体分子的前景性替代分子，受到很多领域的关注。SELEX是一种随机生 物文库技术，它利用大容量的随机寡核苷酸库(由两端的固定序列和中间20 40个碱基 的随机序列组成)与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合 PCR体外扩增技术，使其得到指数级富集，如此循环数轮，最终进化成为高亲和力、高特异性 的寡核苷酸适配体。适配体与靶物质结合的特异性和亲和力可与抗体媲美，甚至优于抗体， 加上其技术上和稳定性方面的优势，近10多年来，采用SELEX技术筛选的核酸适配体不断 被应用于生命科学各个领域的研究工作中，包括对疾病的诊断与治疗。将适配体作为识别 元件，量子点作为荧光标记物应用于流式细胞术，不但拓展了适配体和量子点的应用领域， 而且大大更新了传统的流式细胞技术，有利于多通道同时检测，提高了检测的准确度、灵敏 度。发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种更加快速、准确、灵敏 的利用适配体识别量子点标记结合流式细胞术同时检测副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌 的方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种利用适配体识别量子点标记结合流式细胞术同时检测副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于首先利用 所述的量子点标记的核酸适配体探针与待测样品室温下混合孵育I h，如果待测样品中含 有副溶血性弧菌或鼠伤寒沙门氏菌，在孵育的过程中，副溶血性弧菌被apt I特异性识别， 与此同时标记上QD 535，鼠伤寒沙门氏菌被apt 2特异性识别，与此同时标记上QD 585。最 后采用多参数流式细胞术对待测样品进行检测，流式细胞仪上配置的氩离子激光488 nm, 能够同时激发535nm发射的量子点和585 nm发射的量子点，两种量子点发射出的绿色和 橙红色荧光将同时被FLl和FL2检测器检测。根据检测到的单位体积中具有荧光阳性信号 (该荧光信号即为所述量子点标记的核酸适配体探针与细菌结合后所发出的不同颜色的荧 光信号)的对象的数量来对待测样品中副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的检测结果进行 分析和判断。我们对10，000个对象进行统计分析，分析结果以QD 585的橙红色色荧光-QD 535的绿色荧光的对数双参数点图表示，如果绿色荧光单阳区呈现出清晰可辨的群，则可判 断待测样品中含有副溶血性弧菌，如果橙红色色荧光单阳区呈现出清晰可辨的群，则可判 断待测样品中含有鼠伤寒沙门氏菌，如果绿色荧光单阳区和橙红色荧光单阳区都呈现出清 晰可辨的群，则可判断待测样品中含有副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌。检测原理图如图1所示。
本发明提出的上述技术方案中，所述量子点标记的核酸适配体探针用于特异性检 测食品待测样品中的目标菌体，在识别结合的同时对菌体进行量子点荧光标记，该技术方 案充分结合了适配体对目标物质的高亲和力高特异性识别能力，量子点的光稳定性和多色 荧光特性，和多参数流式细胞术的灵敏特异性，能够真正实现对副溶血性弧菌和鼠伤寒沙 门氏菌样品进行快速、准确、灵敏的检测。
上述的利用适配体识别量子点标记结合流式细胞术同时检测副溶血性弧菌和鼠 伤寒沙门氏菌的方法中，所述的适配体由本实验室通过whole-bacterium SELEX技术筛选 得到。其中与副溶血性弧菌具有高亲和力和高特异性的适配体序列为5’-ATAGGAGTCACGAC GACCAGAATCTAAAAATGGGCAMGAAACAGTGACTCGTTGAGATACTTATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3’ (a Pt I)，与鼠伤寒沙门氏菌具有高亲和力和高特异性的适配体序列为5’ -ATAGGAGTCACGACG ACCAGAAAGTAATGCCCGGT AGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGATATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3，( apt 2)。在实际操作中，我们将apt I和apt 2的5’端进行氨基化修饰，由生工生物工程 (上海)有限公司合成。
上述的利用适配体识别量子点标记结合流式细胞术同时检测副溶血性弧菌和鼠 伤寒沙门氏菌的方法中，所述的量子点为在同一激发波长下，具有不同发射波长的量子点， 即发射波长在535 nm的量子点QD 535和发射波长在585 nm的量子点QD 585。
上述技术方案中的具有不同发射波长的量子点，其制备方法如下首先合成碲前 驱体NaHTe，在圆底烧瓶中加入O. 0378gNaBH4与5 mL超纯水混合通N2条件下置于冰上搅 拌均匀，接着加入O. 0319g碲粉搅拌4h，形成NaHTe溶液；接着合成CdTe量子点，O. 1142g CdCl2 · 2. 5H20和O. 1274 g巯基丙酸溶解在100 mL超纯水中，加入2 M NaOH溶液调pH至 11. 2，然后通N2搅拌30 min，接着将合成的碲前驱体NaHTe快速加入上述复合物中，N2条件 下搅拌冷凝回流。所制备量子点的荧光光谱如图2所示。
上述技术方案中，量子点标记的核酸适配体探针的制备方法如下适配体5’端氨 基化，量子点表面含有羧基基团，因此可以通过EDC/Sulfo-NHS缩合将量子点标记在适配体上,具体步骤如下QDs(l nmol)加入60 μ L(50 mM)EDC和30 μ L(25 mM)NHS避光轻微振荡30min活化量子点表面的羧基基团，接着加入氨基化修饰的适配体(量子点与适配体的摩尔比为1: 10)，轻微振荡反应I h，加入乙醇胺继续反应2 h，封闭量子点表面未反应的羧基基团，最后通过离心得到量子点标记的核酸适配体探针。
与现有技术相比，本发明的优点在于
1.本发明方法将适配体作为识别元件，量子点作为荧光标记物应用于流式细胞术，不但拓展了适配体和量子点的应用领域，而且大大更新了传统的流式细胞技术，有利于多通道同时检测，提高了检测的准确度、灵敏度。
2.本发明方法将高亲和力高特异性的适配体应用于流式细胞术，相比于传统流式细胞术中使用抗体作为识别元件，适配体稳定性好，成本低，易于标记且标记后不影响其活性，同时对目标菌体具有高度亲和力和高度选择性，在很大程度上提高了检测的准确性。
3.本发明方法将具有多色荧光的量子点应用于流式细胞术，相比于传统流式细胞术中使用普通有机染料作为荧光标记物，量子点的荧光强度更高，光稳定性更好，其宽波长激发窄波长发射的光谱学特性，使得量子点在同一激发波长下，发射出不同颜色的荧光，从而可以实现多色标记应用于多通道检测中，与流式细胞术能同时进行多参数、快速检测的特点有机 结合在一起，大大提闻了检测的灵敏度。
综上，本发明的检测方法可以将较低浓度的目标菌体捕获并标记上荧光信号，真正实现同时对副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌进行快速、准确、灵敏的检测。


图1 :基于适配体识别量子点标记结合流式细胞术同时检测副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的实验原理图。
图2 :量子点的荧光光谱图。
图3:多参数流式细胞术检测单个目标菌的流式散点图；图六为副溶血性弧菌的阴性样品；图B为副溶血性弧菌与QD 535-apt I孵育后的流式散点图；图C为鼠伤寒沙门氏菌的阴性样品；图D为鼠伤寒沙门氏菌与QD 585-apt 2孵育后的流式散点图。各图中Gate 1表示橙红色荧光单阳区，Gate 4表示绿色荧光单阳区。
图4:多参数流式细胞术同时检测两个目标菌的流式散点图；图A为副溶血性弧菌与鼠伤寒沙门氏菌混合的阴性样品；图B为副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌与 QD535-apt I和QD585_apt 2孵育后的流式散点图。图C和D为本发明实施例中本发明检测方法与平板计数法的检测结果对比图，图C中横坐标表示由平板计数法得到的副溶血性弧菌浓度，纵坐标表示由流式细胞仪测得的副溶血性弧菌浓度；浓度范围在 3. 4X 1O4Cfu · mL_1-3. 4X 107cfu · ml/1,图D中横坐标表示由平板计数法得到的鼠伤寒沙门氏菌浓度，纵坐标表示由流式细胞仪测得的鼠伤寒沙门氏菌浓度；浓度范围在3. 8X 1O4Cfu mL_1-3. 8 X 107cfu · mL—1。
图5:本发明的检测方法在检测其他食源性致病菌的流式散点图；图A D分别为样品a d的检测结果图。
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实例1:本发明的检测方法在检测副溶血性弧菌中的应用
含1% NaCl的Tryptone Soya Broth培养基培养副溶血性弧菌，37°C摇床培养至对数生长期(0D_ = O. 3)，用平板计数法得出副溶血性弧菌浓度为3. 4X IO8Cfu ·πι Λ收集菌液 1800 g 4°C离心5 min，弃上清，用 IX 结合缓冲液(IXBB) (50 mM Tris-HCl (pH 7.4)5 mM KCiaOO mMNaCia mM MgCl2)清洗，去除多余的培养基成分。用IXBB 10倍梯度稀释副溶血性弧菌的浓度至3. 4 X IO4Cfu · md 4 X IO7Cfu · πι Λ然后分别与QD 535-apt I 混合室温下孵育I h，在孵育的过程中，副溶血性弧菌被被apt I特异性识别，与此同时标记上QD 535，然后上机检测，相同浓度的未与QD 535-apt I混合孵育的副溶血性弧菌作为阴性对照样本。由图3中的A图可见，未与QD 535-apt I混合孵育的副溶血性弧菌没有荧光信号，从而出现在Gate 3阴性区，然而与QD 535-apt I混合孵育的副溶血性弧菌在绿色荧光单阳区(B图Gate 4)出现了明显的群落，表明副溶血性弧菌被apt I特异性识别并标记上了 QD 535，而且阳性率高达99. 11%。
实例2 :本发明的检测方法在检测鼠伤寒沙门氏菌中的应用
BHL培养基培养鼠伤寒沙门氏菌，37°C摇床培养至对数生长期(0D_ = O. 3)，用平板计数法得出鼠伤寒沙门氏菌为3. 7X IO8Cfu · mL—1，收集菌液1800 g 4°C离心5min，弃上清，用 IX 结合缓冲液(IXBB) (50 mM Tris-HCl (pH 7. 4)，5 mM KCl, I 00 mM NaCl，I mM MgCl2)清洗，去除多余的培养基成分。用IXBB 10倍梯度稀释鼠伤寒沙门氏菌的浓度至3.7 X IO4Cfu7 X IO7Cfu ·πι Λ 然后分别与 QD 585-apt 2 混合室温下孵育 I h，在孵育的过程中，鼠伤寒沙门氏菌被apt 2特异性识别，与此同时标记上QD 585，然后上机检测，相同浓度的未与QD 585-apt 2混合孵育的鼠伤寒沙门氏菌作为阴性对照样本。由图 3中的C图可见,未与QD 585-apt 2混合孵育的鼠伤寒沙门氏菌没有突光信号,从而出现在Gate 3阴性区，然而与QD 585-apt 2混合孵育的鼠伤寒沙门氏菌在橙红色荧光单阳区 (D图Gate I)出现了明显的群落，表明鼠伤寒沙门氏菌被apt 2特异性识别并标记上了 QD 585，而且阳性率高达99 39%。
实例3 :本发明的检测方法在同时检测副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌中的应用
将副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌与QD 535-apt I和QD 585-apt 2室温下混合孵育I h，在孵育的过程中副溶血性弧菌被apt I特异性识别，并标记上QD 535，鼠伤寒沙门氏菌被apt 2特异性识别，与此同时标记上QD 585。然后上机检测，相同浓度的未与QD 535-apt I和QD585-apt 2混合孵育的副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合物作为阴性对照样本，由图4中的A图可见，未与QD 535-apt I和QD 585-apt 2混合孵育的副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合物既没有绿色荧光信号也没有橙红色荧光信号，从而出现在 Gate 3双阴性区，而与QD535-apt I和QD 585-apt 2混合孵育的副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏 菌的混合物分别在绿色单阳区(B图Gate 4)和橙红色单阳区(B图Gate I)出现了明显的群落，表明副溶血性弧菌被apt I特异性识别并标记上了 QD 535，鼠伤寒沙门氏菌被apt 2特异性识别并标记上了 QD 585。将本发明检测方法与平板计数法的检测结果进行对比，结果显示两者无显著差异，表明本发明检测方法快速可靠、灵敏度高、稳定性好。如图 C、D所示。图C中横坐标表示由平板计数法得到的副溶血性弧菌浓度，纵坐标表示由流式细胞仪测得的副溶血性弧菌浓度；浓度范围在3. 4X IO4 cfu · md 4X IO7Cfu · mL—1，图D中横坐标表示由平板计数法得到的鼠伤寒沙门氏菌浓度，纵坐标表示由流式细胞仪测得的鼠伤寒沙门氏菌浓度；浓度范围在3. 8X IO4Cfu · ιιιΓ'-βδX IO7 cfu · mL'
实例4 :本发明的检测方法在检测其他食源性致病菌中的应用
选择金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌作为待测样品a与QD 535-apt I和QD 585-apt 2室温下混合孵育I h，然后上机检测，检测结果如图5中A图所示；选择大肠杆菌和阪崎杆菌作为待测样品b与QD 535-apt I和QD 585-apt 2室温下混合孵育I h，然后上机检测，检测结果如图5中B图所示；选择链球菌和大肠杆菌作为待测样品c与QD 535-apt I和QD 585-apt 2室温下混合孵育I h，然后上机检测，检测结果如图5中C图所示；选择阪崎杆菌和链球菌作为待测样品d与QD 535-apt I和QD 585-apt 2室温下混合孵育I h， 然后上机检测，检测结果如图5中D图所示；由图5 A D可见，绿色荧光单阳区(Gate 4) 和橙红色荧光单阳区(Gatel)，均未出现清晰可辨的群，平均阳性率均低于10%，表明本发明的检测方法能够有效的特异性检测副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌。
实例5 :本发明的检测方法在同时检测虾肉中副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌中的应用
25g冷冻的新鲜虾肉绞碎，与225 mL含3% NaCl (w/v)的碱性蛋白胨混合均质5 min,然后室温下静置30 min,沉淀大颗粒和悬浮物，取上清作为实际样品，每个样品中注入浓度在I X IO5-1 X IO6Cfu · mL—1副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的混合物，然后加入QD 535-apt I和QD 585-apt 2混合室温下孵育I h后上机检测，检测结果如表I所示。
表1:虾肉中副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的检测
权利要求
1.一种利用适配体识别量子点标记结合流式细胞术同时检测两种致病菌的方法，其特征在于具体利用荧光量子点标记的核酸适配体识别结合流式细胞术同时检测副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的方法，首先利用量子点标记的核酸适配体探针与待测样品孵育，在孵育过程中适配体特异性识别目标菌体，并将目标菌体标记上量子点，最后采用多参数流式细胞术对孵育后的待测样品进行检测，根据检测到的具有荧光信号的对象的数量来对待测样品中副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的检测结果进行分析和判断。
2.根据权利要求1所述的一种利用适配体识别量子点标记结合流式细胞术同时检测两种致病菌的方法，其特征在于所述的量子点是在同一激发波长下，发射出绿色荧光和橙红色荧光的量子点。
3.根据权利要求1所述的一种利用适配体识别量子点标记结合流式细胞术同时检测两种致病菌的方法，其特征在于所述的适配体为与副溶血性弧菌具有高亲和力高特异性识别的apt 1，与鼠伤寒沙门氏菌具有高亲和力和高特异性识别的apt 2。
4.根据权利要求1所述的一种利用适配体识别量子点标记结合流式细胞术同时检测两种致病菌的方法，其特征在于所述的量子点标记的核酸适配体探针，其制备方法是将量子点表面的羧基与适配体末端标记的氨基通过化学键合连接而成。
全文摘要
本发明涉及一种利用适配体识别量子点标记结合流式细胞术同时检测两种致病菌的方法，具体公开了利用荧光量子点标记的核酸适配体识别结合流式细胞术同时检测副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的方法，其步骤如下首先制备量子点标记的核酸适配体探针，发射波长在535nm的量子点(QD 535)标记在副溶血性弧菌的核酸适配体上(apt 1)，发射波长在585 nm的量子点(QD 585)标记在鼠伤寒沙门氏菌的核酸适配体上(apt 2)，然后将QD 535-apt 1，QD 585-apt 2与副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌共培育，最后采用多参数流式细胞术进行检测，根据检测到的具有荧光信号的对象的数量来对待测样品中副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的检测结果进行分析和判断。本发明的检测方法具有快速、灵敏、准确等优点。
文档编号G01N15/14GK103033463SQ20121057020
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者王周平, 段诺, 吴世嘉, 马晓媛, 夏雨 申请人:江南大学