专利名称：用于在免疫测定中减少白细胞干扰的磁珠的制作方法
技术领域：
本发明涉及在用于利用免疫测定法测定分析物在血液样品中的存在或浓度的装置和方法中减少或消除来自血沉棕黄层(buffy coat)组分、特别是白细胞的干扰。具体地，本发明涉及通过用受调理作用的磁性消耗珠子(sacrificial bead)和类似地受调理作用的磁性组件修正(amend)血液样品来减少或消除白细胞免疫传感器干扰。
背景技术：
为了诊断、筛选、疾病分期、法医分析、妊娠测试和药物测试等等，会对生物样品进行目标分析物的许多实验室免疫测定测试。虽然少数定量测试例如妊娠测试已被简化成用于患者在家中使用的简单试剂盒，但大部分定量测试仍然需要经训练的专业技术人员在实验室环境中使用复杂仪器进行。实验室测试增加了分析成本并且延迟了患者收到结果的时间。在许多情况下，该延迟可能对患者的病况或预后(例如表明心肌梗塞和心力衰竭的标志物的分析)是有害的。在此类和类似危急情况下，有利地是在及时现场护理(point-of-care)时准确、便宜地并且以最短延迟进行此类分析。许多类型的免疫测定装置和方法已进行了描述。例如，用于成功地测量血液样品中的分析物的一次性传感设备由Lauks在美国专利5，096，669中公开。用于成功地测量特征例如凝血时间的其它设备由Davis等人在美国专利N0.5，628，961和5，447，440中公开。这些设备使用读数装置和适合读数装置的筒(cartridge)以测量作为时间函数的血液样品中分析物的浓度和粘度的改变。将美国专利Nos.5，096，669,5, 628，961和5，447，440的整个内容和公开内容通过引用并入本文。属于Miller等人的美国专利申请公布2006/0160164( “‘164申请”)描述了利用免疫参考电极的免疫测定设备；属于Miller等人的美国专利7，682，833描述了利用改进的样品封闭(sample closure)的免疫测定设备；属于Emerson Campbell等人的美国专利申请公布2004/0018577描述了多重杂交免疫测定；属于Davis等人的美国专利7，419，821描述了用于分析物测量和免疫测定的装置和方法，所述每一个专利或公布是共同拥有的并且通过引用整体并入本文。非竞争性两位点免疫测定法(也称为夹心免疫测定法)通常用于测定生物测试样品中的分析物浓度，用于例如由Abbott Point of Care Inc.开发为1-Stat ,免疫测定系统的及时现场分析物检测系统。在典型的两位点酶联免疫吸附测定(ELISA)中，将一种抗体结合至固体载体上以形成固定或捕获抗体，并且将第二种抗体缀合至或结合至信号产生性试剂例如酶以形成信号或标记抗体。在与包含待测量的分析物的样品反应后，分析物被“夹”在固定抗体与信号抗体之间。在清洗掉样品和任何非特异性结合的试剂后，测量保留在固体载体上的信号抗体的量，该量应当与样品中的分析物的量成比例。
电化学检测也已被用于免疫测定，在所述电化学检测中分析物的结合直接或间接引起与电极相邻的电活性物质的活性改变。关于电化学免疫测定的综述，参见Laurell等人，Methods in Enzymology,第 73 卷，〃Electroimmunoassay〃，Academic Press, NewYork, 339，340, 346-348(1981)。在电化学免疫传感器中，分析物与其同源抗体的结合产生了电极上的电活性物质的活性改变，所述电极保持于适当的电化学电势下以引起电活性物质的氧化或还原。存在许多用于满足这些条件的配置或设置。例如，可将电活性物质直接附着至分析物，或可将抗体共价地连接至从无电活性底物产生电活性物质或破坏电活性底物的酶。关于电化学免疫传感器的综述，参见 M.J.Green(1987)Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sc1.316:135-142。差分安培测量(differential amperometrie measurement)的概念在电化学领域是公知的。参见，例如，属于Cozzette等人的共同拥有的美国专利5，112，455，将其通过引用整体并入本文。差分安培传感器组合的形式公开于属于Cozzette等人的共同拥有的美国专利5，063,081( “‘081专利”)，也将其通过引用整体并入本文。‘081专利还公开了选择性渗透层用于电化学传感器的用途以及成膜乳胶用于固定生物活性分子的用途。聚(乙烯醇)(PVA)在传感器制造中的用途描述于属于Davis等人的美国专利6，030，827，将通过弓I用整体并入本文。属于Vikholm等人的美国专利申请公布2003/0059954 (将其通过弓I用整体并入本文)教导了直接附着至具有生物排斥或生物分子排斥涂层例如PVA的表面的抗体(在表面上的抗体之间的空隙中)。属于Johansson的美国专利5，656，504教导了具有固定在其上的抗体的固相例如PVA，将其通过引用整体并入本文，属于Davis等人的美国专利6，030, 827和6，379，883教导了用于形成PVA层的方法，所述专利通过引用整体并入本文。在本领域内公知的是，免疫测定易遭受各种形式的干扰。例如共同拥有的在审的美国申请12/411,325( “‘325申请”)阐述了通过将IgM包括在IgG试剂混合物中来减小嗜异性抗体的干扰。将‘325申请通过引用整体并入本文。随着免疫测定技术不断地被改造以适合进入及时现场护理测试市场，将全血用作测试介质相对于血浆和血清已得到增加，血浆和血清通常用于中心实验室测试。当分析全血时，红细胞和血沉棕黄层成分存在于测定介质中。本领域技术人员认识到血沉棕黄层是当将血液离心时在红细胞上面形成的一层白细胞和血小板。已发现在某些测定中，可针对白细胞有效地对不同的测定组分例如珠子和电极表面进行调理作用。例如，对于电极表面，为了基于过氧化物离子的电化学检测而观察人嗜中性粒细胞的呼吸爆发，Hill等人(FEBS191，257-263，1985)利用人IgG对微伏安电极(microvoItammetric electrode)进行调理作用。上文中提及的美国专利申请公布2006/0160164( ‘164申请)论述了电化学免疫传感器，全血与血浆之间的偏差；并且提供了，标志物例如肌钙蛋白等的免疫测定通常被测量和报告为血浆或血清值。‘164申请教导当将这些免疫传感器用于分析全血时，需要使用用于消除偏差的校正因子或方法。‘164申请还教导该偏差的某些方面可被消除，包括与血沉棕黄层的组分相关的全血电化学免疫测定中的偏差，以及还有与样品之间的血细胞比容(hematocrit)差异相关的偏差。
如‘164申请中所提供的，在具有涂覆了分析物抗体例如肌钙蛋白抗体的珠子的免疫传感器上发生白细胞(或白血细胞(white cell))干扰，以及对照实验已显示该正偏差不存在于血浆样品和其中已除去血沉棕黄层的血液样品中。因此，白细胞似乎能够粘附至免疫传感器并且促进酶标记的抗体的非特异性结合，所述抗体甚至在洗涤步骤后仍然保持结合。在‘164申请中，显示了该偏差可通过在珠子制备过程中将少量抗体添加至人血清白蛋白而部分消除。因此，当样品与修饰的珠子接触时，来自样品的白蛋白快速包被珠子，并且一旦它们被一层天然白蛋白包被，白细胞就不应当将珠子识别为受调理作用的表面。‘164申请描述了对白细胞干扰问题的另一个解决方法，其中通过使血液样品的盐浓度从约140mM的正常钠离子浓度增加至高于约200mM，优选增加至约230mM来消除偏差。解释减少的干扰的机制可能是盐弓丨起白细胞的渗透皱缩。该解释与白细胞受损的与显露的免疫传感器相互作用的能力一致。虽然有上述文献，但是在至少下列领域中仍然需要用于减少白细胞活性在免疫测定中的影响的改进的方法:免疫传感器干扰，最明显地在及时现场护理测试的情景中；电化学免疫测定；与免疫-参考传感器结合的免疫传感器的使用；全血免疫测定；基于一次性使用的筒的免疫测定；仅使用单一洗涤步骤的非相继免疫测定；和干试剂涂层。发明概述本发明涉及在分析物免疫测定中减少或消除白细胞干扰以及试剂盒、设备和使用此类试剂盒和设备的方法。在第一实施方案中，本发明涉及在分析物免疫测定中减少来自白细胞的干扰的方法，包括在足以使生物样品中的至少一部分白细胞结合至磁性消耗珠子的条件下，将包含白细胞的生物样品例如血液样品与针对所述白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子接触；和通过磁性使磁性消耗珠子保留而基本上不与免疫传感器接触。任选地，磁性消耗珠子包括利用苯乙烯-丙烯酸共聚物涂覆的磁铁(Fe3O4)核心或利用非人IgG或其片段涂覆的磁性珠子。磁性消耗珠子优选具有0.01 μ m至20 μ m,例如0.Ιμπι至5μηι或3μηι至5μηι的平均粒度。任选地，磁性消耗珠子存在于免疫测定筒内的一种或多种可溶解的干试剂涂层中。磁铁可以是永久磁铁或电磁铁，可以被布置在免疫测定筒中或布置在免疫测定筒的读数器中。在优选方面，至少50wt.%，例如至少75wt.%的磁性消耗珠子被保留不与免疫传感器接触。在另一个实施方案中，本发明是在血液样品中进行分析物夹心免疫测定的方法，包括将包含白细胞的血液样品导入测试筒的保持室，其中用针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子涂覆保持室的一部分；在足以使生物样品中的至少一部分白细胞结合至磁性消耗珠子的条件下将血液样品与磁性消耗珠子接触；使血液样品移动进入导管，其中定位于导管的至少一部分的磁场吸引磁性消耗珠子并且将其保留在导管壁的至少一部分上，从而基本阻止了磁性消耗珠子与免疫传感器接触；将血液样品与免疫传感器接触以形成包含固定的捕获抗体、样品分析物和信号抗体的夹心；任选地从免疫传感器洗涤血液样品；以及基于由信号抗体提供的信号检测分析物的存在。任选地，所述方法还包括步骤:从免疫传感器洗涤血液样品；和将免疫传感器与能够与所述信号抗体反应的试剂接触以在免疫传感器上产生与样品分析物在血液样品中的存在相关的信号。分析物任选地选自肌钙蛋白1、肌钙蛋白T、BNP、肌酸激酶MB、原降钙素、proBNP、NTproBNP、肌红蛋白等，加上临床诊断中使用的其它夹心测定例如PSA、D-二聚体、CRP、HCG、NGAL、髓过氧化物酶和TSH。固定的捕获抗体优选附着至传感器，所述传感器选自安培计电极(amperometric electrode)、电位测定电极(potentiometric electrode)、电导测定电极(conductimetric electrode)、光波导(optical wave guide)、表面等离子体共振传感器(surface plasmon resonance sensor) >声波传感器和压电式传感器。固定的捕获抗体可连接至测定珠子，然后将测定珠子连接至安培计电极。在另一个实施方案中，本发明涉及在血液样品中进行分析物竞争性免疫测定的方法，包括将包含白细胞的血液样品导入测试筒的保持室，其中用针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子涂覆保持室的一部分；利用标记的分析物修正血液样品；在足以使生物样品中的至少一部分白细胞结合至磁性消耗珠子的条件下将血液样品与磁性消耗珠子接触；施加定位至导管的至少一部分上的磁场以吸引磁性消耗珠子并且将其保留在导管壁的至少一部分上，从而基本上阻止了磁性消耗珠子与免疫传感器接触；将血液样品与免疫传感器接触以形成结合的样品分析物与结合的标记的分析物的竞争性比率；任选地从免疫传感器洗涤血液样品；以及基于如通过结合的标记的分析物提供的信号测定的竞争性比率检测分析物的存在。所述方法任选地还包括从免疫传感器洗涤血液样品；以及将免疫传感器与能够与标记的分析物反应的试剂接触以在免疫传感器上产生与样品分析物在血液样品中的存在反相关的信号。样品分析物任选选自地高辛、苯巴比妥、苯妥英、茶碱、丙戊酸和万古霉素。标记的分析物任选选自放射性标记物、酶、生色团、荧光团、化学发光物质、离子载体(ionophore)和电活性物质。例如标记的分析物可用选自突光素、二茂铁和对氨基苯酹的标记物来进行标记。在另一个实施方案中，本发明是用于进行怀疑存在于血液样品中的样品分析物的竞争性免疫测定的筒，所述筒包括:用于接收血液样品的样品入口 ；用于计量血液样品以形成计量样品的计量室(metering chamber); 一个或多个包含针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子和标记的分析物的干试剂涂层；包含针对样品分析物和针对标记的分析物的固定抗体的电极；和用于将计量样品和标记的分析物移至电极的一个或多个泵件(pumping element)。筒还可包括磁铁，其用于磁性消耗珠子的位置保持。或者，可将磁铁可置于读数设备而非筒中。在另一个实施方案中，本发明涉及用于进行怀疑存在于血液样品中的样品分析物的非竞争性免疫测定的筒，所述筒包括:用于接收血液样品的样品入口 ；用于计量血液样品以形成计量样品的计量室；一个或多个包含针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子和针对分析物的信号抗体的干试剂涂层；包含针对样品分析物的固定抗体的电极；和用于将计量样品移至电极的一个或多个泵件。筒还可包括磁铁，其用于磁性消耗珠子的位置保持。或者，可将磁铁可置于读数设备而非筒中。在另一个实施方案中，本发明是用于在全血样品中进行分析物免疫测定的试剂盒，其包括:针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子，其中磁性消耗珠子可由磁场移动；任选地用于保留磁性消耗珠子的磁铁；和免疫传感器，其中全血样品中的白细胞可与所述磁性消耗珠子结合，并且其中磁场能够将所述磁性消耗珠子的至少一部分保留而不与所述免疫传感器接触。免疫测定可以是夹心测定或竞争性测定。附图概述
本发明的这些和其它目的、特征和有利方面描述于下列特定实施方案的详细说明中并且在下列图中进行了显示，其中:

图1是本发明的一个实施方案的免疫传感器筒罩子(cover)的等距俯视图；图2是本发明的一个实施方案的免疫传感器筒罩子的等距仰视图；图3是本发明的一个实施方案的免疫传感器筒的带垫圈(tape gasket)的布局的俯视图；图4是本发明的一个实施方案的免疫传感器筒底座的等距俯视图；图5是本发明的一个实施方案的免疫传感器筒的布局的图解视图；图6是本发明的一个实施方案的免疫传感器筒内的流体和空气路径的图解视图，包括用于以干试剂修正流体的位置；图7是根据本发明的一个实施方案的免疫传感器筒的电导测定电极和免疫传感器电极的掩模(mask)设计的俯视图；图8显示包括针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子的电化学免疫传感器的操作原理；图9 (a)显示具有正斜率输出信号的脑利钠肽(BNP)筒的未预料到的波形，图9 (b)显示具有负斜率输出信号的BNP筒的未预料到的波形。图9(c)显示对于低分析物浓度具有接近零斜率的正常反应，图9(d)举例说明仅在高分析物浓度时预期的负斜率，其中测量可变成基底限制的而非酶限制的。图10显示在(a)正常样品和(b)异常血沉棕黄样品上进行的洗涤步骤中氧化电极脉冲的效应；图11是电活性物质的酶促再生的示意图；图12是免疫传感器筒的优选实施方案的俯视图；图13是免疫传感器筒的优选实施方案的流控图解视图；图14(a)和(b)显示在消耗珠子在样品中(a)不存在和(b)存在的情况下在高棕黄(high buffy)样品中的BNP的测定后免疫传感器的显微照片；图15显不具有用于关闭关闭位直(closed position)中的样品进入端口的可滑动密封组件的本发明的一个实施方案的筒设备；图16显示具有用于关闭开口位置中的样品进入端口的滑动密封组件的本发明的一个实施方案的筒设备；图17显示在分析过程中发生的信号产生性反应:(a)利用碱性磷酸酶切割底物以产生电活性的对氨基苯酚和(b)对氨基苯酚的氧化；图18显示在高棕黄(左图框)和正常全血(右图框)样品中对于免疫传感器斜率的影响的图形数据:试剂中掺入了(亚批2和3)和未掺入(亚批I)消耗微粒；图19(a)和(b)显示图14(a)和(b)中的相关免疫传感器的显微照片的分析仪波形；图20显示不充分的洗漆(poor washing)(不能用分析流体替换传感器结构内的样品流体)对安培计波形的影响；和图21显示竞争性免疫测定，根据本发明的一个实施方案可用磁性消耗珠子修正。发明详述
最近已发现利用已针对白细胞进行了调理作用的消耗珠子修正血液样品减少了免疫测定的白细胞干扰。参见美国专利申请12/620，179和12/620，230，将其整体通过引用并入本文。本发明涉及磁性消耗珠子用于在免疫测定中减少或消除因白细胞的存在而引起干扰的用途。具体地，本发明涉及在分析物测定中减少来自白细胞的干扰的方法，包括在足以将生物样品中的白细胞的至少一部分结合至磁性消耗珠子的条件下，将包含白细胞的生物样品与针对所述白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子接触，以及通过磁性保留磁性消耗珠子而基本上不与免疫传感器接触。这样，结合至磁性消耗珠子的白细胞被阻止与免疫传感器接触，从而减少或消除了白细胞干扰。如本文中所用，当用于描述消耗珠子时，术语“磁性的”意指珠子易于被磁场移动或其本身产生磁场。
图8显示用于测定分析物例如心脏功能的标志物例如BNP和TnI的存在和量、和将磁性受调理作用的消耗珠子用于减少白细胞干扰的安培计免疫测定的原理。将液体样品例如血液样品导入免疫测定筒，并用涂覆的干试剂修正。干试剂包括消耗珠子102，其在溶解于样品中后选择性结合可包含在样品中的白细胞103。一旦消耗珠子具有结合白细胞的机会，那么施加磁场以将珠子保留在基本上不与免疫传感器接触的区域，从而减少或消除了免疫传感器上的白细胞干扰。
因此，在优选实施方案中，本发明用于下列领域的一个或多个领域:免疫传感器，最明显地在及时现场护理测试的情景中；电化学免疫测定；与免疫-参考传感器结合的免疫传感器；全血免疫测定；基于一次性使用的筒的免疫测定；仅具有单一洗涤步骤的非相继免疫测定和干试剂涂层。值得注意地，虽然上述的美国专利申请公布2006/0160164( “‘164申请”)基于在免疫传感器上添加抗人血清白蛋白抗体涂层和向测定介质添加盐解决了与白细胞相关的一些干扰，但本说明书公开了与白细胞相关的偏差的另外的来源，提供了用于减少所述干扰的新型解决方法。如将被本领域技术人员理解的一样，此处公开的一般概念适用于许多免疫测定法和平台。
因此，在优选实施方案中，本发明可用于下列领域的一个或多个领域:免疫传感器，最明显地在及时现场护理测试的情景中；电化学免疫测定；与免疫-参考传感器结合的免疫传感器；全血免疫测定；基于一次性使用的筒的免疫测定；仅具有单一洗涤步骤的非相继免疫测定和干试剂涂层。值得注意地，虽然上述的美国专利申请公布2006/0160164( “‘164申请”)基于在免疫传感器上添加抗人血清白蛋白抗体涂层和向测定介质添加盐解决了与白细胞相关的一些干扰，但本说明书公开了与白细胞相关的偏差的其它来源，提供了用于减少所述干扰的新型解决方法。如将被本领域技术人员理解的一样，此处公开的一般概念适用于许多免疫测定法和平台。
本发明允许使用筒快速原位测定分析物，所述筒具有分析物传感器的阵列和用于将修正的样品相继呈递至免疫传感器或分析物阵列的装置。在优选实施方案中，本发明用于经设计利用读数设备来进行操作的筒，例如1992年3月17日授予Lauks等人的美国专利5，096，669 (上文中提及的)或2008年9月2日授予的美国专利7，419，821 (上文中提及的)(将所述两个专利通过引用整体并入本文)中公开的。本发明在该情景中得到最佳理解。因此，首先描述用于及时现场护理免疫测定系统的适当设备和操作方法，然后描述如何可使所述系统最好地适合在全血免疫测定中进一步减少或消除白细胞干扰。
在不同的实施方案中，本发明用于基于在电极表面上或其附近形成夹心的异质电化学免疫测定。然而，在其它实施方案中，本发明是免疫测定的其它形式。例如，可将本发明的磁性消耗珠子用于基于异质或匀质珠子的测定，以及用于非竞争性(夹心)免疫测定或竞争性免疫测定。在该情景中，术语“异质的”和“匀质的”是指捕获步骤。因此，对于匀质测定，捕获步骤在流体介质中发生，然而在异质测定中，捕获步骤在宏观表面例如传感器表面(以竞争性或非竞争性方式)上发生。在这类实例的每一个实例中，当在血液样品中进行测定时，测定珠子易受白细胞攻击。在竞争性和非竞争性测定中，该效应可通过添加针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子来减小。在图21举例说明的异质竞争性测定中，存在于样品中的(未标记的)分析物与标记的分析物竞争固体表面例如传感器组件上的结合位置。利用大量由相同的缀合至标记物的分析物即标记的分析物组成的试剂修正怀疑包含目标分析物(样品分析物)的样品。标记物可以是染料或任何信号产生性组件(element)，例如酶例如ALP。在一些示例性实施方案中，可用选自放射性标记物、酶、生色团、荧光团、化学发光物质、离子载体和电活性物质的标记物标记所述标记的分析物。在另一个实施方案中，用选自荧光素、二茂铁(任选地羧化二茂铁或二羧酸二茂铁或氨基二茂铁)和对氨基苯酚的标记物标记标记的分析物。通常通过竞争性测定法鉴定和/或测量的分析物包括治疗剂、例如地高辛、茶碱以及生物标记物例如C反应蛋白(CRP)以及苯巴比妥、苯妥英、丙戊酸和万古霉素。在优选实施方案中，样品分析物选自地高辛、苯巴比妥、苯妥英、茶碱、丙戊酸和万古霉素。在本发明的一个实施方案中，将修正的样品与其上固定了针对目标分析物的抗体的固体表面接触。样品携带的分析物和标记的分析物竞争在该固体表面上的结合，这样标记的分析物的量和从其产生的信号的量与原始样品中的分析物的浓度成反比。在从传感器表面洗去非特异性结合的材料后，测量标记物的量。在酶标记物的情况下，这可包括给酶提供适当的底物和检测产物(通过例如电化学或光学方式)。当用于异质竞争性免疫测定时，在与固体表面即传感器接触之前，优选用针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子(例如，IgG涂覆的磁性微粒)修正血液样品。1.筒在不同的实施方案中，本发明涉及用于处理液体样品以测定分析物在样品中的存在或量的筒和方法。优选地，装置是一次性使用的筒，例如，充满单种样品，用于测试一次，随后弃去。参考图，本发明的筒包括罩子(cover),其实施方案不于图1和2,底座(base),其实施方案示于图4中，置于底座与罩子之间的薄膜粘着垫圈，其实施方案示于图3中，以及包括永久磁铁或电磁铁的磁铁区域，其实施方案不于图5和6中。磁场应当在离开实际免疫传感器的筒的区域中产生。磁铁区域可直接相邻免疫传感器例如数毫米(例如，l_25mm或1-1Omm)，或位于样品进入端口与免疫传感器之间的任何其它位置。然而优选地通过磁场在传感器的上游捕获珠子，捕获可任选地在下游。重要特征是捕获位于离开导管的其中传感器运行的区域。磁铁可以是筒中的永久性固定装置，或在另一个实施方案中，可提供于与筒相配操作的仪器(读数器)内。因此，在一些实施方案中，筒可以包括磁性消耗珠子，但不包括磁场产生元件。参考图1，罩子I由坚硬材料(优选塑料)制造，并且能够在柔性铰链区5、9、10上反复变形而不破裂。罩子包括盖子2，其通过柔性铰链9连接至罩子的主体。在操作中，在将样品导入样品保持室34后，盖子可紧固在样品进入端口 4的入口上，阻止样品渗漏，通过钩3将盖子保持在原位。罩子还包括两个桨(paddle)6、7，其相对于罩子的主体可移动，并且通过柔性铰链区5、10连接至罩子。在操作中，当利用泵装置操作时，桨6对由被薄膜垫圈21覆盖的腔43组成的气囊施加力，以排出筒的导管内的流体。当通过第二泵装置操作时，桨7对垫圈21施加力，所述垫圈由于在其中切割的裂缝22而变型。筒经改造适合于插入读数装置，从而具有多个用于该目的的机械和电连接。在本发明的另一个实施方案中，筒的手工操作是可能的。在将筒插入读数装置后，垫圈将压力传递至位于腔42中的包含流体的箔袋(装有约130 μ L的分析/洗涤溶液(“流体”))，从而刺破尖状物38上的包装，将流体排入导管39，所述导管通过底座中的短横向导管连接至传感器导管。分析流体填充分析导管的前端，首先将流体推至带垫圈中用作毛细管栓的小开口。施加至筒的分析仪器械的其它运动用于将一个或多个区段例如空气区段在分析导管内受控的位置处注射入分析流体。这些区段用于帮助以最少的流体洗涤传感器表面和周围的导管。在本发明的某些实施方案中，罩子还包括被柔性薄膜8覆盖的孔。在操作中，对薄膜施加的压力将一个或多个空气区段通过垫圈上的小孔28排入导管20。参考图2，底座的下表面还包括第二导管11，和第一导管15。第二导管11包括缢缩12，其通过提供对流体流动的阻抗来控制流体流动。任选的涂层13，14提供了疏水表面，其与垫圈孔31、32—起控制第二与第一导管11，15之间的流体流动。底座中的凹陷17提供了用于导管34中的空气经垫圈中的孔27通过导管34的路径。参考图3，薄膜垫圈21包括多个孔和裂缝来帮助底座与罩子内的导管之间的流体转移并且在必要时允许垫圈在压力下变形。因此，孔24允许流体从导管11流入废料室44 ；孔25包括导管34与15之间的毛细管栓；孔26允许空气在凹陷18与导管40之间流动；孔27提供了凹陷17与导管34之间的空气流动；孔28允许流体从导管19经任选的可关闭阀门41流至废料室44。孔30和33允许分别安放在切除物(cutaway) 35和37内的多个电极与导管15内的流体接触。在具体的实施方案中，切除物37安放接地电极和/或对-参考电极，切除物35安放至少一个分析物传感器和任选地电导测定传感器。如图3中所示，胶带21在22上切开，以允许被3个切口 22围绕的胶带在仪器向下施力时变形以在钩38上破裂组件42内的校准物小袋。还在23上切割胶带，这允许当仪器提供向下的力时胶带向下弯曲进入组件43中，从而将空气从室43排出，并且使样品流体通过导管15朝向传感器移动。图3中的组件29用作连接罩子图2与底座图4中的区域的胶带中的开口。如图4中所示，导管34是连接样品进入端口 4至装配的筒中的第一导管11的样品保持室。切除物35安放分析物传感器或分析物反应表面以及任选的电导测定传感器。切除物37安放接地电极(需要时)作为电化学传感器的返回电流通路，并且还可安放任选的电导测定传感器。切除物36在垫圈孔31与32之间提供了流体路径，以便流体可通过第一与第二导管之间。凹陷42在装配的筒中安放包含流体的包装，例如可破裂的小袋，所述包装由于在插入读数装置后施加在桨7上的压力而被尖状物38刺破。来自刺破的包装的流体流入39上的第二导管。气囊由凹陷43 (在其上表面上被垫圈21密封)组成。气囊是泵装置的一个实施方案，并且由施加至桨6的压力驱动，其将空气排入导管40中，从而样品从样品室34排至第一导管15中。在筒的某些实施方案中，在底座塑料部件中提供用于计量样品区段的装置。样品区段尺寸受到底座中的区室的尺寸和毛细管栓以及带垫圈中的通气管孔的位置控制。该体积可容易地从0.0Ol至1000 μ L变化，例如I至500 μ L和2至200 μ I。样品尺寸的该范围的额外扩大在本发明的情景中是可能的。
在一些实施方案中，流体被推着通过分析前导管11，其可用于修正试剂(例如，磁性消耗珠子、非磁性消耗珠子、可溶性分子、IgM或其片段，或其组合)加入样品(在其出现在传感器导管19中之前)。或者，修正试剂可位于部分15中，部分16之外。推动样品通过分析前导管也用于将张力导入膈膜泵桨7，这促进其对流体排出的驱动的反应性。筒在其中运转的系统通常允许样品与试剂保持接触持续预定时间段例如I至30分钟。
空气从气囊进入样品保持室(垫圈孔27)的位置以及毛细管栓25 —起确定了样品保持室的预定体积。当桨6被压下时，相应于该体积的样品的量被排入第一导管。该排列是用于递送计量的量的未计量的样品至筒的导管内的计量工具的一个可能的实施方案。
根据本发明的某些实施方案，如果需要定量分析物，则计量是有利的。如图4中显示的，为从导管排出的样品和/或流体提供了废料室44，以防止对筒的外表面的污染。还提供了连接废料室与外部大气的排气口 45。本发明的筒的一个期望的特征是一旦加载了样品，可完成分析，并且可弃去筒而操作者或其他人不接触样品。
图5是根据本发明的实施方案的筒和其组件的示意图，其中51-57和65是可任选地用干试剂涂覆以修正样品或流体的导管和样品室的部分。将生物样品或流体在干试剂上方通过至少一次以溶解它。用于修正样品的试剂可包括如下的一种或多种:针对白细胞进行调理作用的本发明的磁性消耗珠子、非磁性消耗珠子、抗体-酶缀合物(信号抗体)、一种或多种杀白细胞剂、IgM和/或其片段、IgG和/或其片段，和/或阻止测试化合物间的特异性或非特异性结合反应的其它封闭试剂。在一个实施方案中，试剂包括磁性消耗珠子和非磁性消耗珠子。在某些实施方案中还可利用不溶性的但帮助阻止测定组分对筒的内表面的非特异性吸附的表面涂层。
如图5和6中所示，装置包括磁铁区域65，其包括磁铁，用于保留磁性消耗珠子和任何相关结合的白细胞而基本上不与免疫传感器(例如免疫传感器的上游)接触。磁铁区域65可包括例如在磁铁区域65的表面上方或下方整合入筒的永久磁铁或电磁铁。在一些实施方案中，磁铁位于与导管的指定区域相邻的设备中。在其它实施方案中，将磁铁包埋在筒体内。在图5中显示的优选实施方案中，将磁铁置于样品保持室与传感区域之间的区域中的筒体内。
在具体的实施方案中和如图5中所示，在第一导管与废料室之间提供了可关闭的阀门。在一个实施方案中，该阀门58由用不能渗透的物质涂覆的干燥海绵材料组成。在操作中，将海绵材料与样品或流体接触导致海绵的膨胀以充满腔41(图4)，从而实质上阻断液体至废料室44的进一步流动(图4)。湿润的阀门也阻断第一导管与废料室之间的空气流动，这允许连接至样品室的第一泵装置排出第二导管内的流体，以及将流体从第二导管排出至第一导管中。
图6显示了本发明的一个实施方案的免疫传感器筒的示意性布局，其中提供了 3个泵61-63。虽然这些泵已根据具体的实施方案进行了描述，但可容易地理解，能够进行泵61-63的各自功能的任何泵设备可用于本发明中。因此，泵1，61，应当能够将样品从样品保持室排出至第一导管中；泵2，62应当能够排出第二导管内的液体；泵3，63应当能够将至少一个区段插入第二导管。本申请中所设想的其它类型的泵包括但不限于:与气动装置接触的气囊(从而对气囊施加压力)、柔性膈膜、活塞和气缸(cylinder)、电动力学泵以及振动泵(sonic pump)。参考泵3，63，术语“泵”包括通过其可将一个或多个区段插入第二导管的所有设备和方法，例如用于将空气从气囊排出的气动装置、当溶解时产生气体的干化学品，或多个可操作地连接至电源的电解电极。在具体的实施方案中，使用可具有超过一个气囊或小室的机械区段产生性膈膜产生区段。如所显示的，孔8具有单个开口，所述开口连接内膈膜泵与流体充满的导管(将向所述导管内注射区段)20。可分割膈膜以产生多个区段，每一个区段被注射在流体充满的导管内的指定位置中。在图6中，组件65表示磁铁区域，组件64表示这样的区域:其中免疫传感器进行捕获反应以形成包含固定的抗体、分析物和信号抗体的夹心。
在本发明的替代性实施方案中，使用被动部件注射空气区段。通过带垫圈密封筒的底座中的孔。覆盖孔的带垫圈在任一末端上具有两个孔。一个孔是打开的，而另一个被过滤材料覆盖，所述过滤材料当与液体接触后变湿。用疏松亲水材料例如纤维素纤维滤器、滤纸或玻璃纤维滤器充满孔。该亲水材料通过毛细管作用将液体吸入底座中的孔内，将先前存在于孔中的空气排出。空气通过带垫圈中的开口排出，从而产生了区段，区段体积通过孔的体积和疏松亲水材料的空体积(void volume)确定。可选择用于覆盖至底座中的孔的进口之一的滤器以计量流体填充孔的速率，从而控制区段被注射入罩子中的导管的速率。该被动装置允许任意数目的受控区段被注射在流体路径中的指定位置并且需要最小的间隔。
如上所述,本发明的筒优选包含计量装置(metering means),其允许导入未计量体积的样品，筒和其连接的读数装置通过该计量装置处理计量的量。因此，使医生或操作者在测量之前免除了手工测量样品的体积，从而节省了时间、人工投入以及增加了准确性和重现性。在一个实施方案中，计量装置包括连接有毛细管栓并且沿着其长度具有空气进入点的延长的样品室。在空气进入点上施加的空气压力驱动计量体积的样品通过毛细管栓。计量的体积由空气进入点与毛细管栓之间的样品室的体积预先确定。
筒可具有用于以气密方式封闭样品端口的关闭设备。该关闭设备优选相对于筒的主体是可滑动的并且可提供移除位于端口区域的任何过量样品的剪切作用，从而可靠地封闭进入端口与毛细管栓之间的保持室中的样品的一部分。参见，例如，美国专利7，682，833将其完整内容通过引用并入本文。在一个实施方案中，筒可以是密封的，例如，以将过量流体样品从样品口移除的方式将密封组件滑动地移动至筒的表面上，将一定体积的流体样品封闭在内部流体样品保持室内，并且抑制流体样品过早地冲破内部毛细管栓。通过该可滑动关闭设备获得的密封优选是不可逆的并且防止过量血液被捕获在筒中，因为关闭设备在口(血液通过其进入筒)的平面上移动并且提供将血液封闭在进入端口的平面下的剪切作用，从而将过量血液即口的平面上方的血液从进入端口移除以及任选地将其转移至废料室。
本发明的一个实施方案的示例性关闭设备示于图1中并且包括罩子I的集成组件2、3、4和9。在该实施方案中，关闭设备2围绕铰链旋转直至钩3咬锁住，从而封闭样品进入端口 4。包括图1中的罩子I的集成组件2、3、4和9的关闭设备的另一选择显示为图15和16中的独立滑动组件200。图15和16显示了包括图1的罩子的改进形式的筒设备，其附着于与图4中的底座相似的底座，所述底座具有图3中显示的插入粘附层21和独立的可滑动关闭组件200。图16显示了打开位置下的关闭设备200，其中样品进入端口 4可接收样品，例如血液。图15显示了关闭位置下的关闭设备200，其中其以气密方式封闭样品进入端口。在操作中，在已将样品例如血液添加至进入端口并进入保持室34后，手工将组件200从打开位置推至关闭位置。在显示的实施方案中，将进入端口的区域中的任何过量血液移入溢流室201或相邻的保留区域或腔。该室或区域可包括保留过量样品例如血液的流体吸收垫或材料。样品进入端口 4可以是环状(如图16中显示的)或椭圆形的口，并且口的直径通常在0.2-5_，优选1-2_的范围内，或具有1-15_(对于椭圆形)的周长。围绕口的区域可选择为疏水性或亲水性的以控制施用的样品的滴形，从而促进向进入端口内的进入。图15和16中显示的关闭设备的一个有利方面是其防止样品被推送超出保持室34末端上的毛细管栓组件之外。少量样品例如血液在毛细管栓之外的存在对于测量分析物的主要浓度的测试并不重要，因此不依赖于样品体积。然而，对于免疫测定应用(其中样品的计量通常为有利的)，密封组件提高设备的计量准确性并且确保当分析仪在筒导管内推动样品时，样品的被测定区段相对于免疫传感器被适当地定位。在操作中，当将样品例如血液添加至筒中时，其移动至毛细管栓。因此，当毛细管栓至样品进入端口的区域即保持室34包含样品时，存在用于测试的充足样品。在填充保持室的过程中，一些样品可保留在进入端口的口的平面上方。当将密封组件从打开移动至关闭位置时，进入端口上方的任何样品被剪切掉而不在关闭行动中捕获额外的样品，从而确保样品不移动至毛细管栓25之外。在优选实施方案中，密封组件200位于图3的带垫圈21的表面上方数千分之一英寸内。通过随后使200的表面下降至粘着带垫圈(当其啮合锁闭部件212和213时)来封闭进入端口。由于所述带是基本上不可压缩的并且所述口的直径小，因此被用户施加至密封组件的任何不经意的压力将不会使样品移动至毛细管栓之外。在某些其中分析几滴样品的筒的实施方案中，不希望在保持室中形成气泡，因为这可影响测定。因此，已开发了用于将超过一滴样品例如血液导入保持室34而不产生气泡的可靠方法。根据本发明的一个实施方案，样品进入端口被设计为接收多滴样品，通过首先用Corona和/或试剂混合物处理保持室，使得连续液滴不会在保持室34中引起捕获的气泡形成。对一次性医疗设备使用COTona处理在本领域是公知的，并且是增加实际上任何材料例如金属化表面、箔、纸、纸板原料(paperboard stock)或塑料例如聚乙烯、聚丙烯、尼龙、乙烯树脂(vinyl)、聚氯乙烯(PVC)和聚对苯二甲酸乙酯(PET)的表面活性的有效方法。Corona处理使得材料更易接收墨水、涂层和粘合剂。在实践中，将被处理的材料暴露于放电或“corona”。放电区域中的氧分子断裂成原子并且结合至被处理的材料中的分子，从而导致化学活化的表面。用于Corona处理的适当设备是商购可得的(例如Corotec Corporation., Farmington, Connecticut, USA)。过程变量是公知的并且包括例如，处理材料所需的功率的量、材料速度、待处理的面的宽度、数目以及具体材料对COTona处理的反应性。常见Corona处理的安装位置与打印、涂覆或成层(laminating)过程是一致的。另一种常见安装是直接在吹塑薄膜(blown film)或铸制薄膜(cast film)挤压机上，因为新鲜材料相对更易接收Corona处理。本发明的筒具有下列优点:样品和第二流体可在测定顺序中在不同的时间接触传感器阵列。还可利用最初作为干涂层存在于各导管内的其它试剂或化合物独立地修正样品和第二流体。筒内液体的受控运动还允许超过一种物质被修正进入每一种液体，而无论样品或流体何时移动至导管的新区域。这样，给每一种流体提供了多个修正，从而极大地扩大了可进行的自动化测定的复杂性，从而增强了本发明的效用。
在本发明的一些实施方案中，筒是一次性的。在一次性筒中，优选使包含的液体的量保持少量以使成本和尺寸降至最低程度。在本发明中，导管内的区段还可用于通过使区段的空气-液体界面通过待漂洗的传感器阵列或其它区域至少一次来帮助清洁和漂洗导管。已发现，与利用更大体积的液体的连续漂洗相比较，利用该方法实现了更高效的漂洗(使用更少的流体)。
导管内的限制在本发明中适用于几个目的。在一个实施方案中，位于样品保持室与第一导管之间的毛细管栓被用于通过阻止保持室中的样品转移(直至施加足够的压力来克服毛细管栓的阻抗)来促进样品计量。在另一个实施方案中，第二导管内的限制用于使洗涤流体沿着替代途径转向朝向废料室(当流体到达缢缩时)。垫圈中的小孔与疏水涂层一起被提供以阻止从第一导管至第二导管的流动直至施加足够的压力。将液体流动控制在本发明的导管内和导管之间的部件在本文中统称为“阀门”。
本发明的一个实施方案提供了一次性使用的筒，其具有连接至第一导管(其包含分析物传感器或分析物传感器的阵列)的样品保持室。将部分地包含流体的第二导连接至第一导管并且可在第二导管的流体中导入空气区段以分割它。提供泵装置以替代第一导管内的样品，并且这将流体从第二导管移入第一导管。因此，可将传感器首先与样品接触，随后与第二流体接触。
在另一个实施方案中，筒包括位于第一导管与废料室之间的可关闭阀门。该实施方案允许只使用连接至第一导管的单个泵装置将流体从第二导管移入第一导管。该实施方案还允许高效地洗涤本发明的筒的导管，这是小型一次性使用的筒的重要特征。在操作中，样品被排出以接触传感器，随后被排出通过可关闭阀门而进入废料室。在湿润后，可关闭阀门密封对废料室的开口，从而提供了气密密封，其允许只使用连接至第一导管的泵装置抽取第二导管中的流体使其与传感器接触。在该实施方案中，可关闭阀门允许以该方式排出流体并且阻止空气从废料室进入第一导管。
在另一个实施方案中，提供了可关闭阀门和用于将区段导入导管的装置。该实施方案可具有许多有利方面，所述有利方面之一是在传感器或传感器的阵列上互换分段的流体的能力。因此将第一区段或区段组用于漂洗传感器，随后新鲜区段替代其以进行测量。只需要一个泵装置(连接至第一导管)。
I1.信号产生性反应
如上所述，非竞争性(夹心)免疫测定形式是最广泛使用的免疫测定法，并且是本发明的分析设备例如筒的优选形式。在该实施方案中，将一种抗体(固定的抗体)结合至固体载体或免疫传感器上，将第二抗体(信号抗体)缀合/结合至信号产生性试剂例如酶，例如碱性磷酸酶。
简而言之，图17显示了在分析过程中发生的信号产生性反应，图17(a)显示底物被碱性磷酸酶切割以产生电活性的对氨基苯酚，图17(b)显示对氨基苯酚的氧化。图17(a)中的反应在传感器结构的上层发生而图17(b)中的反应在金电极表面发生。图17(a)中的插图显示碱性磷酸酶催化的水解的PH-依赖性。中间的图描述了暴露于样品之前的免疫传感器结构的总体特征。信号产生性试剂(例如，用于非竞争性测定的信号抗体或用于竞争性测定的标记的分析物)可以是分析设备中的干试剂涂层的一部分(如下文中描述的)，并且优选在样品到达免疫传感器之前溶解在生物样品中。对于非竞争性测定，在洗掉样品和非特异性结合的试剂后，保留在固体载体上的信号产生性试剂(例如，信号抗体)的量原则上应当与样品中的分析物的量成正比。对于竞争性测定，如上所论述的，在洗去样品和非特异性结合的试剂之后，保留在固体载体上的信号产生性试剂(例如，标记的分析物)的量原则上应当与样品中的分析物的量成反比。然而，此类测定构型的一个限制是对于由存在于样品中的白细胞引起的干扰的易感性。在替代实施方案中，缀合至抗体或其它分析物-结合分子的酶是脲酶，并且底物是尿素。通过使用铵灵敏电极在本实施方案中检测到了通过尿素的水解产生的铵离子。铵特异性电极对于本领域技术人员来说是公知的。例如，适当的微制造的铵离子选择性电极公开于美国专利5，200，051 (通过引用并入本文)中。与底物反应以产生离子的其它酶在本领域是已知的，对于与其一起使用的其它离子传感器在本领域也是已知的。例如，可在磷酸根离子选择性电极上检测到从碱性磷酸酶的底物产生的磷酸根。II1.磁性消耗珠子在本发明的不同实施方案中，用针对白细胞特异性进行调理作用的“消耗”或“诱馆”磁性珠子修正生物样品，例如血液样品。在优选实施方案中，将磁性消耗珠子与样品均匀混合。在其它实施方案中，可将磁性消耗珠子与样品不太均匀地混合，然而希望捕获尽可能多的白细胞。磁性消耗珠子的利用允许在样品到达免疫传感器之前从生物样品基本上除去白细胞。例如，在一个实施方案中，与上述夹心测定法类似，将磁性消耗珠子与生物样品例如血液(任选地也与酶标记的第二抗体)在筒的保持室中混合。随后振荡样品(任选地在保持室中)以促进混合，在该过程中白细胞开始与受调理作用的磁珠结合。混合可进行预定的时间，例如进行测定循环的前I至5分钟。在测定的下一步骤中，使样品通过导管向免疫传感器移动。如先前所描述的，免疫传感器具有分析物的捕获抗体。在相对于免疫传感器靠近保持室的导管的区域，磁珠进入磁铁区域，在该区域中施加的磁场足以保留大部分，优选基本上全部，例如，至少50wt.%、至少75wt.%、至少85wt.%或至少90wt.%的消耗珠子在流体外，并且有效地将它们吸附至磁铁区域(通常导管)的壁上。实质上，当筒中的泵被开动并且将样品通过导管向前移动时，磁性消耗珠子能够抵抗气动力并且因磁铁施加的磁场而保留在磁铁区域中。样品的剩余部分继续到达免疫传感器区域。在于免疫传感器(对于异质非竞争性实施方案)上形成夹心后，优选将血液样品洗入废液室，添加与标记物例如ALP反应的试剂。在一些实施方案中，磁场可由与导管的指定区域相邻的仪器中的永久磁铁或电磁铁产生。在其它实施方案中，将磁铁埋入筒体内。用于本发明的磁铁可以是本领域已知的任何形状、尺寸和磁性材料。在图5中显示的优选实施方案中，将磁铁在样品保持室与传感区域之间的磁铁区域65中定位在筒体内。在所有此类实施方案中，磁铁与磁性消耗珠子之间的相互作用阻止了样品中的大部分白细胞到达导管的免疫传感器区域。在本说明书中，术语“基本上的”或“基本上地”意指大于50wt.%的量。
磁性消耗珠子可由本领域已知的对磁铁例如永久磁铁或电磁铁(用于本发明的设备中或与本发明的设备配合使用的)易感的任何材料组成。在本发明的一些实施方案中，消耗珠粒包括磁性核心，其优选用涂层材料完全或部分涂覆。磁性核心可包含如下物质的一种或多种:Fe、Co、Mn、N1、包含一种或多种此类元素的金属、此类元素的有序合金、由此类元素组成的晶体、磁性氧化物结构例如铁氧体及其组合。在其它实施方案，磁性核心可由磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿U-Fe2O3)或由式Mei_x0Fe3+x03提供的二价金属-铁氧体组成，其中Me为例如Cu、Fe、N1、Co、Mn、Mg或Zn或此类材料的组合，并且其中x的范围为0.01至99。
用于涂层的适当材料包括合成聚合物和生物聚合物、共聚物以及聚合物混合物，和无机材料。聚合物材料可包括丙烯酸酯、硅氧烷、苯乙烯、醋酸酯、烯基二醇(akyleneglycols)、烯基、烯基氧化物、聚对二甲苯(parylene)、乳酸和乙醇酸的聚合物的各种组合。无机涂层材料可包括金属、金属合金和陶瓷的任何组合。陶瓷材料的实例可包括羟磷灰石、碳化硅、羧化物、磺酸盐、磷酸盐、铁氧体(ferrite)、膦酸盐和元素周期表的IV族元素的氧化物。在本发明的优选实施方案中，磁珠由磁铁矿(Fe3O4)组成并且利用苯乙烯-丙烯酸共聚物进行了涂覆，以提供被羧基修饰的表面。
在本发明的其它实施方案中，磁性消耗珠子包括在例如选自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料上涂覆磁性涂层而形成的非磁性基质珠子。
原则上，通过考虑磁性消耗珠子的分散性需要，可在本发明中使用能够针对白细胞进行调理作用的任何适当大小的磁珠。在相同的示例性实施方案中，磁性消耗珠子的平均粒度的范围可以是0.01至20 μ m,例如0.1至ΙΟμπι, I至5μηι或3至5μηι。如本文中所用，术语“平均粒度”是指颗粒的平均最长尺度，例如球状颗粒的直径，如通过本领域公知的方法测定的。磁性消耗珠子的粒度分布优选是单型的，虽然根据本发明也可使用多型分布。
虽然球状磁珠的使用是优选的，但在其它实施方案中，其它珠子形状和结构例如椭圆形、长球形(sub-spherical)、圆柱形和其它不规则形状的颗粒在如本文中使用和定义的术语“珠子”以及术语“微粒”的含义内。
磁性珠子 可以被多种表面涂层材料涂覆，以便表面涂层在暴露于待测定的样品后进行调理作用或可进行调理作用。在一些实施方案中，利用分离自动物种类的非人IgG(IgG种类的免疫球蛋白)或其片段涂覆消耗珠子。如本文中所用，术语“片段”是指来源于指定分子的任何携带表位的片段。因此，IgG片段可包含例如携带表位的F(ab’)2 *Fab片段或Fe片段。此外，短语“IgG或其片段”意在包括:仅￥、仅IgG片段(即，IgG的F(ab’)2片段、Fab片段和/或Fe片段中的一个或多个)或IgG和IgG片段的组合。在本发明的优选实施方式中，使用山羊或绵羊IgG涂覆的颗粒,虽然可使用其它IgG来源例如小鼠或兔IgG。
除了使用完整IgG分子涂覆磁性消耗珠子以外或并非使用完整IgG分子涂覆磁性消耗珠子(其中从连接至F(ab' )2区域的Fe区域形成单个单层，这继而包含两个Fab区域)，还可以使用如上定义的IgG的片段。IgG片段化可使用二硫键还原(-S-S-至-SHHS-)与酶促胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化的组合以产生F(ab’ )2片段、Fab片段和/或Fe片段的一些组合来不同地实现。可通过层析分离这些片段以单独使用，或组合使用。例如，当封闭位点位于Fe片段上时，可使用片段而不使用完整IgG分子。这同样也适用于Fab片段和F(ab’)2片段。可使用利用IgG涂覆的相对更小的消耗珠子，例如具有小于0.2μηι的平均粒度的消耗珠子，但优选IgG-涂覆的磁性消耗珠子的平均粒度在3-5 μ m的范围内。本领域技术人员将认识到，可在导入筒之前，将本发明的磁珠添加至生物样品，例如作为血液收集设备的整合部分或作为标准手工的额外步骤。然而，为了用户方便起见和为了确保质量测定，优选将磁珠包括在测试设备中。在一个实施方案中，将磁性消耗珠子掺入干试剂涂层。在一些实施方案中，可用包含非人IgG-涂覆的磁性消耗珠子的干试剂涂覆至少一部分筒框架。重要特征是干试剂能够溶解于样品中并且在结合中啮合白细胞。这通常足以隔离样品中的潜在干扰性白细胞。在某些实施方案中，将磁性消耗珠子掺入相同的干试剂涂层，所述干试剂涂层包含信号产生性试剂(例如，对于非竞争性测定为信号抗体；对于竞争性测定为标记的分析物)。因此，在本发明的一个实施方案中，分析设备包括干试剂涂层，所述涂层包含如下组分之任一或两者:(a)适合于缓解白细胞的效应的组分，例如用IgG或其片段涂覆的磁性消耗珠子，和/或(b)信号产生性试剂例如信号抗体或标记的分析物。本发明还涉及进行生物样品中的靶分析物的免疫测定的方法。在一个实施方案中，方法包括进行分析物夹心免疫测定，包括将包含白细胞的血液样品引入测试筒中的保持室，其中用针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子涂覆一部分保持室；在足以将生物样品中的至少一部分白细胞结合至磁性消耗珠子的条件下将血液样品与磁性消耗珠子接触；将血液样品移至导管内；施加定位于导管的至少一部分的磁场以吸引磁性消耗珠子并且将其保留在导管壁的至少一部分上，从而基本上阻止磁性消耗珠子与免疫传感器接触；将血液样品与免疫传感器接触以形成包含固定的捕获抗体、样品分析物和标记的信号抗体的夹心；从免疫传感器洗涤血液样品；以及将免疫传感器与能够与所述标记的信号抗体反应的试剂接触，以在免疫传感器上产生与样品分析物在血液样品中的存在相关的信号。该相同的一般方法也适用于竞争性免疫测定。在上文中对于夹心测定所述的基本上相同的筒形式中，在于免疫传感器(对于异质竞争性测定)或在流动颗粒(对于均质竞争性测定)上存在的分析物和标记的分析物的竞争性结合之前，白细胞已通过磁性方法从样品中基本上除去。进行异质竞争性分析物免疫测定的细节包括步骤:将包含白细胞的血液样品导入测试筒的保持室，其中用针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子涂覆保持室的一部分；在足以将生物样品中的至少一部分白细胞结合至磁性消耗珠子的条件下将血液样品与磁性消耗珠子接触；将血液样品移至导管内；施加定位于导管的至少一部分的磁场以吸引磁性消耗珠子并且将其保留在导管壁的至少一部分上，从而基本上阻止磁性消耗珠子与免疫传感器接触；将血液样品与免疫传感器接触以形成结合的样品分析物与结合的标记的分析物的竞争性比率；从免疫传感器洗涤血液样品；以及将免疫传感器与能够与标记的分析物反应的试剂接触，以在免疫传感器上产生与样品分析物在血液样品中的存在反相关的信号。IV.添加剂
在本发明的一些实施方案中，可将添加剂包含在筒中或与测定结合使用。在某些实施方案中，可添加抗凝剂。例如，在一些实施方案中，添加肝素以便在未将样品收集在肝素化的管或未将样品在肝素化的管中正确混合的情况下提高性能。添加充足量的肝素以便新鲜未肝素化的血液在筒的测试循环过程中(通常在2至20分钟的范围内)保持不凝固。在其它实施方案中，可添加山羊和小鼠IgG以抵抗免疫测定领域中已知的嗜异性抗体问题。在其它实施方案中，可添加proclin、DEAE-葡聚糖、tris缓冲液和拉克替醇的一种或多种作为试剂稳定剂。在其它实施方案中,可添加表面活性剂例如也称为Tween 20的聚山梨醇酯20以减少蛋白质与塑料(其是用于筒的优选材料)的结合。表面活性剂的添加还促进试剂均匀地涂覆塑料表面并且糖(例如拉克替醇)的结晶减少至最低程度。在本发明的其它实施方案中，可添加抗菌剂或杀生物剂(例如叠氮化钠)以抑制细菌生长。
V.打印混合物的制备和打印
磁珠/微粒可以以多种形式商购获得。磁性核心可以是磁性或超顺磁性材料。通常，用聚合物例如聚苯乙烯、聚丙烯酸或生物聚合物例如淀粉或相似的碳水化合物涂覆核心。磁珠制剂的商业来源包括Invitrogen , Ademtech (Pessac, FR)和ChemicellGmbH(Berlin)。许多此类产品包括表面功能化，其可用于将抗体例如IgG固定在微粒例如-羧基、-氨基或链霉抗生物素蛋白修饰的磁珠上。可将磁性珠子制剂作为例如拉克替醇与 DEAE-葡聚糖的混合物(例如由 Advanced Enzyme Technologies (Pontypool, UK)提供的)中的悬浮物的形式沉积在设备的适当区域。溶剂(通常是水)的蒸发产生其中固定了珠子的玻璃状沉积物。拉克替醇/DEAE-葡聚糖允许微粒在设备内以机械和生物化学上稳定的状态按区域排列，其在接触样品后溶解。
在优选实施方案中，如下制备I升(L)批次的基本打印混合物:将蛋白质稳定溶液(PSS, AET Ltd.，50%固体，100.0g)添加至200_250mL的氯化钠(8.0Og)和叠氮化钠(0.500g)的水溶液中，将所得的溶液转移至IL容量瓶中。通过将鼠IgG(0.9g)添加至75mL去离子水并且搅拌15-60分钟直至完全溶解来制备鼠IgG的溶液。以相同的方式制备同样地浓缩的羊IgG溶液，将两个溶液都通过1.2μ M滤器过滤。从提供商(例如Sigma-Aldrich)获得以液体形式存在的鼠IgM。在280nm处通过分光光度计测量3种免疫球蛋白(Ig)原液的每一种的蛋白质浓度。计算提供鼠IgG(0.75g)、羊IgG(0.75g)和鼠IgM(25mg)所需的这些Ig溶液的质量，将这些量添加至打印溶液中。通过将DEAE-葡聚糖(2.5g)添加至50-100mL的去离子水中并且搅拌30分钟来制备二乙氨乙基-葡聚糖(DEAE-葡聚糖)的溶液。将DEAE-葡聚糖溶液添加至打印溶液。向该溶液中添加肝素钠(10，000IU/mL, 3.0OmL)、Tweeil(H) 20 (3.00g)和 5%(w/v)的罗丹明水溶液(200 μ L)。用去离子水将所得的溶液稀释至1.000L，然后贮存在冷冻室或冰箱直至使用。可在该最终稀释之前或即将沉积至测试设备例如图1-6中显示的任何类型的筒中前添加用于白细胞干扰减少或消除(任选地与IgG涂覆的非磁性珠子组合)的IgG-涂覆的磁珠。
在本发明的不同实施方案中，优选自动化地并基于微分配系统(包括照相机和计算机系统，以对齐组分)打印打印混合物和相似的流体以在筒组分上形成干试剂涂层，如属于Cozzette等人的美国专利5，554，339 ( “ ‘339专利”)(通过引用将其整体并入本文)中所公开的。在‘339专利中，利用轨道(track)替代娃片夹(wafer chuck)以将塑料筒底座输送至分配头(dispensing head)。轨道以预定方向将底座呈递至分配头以确保一致的位置分配。V1.收集和分析根据本发明的各种实施方案，使用样品收集设备例如毛细管、VacutaiiierW.或注射器来获得血液样品。在一个实施方案中，可将磁性消耗珠子掺入在样品收集设备例如毛细管、VaeuiainerW.或注射器中。在一些实施方案中，可在收集设备的内壁上形成磁性消耗珠子涂层。VI1.免疫传感器实施方案和与其相关的方法虽然本发明广泛地适用于免疫测定系统，但其在1-STAT 免疫测定系统(AbbottPoint of C are Inc.，Princeton, New.Jersey, USA)的情景中获得最好的理解,如上文中引述的共同拥有的在审的和授权的专利中所描述的。也参见2009年12月18日提交的标题为 “Foldable Cartridge Housings for Sample Analysis” 的美国专利申请 61/288，189,将其通过弓I用整体并入本文。在不同的实施方案中，所述系统使用免疫-参考传感器(参见，例如上文中提及的属于Miller等人的美国专利申请公布2006/0160164，通过引用整体并入本文)以评估在测定过程中发生的非特异性结合(NSB)的程度。在一些情况下，NSB可因不充分的洗涤或因干扰的存在而产生。来自测定的净信号由从分析物免疫传感器产生的特异性信号(通过扣除从免疫-参考传感器产生的非特异性信号而校正)组成。免疫-参考传感器上的信号的量受制于通过质量控制算法确定的限制。免疫传感器优选用于检测心血管标记物，例如，分析物例如 Tnl、TnT、CKMB、肌红蛋白、BNP、NT-proBNP 和 proBNP。本发明的实施方案改善了1-STAT .免疫测定形式对于由白细胞引起的干扰的抗性。在此类实施方案中，利用本发明的磁性消耗珠子修正生物样品以提供减少的或消除的白细胞干扰。此类实施方案同样地适用于标准ELISA形式，其中细胞存在于分析介质中。虽然常规夹心测定可对具有高白细胞水平的生物样品产生错误结果，但先前的1-STAT⑩系统测定法未报道这些样品的不准确的结果，因为所述系统包括检测假信号的算法，以错误代码警示用户，并禁止结果被显示。这是进行可靠及时现场护理测试所需的质量体系的一个实施方案，其中，分析系统的质量和完整性得到了维持。就本发明的主题而言，发现某些免疫测定测试筒，特别是脑利钠肽(BNP)筒，展示出因先前未知的干扰机制而产生的意外的正和负斜率的波形。分别参见，例如，图9(a)和(b)。这导致关于干扰机制的假说，所述假说是基于，在洗涤步骤中将电极脉冲至正电位的效应的实验。如图9(c)和(d)中所示，基于理论基础预期的正常免疫传感器反应在低分析物浓度下具有接近O的斜率，并且仅在高分析物浓度下预期负斜率，其中测量可变成底物限制性的而非酶限制性的。存在几个引起动态(非稳态)安培计信号的潜在机制。动态电极活性(变化的有效电极区域)是不可能的，因为电极从形成的组件被隔离(因为聚乙烯醇(PVA)层上存在固定的测定珠子(微粒))，两者在血浆样品中都未显示该效应。取决于流体接触，动态层厚度例如上述组分的膨胀或收缩是不可能的，因为对于这样的现象不存在引起正斜率和负斜率的驱动力。酶的动态覆盖(例如，ALP，变化的酶表面浓度)被排除，因为在薄层形式中，在测量的时间标度上，酶(例如，ALP)从传感器的扩散是不可能的。鉴于相对小的分子尺寸并且相对容易扩散(D 5X10_6cm2/s)，酶底物(例如对氨基苯酚磷酸(P-APP))至电极表面的动态运输是不可能的。因此，通过消除的方法并且不希望受理论束缚，动态ALP活性被认为是动态传感器信号的最可能诱因，进行另外的研究以评估所述机制。ALP对于p-APP的水解是PH依赖性的，最佳pH接近pHIO。在一些实施方案中，在筒中，使用9.2的工作pH，因为这种略低的pH值确保免疫复合物的稳定性。此外，电极上对氨基苯酚(P-AP)的氧化是pH依赖性的并且预期pH每减小十进位，电位偏移约+59mV,即在较低的pH下,反应一定更难驱动，即需要增加的应用电位。
在其中打印层因与干扰组分相互作用达到传感器结构内的样品流体(pH7.4)在洗涤步骤中不能完全被分析流体(PH9.2)替代的程度而变得不太可渗透的实施方案中，这将导致亚最适的检测步骤PH，特别是对于在离分析流体的进入点最远的区域上发生的电极反应而言。该受损的流体替代产生随时间而缓和的PH梯度。随着酶和电极反应的相对速率改变，观察到的信号也如此。该技术评估具有重要的有利方面:其为正向和负向斜率的信号提供了解释。参见，例如，图9(a)和(b)。
通过在洗涤步骤中，将脉冲应用至极端电位，例如将脉冲应用至氧化电位，进一步评估下列概念:观察到的干扰与不完全洗涤步骤(因打印层的“堵塞(Plugging) ”或“污染(fouling)”而产生)相关。预期正斜率波形可能由失活阻断的传感器引起，可应用脉冲在分析步骤之前清洁电极。观察到，在正常样品的洗涤步骤期间应用氧化脉冲对观察到的信号和在随后的分析中没有影响。参见图10(a)。然而，在异常高棕黄样品的情况下，脉冲的效应是大且动态的信号，此外，鉴于分析物的浓度，这些信号比预期的要大。参见图10(b)。
在这两种情况下对氧化电位脉冲的反应的差异证明传感器结构内的流体确实不同。如所预期，正确的反应因期望的分析流体在传感器上的存在而引起，而异常反应的产生是因为传感器结构上的流体是血浆，或血浆与分析流体的组合。可如下理解反应的差异:根据:H20 — V202+2H++2e 氧化脉冲导致氧气的产生和pH的减小。
在包含缓冲至pH9.2的分析流体的传感器结构的情况下，在电极上产生的质子在缓冲液(IOOmM的碳酸盐，在分析流体中)存在的情况下被快速消耗。然而，在由分析流体提供的缓冲不存在的情况下，质子维持在电极的区域中，导致酸性流体的羽流(plume)。该酸性羽流导致对氨基苯基磷酸(P-APP)至对氨基苯酚(P-AP)的酸催化水解，产生比预期的更大的信号。具体地，异常波形产生自P-AP，所述P-AP通过酶例如ALP对p-APP的酶促作用以及还有非酶促的酸催化的水解产生。
值得注意的是，对于pAPP，除非氨基如在低pH时那样被质子化，否则不会大量发生酸催化的水解反应。这是因为反应在对位上需要强吸电子取代基(Barnard etal.J.Chem.Soc.(1966)，227-235)。如在本领域是已知的，_ NH2取代基主要提供电子，然而在质子化后，-NH3+取代基变得高度吸电子(甚至比-NO2更强；例如，对于-NH2, Hammetpara-rho 值为-0.66，对于-NH3+ 为 1.70)。
这些实验使观察到的干扰与“高棕黄”样品发生关联并且可有意地通过运行具有“富集的血沉棕黄层”的全血样品来引发。该术语是指当将血液样品离心时在血浆-红细胞边界形成的白细胞和血小板的层。表明白细胞和潜在地血小板作为污染试剂的其它证据示于显微照片图14(a)(不使用消耗珠子或杀白细胞试剂的测定)和14(b)(使用非磁性消耗珠子后的测定)。为了进行比较，图17中显示了与血液样品接触之前的原始免疫传感器。获得了类似的结果，提供了磁珠可从其中免疫传感器所在的区域移开的视觉确认。
图14(a)显示了与高棕黄样品Πθ5个白细胞/yL)接触的传感器，使用标准测量循环和10分钟的传感器温育时间。不将样品与受调理作用的消耗珠子接触。很明显，一部分测定珠子涂覆的传感器表面被不容易通过洗涤步骤被去除的细胞的粘着层覆盖。
相比之下，图147(b)显示了与高棕黄样品Γ105个白细胞/yL)接触的传感器，使用标准测量循环和10分钟的传感器温育时间。然而，与图14(a)中显示的测定相反，将图14(b)中显示的样品与受调理作用的(IgG涂覆)消耗珠子(其为非磁性的)接触。很明显，在洗涤步骤后，测定珠子-涂覆的传感器表面的一部分与图14(a)相比较具有显著较少的粘着的细胞。
IgG用作调理素，其是能够标记例如被白细胞吞噬的病原体的物质。通常将IgG添加至免疫测定以对付嗜异性抗体干扰，如共同拥有的在审的美国申请N0.12/411,325中所描 述的，所述IgG存在于本文中描述的BNP筒中的固定的测定珠子(微粒)上。因此，很可能，该来源的IgG(当存在于免疫测定设备中时)或天然存在于血液样品中的IgG可用于不希望地对传感器表面进行针对白细胞的调理作用。此外，由于测定珠子在尺寸上与作为吞噬作用的天然靶标的生物细胞(细菌)相似，所以IgG在测定珠子上的积累可能不期望地促进白细胞在这些珠子上积累。这与在具有高白细胞计数和可能具有激活的免疫状态的细胞的样品中观察到的干扰是一致的。本发明提供了对这种白细胞干扰的解决方法，其中利用消耗IgG-涂覆的磁性珠子修正样品为减少白细胞活性提供了方法，从而使它们绕开传感器上的主要免疫试剂。
在本发明的一些实施方案中，IgG-涂覆的固定的测定珠子(微粒)的制备包括将IgG吸附至MES缓冲液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)中的羧化聚苯乙烯微粒上，然后在EDAC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)存在的情况下进行交联。然而，固定的测定珠子可由本领域已知的任何适当材料组成。
现描述用于形成固定测定珠子(微粒)的一个非限定方法。在一个程序中，通过以18，OOORCF(相对离心力)离心20分钟而从它们的基质(10%的微粒，在水中，Seradyn)沉淀出粗制固定的微粒，将其重悬浮于25mM MES缓冲液至100-200mg/mL微粒的浓度。随后以等于约I至5%的重量的微粒的量添加溶解在25mM MES缓冲液中的IgG。在于冰箱中进行15-20分钟回转(nutation)后，通过以1300RCF离心20分钟沉淀出微粒，将其重悬浮于新鲜MES缓冲液至75mg/mL的浓度。通过测量280nm处的吸光度(L 4AU/mg/mL蛋白质的有效消光系数)测定来自离心的上清液的蛋白质含量，以确认IgG已被吸附至微粒上。将新鲜制备的EDAC交联剂(10mM，在MES缓冲液中)添加至重悬浮的微粒至约2_4mM的终浓度。随后通过在冰箱中回转120±15分钟而搅拌混合物。随后可通过以1300RCF离心20分钟再次沉淀出微粒，将其重悬浮于1/5PPS (磷酸缓冲盐水)中并且在冻箱中回转15-30分钟。在最终的离心后，可将微粒重悬浮于PBS+0.05%叠氮化钠中或1:1的1/5PPB:PSS(1/5PPB为用4 份水稀释的 PBS, PSS=蛋白质稳定溶液，Applied Enzyme Technologies, Pontypool, UK)中至10%的固体浓度。可将所得的制剂分成等份并冷冻贮存(优选在-60° C)。将通过该方法形成的悬浮于PBS中的微粒和(非磁性)消耗珠子用于本文中描述的实验，以及直接施用至血液样品中。
虽然上述某些测定使用附着至固定的测定珠子(微粒)(所述珠子继而附着至具有底层电极(underlying electrode)的多孔层)的固定的第一抗体，但可将第一抗体直接固定在电极或任何其它表面上，或固定在可溶性珠子上。富集的或高棕黄全血样品(EBS)的示例性制备(如对于用于本文中描述的实验所描述的)如下。在优选方法中，从供体抽取新鲜全血放入2个6mL EDTA-抗凝Vacutainers⑩，将其以2000RCF(标准转子)离心10分钟。当需要BNP “阳性”样品时，在离心之前将BNP抗原掺入管。除了最后高出血浆/血沉棕黄层/红细胞界面的I毫米外，取出所有血浆并置于一旁。随后使用移液管取出界面区域(注意尽可能多地取出血沉棕黄层)并置于一旁。随后取出红细胞并置于一旁。通过将棕黄材料与更少部分的血浆和红细胞级分组合，可以产生高棕黄血液样品，同时保留正常的样品血细胞比容，例如，35-55wt.%。类似地，可产生存在低水平或基本上不存在棕黄材料(白细胞和血小板)的样品O在实验中，利用如下样品测试BNP测试筒:(i)高棕黄样品，(ii)在临运行之前用10%体积的10%重量的用PBS中的IgG涂覆的微粒(μ P-1gG)的悬浮液处理的高棕黄样品，
(iii)高血细胞比容的不含白细胞的样品，和Qv)低血细胞比容的不含白细胞的样品。图18包括显示白细胞干扰对电化学免疫传感器的信号斜率的影响和消耗珠子(非磁性的)处理对所述斜率的影响的图形数据。右图框和左图框中显示的是作为正常全血样品(右图框)和高棕黄血液样品(富含白细胞，高棕黄，左图框)的净信号(X-轴)的函数绘制的传感器斜率(y-轴)。左图框显示在消耗珠子不存在的情况下(亚批I)，在高棕黄样品中观察到的信号斜率的相当大的变化性。该变化性在非磁性消耗珠子存在的情况下(亚批2和3)被显著缓解。注意，在具有和不具有消耗珠子的正常全血样品(右图框)中观察到极小的信号斜率变化性。通过使用根据本发明的磁性消耗珠子应当实现相同或更好的效应。测定后传感器的显微检查显示:在高棕黄(HB)中运行的芯片上存在厚的沉积；在HB/μ P-1gG运行的样品上不存在沉积。免疫传感器的显微照片示于图14(a)和14(b)中，并且它们的相关分析仪波形分别显示于图19(a)和(b)中。从与血液样品接触之前的原始免疫传感器(如图17中显示的)与在利用消耗珠子处理的血液接触之后的免疫传感器(图14(b))的比较清楚地看到，在视觉上存在显著的改善，即与图14(a)相比较附着的白细胞减少。基于许多观察，该视觉改善与免疫传感器性能的实际改善直接相关。再次地，使用根据本发明的磁性消耗微粒应该能获得相同或更好的效应。另外的实验显示干扰现象在单独的血浆或在含血小板但不含白细胞的样品中不发生，但仅在含高棕黄水平的样品中发生。此外，利用IgG涂覆的更小的珠子，例如具有小于0.2μπι的平均粒度的珠子，不具有与较大颗粒相同的对传感器斜率的干扰减少或消除效应。总之，实验数据支持这样的结论:白细胞是其中传感器在洗涤循环中变得不太可渗透的现象的主要原因，并且该免疫测定干扰可通过添加消耗性IgG涂覆的颗粒至测定介质来缓解。本发明的免疫传感器的优选实施方案的晶片级(Wafer-level)微制造如下。图7显示了用于单个基底上的几个电极的掩模设计。关于掩蔽和蚀刻技术，可沉积独立的电极和导线。因此，以低成本在紧凑的面积上提供了多个免疫传感器94和96以及电导测定传感器90和92，连同它们各自的连接垫91、93、95和97，以实现至读数装置的电连接。原理上，可以以这样的方式装配非常大的传感器阵列，每一个传感器对不同的分析物灵敏或用作对照传感器或参考免疫传感器。在本发明的具体实施方案中，可如下制备免疫传感器。加热氧化硅晶片以形成约I微米厚的绝缘氧化物层。将钛/钨层溅射在氧化层上达到100至1000埃的优选厚度，然后溅射一层最优选800埃厚的金。随后，将光致抗蚀剂旋制在晶片上，并干燥和适当地烘焙。随后使用接触掩模例如相应于图7中显示的掩模使表面曝光。使潜像(latent image)显影，将晶片与金-蚀刻剂接触。用光可限定的聚酰亚胺涂覆图案化的金层，适当地烘焙，使用接触掩模进行曝光，显影，在O2浆中进行清洁，优选在350° C碘化5小时。可对晶片背侧进行任选的金属化以用作阻性加热元件(resistive heating element),其中免疫传感器将被用于恒温器形式中。随后用抗体涂覆的颗粒打印表面。将优选具有约20nL的体积并且包含1%固体内容物(在去离子水中)的微滴沉积在传感器区域并且通过风干原位干燥。任选地，将抗体稳定化试剂(由 SurModica Corporation, Eden Prairie, Minnesota, USA 或Applied Enzyme Technology Ltd, Pontypool, UK 提供的)涂覆在传感器上。干燥颗粒以使它们以阻止在样品或包含底物的流体中溶解的方式粘附至表面。该方法提供了可靠且可重现的适用于制造高容量的传感器芯片的固定方法。如图7中所示,基础电极94在15 μ m中心上包含7 μ m金盘(gold disk)的方阵列。所述阵列覆盖直径约600 μ m的圆形区域，并且这样实现:在由一系列包含Si/Si02/Tiff/Au的层制造的基底上光图案化一薄层厚度为0.35 μ m的聚酰亚胺。7 μ m微电极的阵列提供电活性物质的高收集效率，具有减小的来自任何电化学本底电流(与暴露的金属的电容相关)的贡献。在金属上包含聚(乙烯醇)(PVA)层显著地增强了本底电流的减小。在一些实施方案中，通过在晶片上的微电极上旋转涂覆PVA+有机吡啶盐(stilbizonium)光敏交联试剂的含水混合物来制备多孔PVA层。旋转涂覆混合物任选地包括牛血清白蛋白(BSA)。随后对晶片进行光图案化以仅覆盖阵列上方和围绕阵列的区域，并且优选具有约0.6 μ m的厚度。差分测量(differential measurement)的一般概念在电化学和传感器领域是已知的。现在描述用于减少电化学免疫传感系统中的干扰信号的新型方法。然而，虽然描述了成对安培计电化学传感器的差分测量，但其在其它电化学传感系统(包括但不限于电位测定传感器、场效应晶体管传感器和电导测定传感器)中具有等同的效用。本发明的实施方案还适用于光学传感器，例如消逝波传感器和光波导，以及还有其它类型的传感，包括声波和温度传感等。因此，根据本发明的不同实施方案，可将固定的抗体附着至选自安培计电极、电位测定电极、电导测定电极、光波导、表面等离子体共振传感器、声波传感器和压电式传感器的传感器。理想地，在非竞争性测定实施方案中，来自免疫传感器(IS)的信号仅来源于包含固定的抗体(Abl)、分析物和被标记的信号抗体(Ab2)的夹心的形成，其中标记物(例如，酶)与底物(S)反应以形成可检测的产物(P)，如下面方案(I)中显示的。表面-Abl-分析物-Ab2-酶；酶+S — P(I)已知一些信号抗体(Ab2)可非特异性结合至表面，如下面方案(2)和(3)中显示的，并且在洗涤步骤中可能不从免疫传感器的区域被完全洗掉(达到约100微米远)，从而产生与表面-Abl-分析物-Ab2-酶免疫测定夹心结构无关的总的检测产物的一部分，从而产生干扰信号。
表面-Ab2_酶；酶+S — P (2)表面-分析物-Ab2_酶；酶+S —P (3)如上文显示的，可以任选地将第二免疫传感器置于筒中，其用作免疫-参考传感器(IRS)并且产生与在第一免疫传感器上发生的相同的(或可预测地相关的)程度的非特异性结合(NSB)。在一个实施方案中，干扰可通过从第一免疫传感器的信号扣除该免疫-参考传感器的信号而被减少，即，除去信号的NSB组分，从而提高测定的性能，如下面方案(4)中显示的。在另一个实施方案中，该校正可任选地包括额外的补偿值的扣除或添加。校正的信号=IS-1RS(4)在本发明的优选实施方案中，除用于分析物(例如，cTnl)的捕获抗体被针对血浆蛋白(以高浓度天然存在于样品(正常和病理性的)中)的抗体替代外，参考免疫传感器，也称为免疫-参考传感器，在所有重要方面(例如，尺度、多孔筛选层、乳胶颗粒涂层和金属电极组成)与第一免疫传感器是相同的。可将免疫传感器和参考免疫传感器在娃芯片上分别制造为相邻结构94和96 (如图7显示的)。虽然描述了肌钙蛋白I和脑利钠肽(BNP)测定的优选实施方案，但该结构对于其它心脏标志物测定包括例如肌钙蛋白T、肌酸激酶MB、原降钙素、proBNP、NTproBNP、肌红蛋白等加上临床诊断中使用的其它夹心测定例如PSA、D- 二聚体、CRP、HCG、NGAL、髓过氧化物酶和TSH也是有用的。结合血浆蛋白的适当的抗体的实例包括针对人血清白蛋白、血纤蛋白原和IgG fc区域的抗体，人血清白蛋白是优选的。然而，如果适当的抗体是可获得的，则可使用以大于约100ng/mL的浓度存在的任何天然蛋白质或血楽;组分。然而,所述蛋白质应当以充足的量存在，以快速地涂覆传感器(与进行分析物测定所需的时间相比)。在优选实施方案中，所述蛋白质以足以在接触血液样品约100秒内结合参考免疫传感器上超过50%的可用抗体的浓度存在于血液样品中。一般地，第二固定的抗体具有约1χ10_7至约1χ10_15Μ的亲和常数。例如，归因于血液样品中白蛋白的约1χ1(Γ4Μ的高摩尔浓度，具有约ΙχΙΟ,Μ的亲和常数的针对白蛋白的抗体是优 选的。根据本发明的不同实施方案，提供被来源于样品的天然白蛋白覆盖的表面显著地减少可存在的其它蛋白质和细胞材料的结合。该方法通常优于使用常规封闭试剂以使NSB减少至最低限度的常规免疫测定，因为此类试剂通常必须被彻底干燥并且在使用前保持稳定数月或数年，在该时间过程中它们可降解，产生比期望的更粘的表面，导致随时间增长而产生的NSB。相反地，本发明的实施方案在使用时提供了新鲜表面。如下描述用于BNP的免疫传感器和用于进行差分测量以减少NSB的效应的参考-免疫传感器的一个实施方案。在一个实施方案中，通过相同的方法制备包含利用抗-BNP和抗-人血清白蛋白(HSA)涂覆的羧化物-修饰的乳胶微粒(由BangsLaboratories Inc., Fishers,Indiana, USA 或 Seradyn Inc., Indianapolis, Indiana, USA提供)的测定珠子(微粒)。首先通过离心对测定珠子进行缓冲液交换，随后加入抗体，所述抗体允许被动吸附在珠子上。随后用PH6.2的MES缓冲液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)中的(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)(EDAC)活化测定珠子上的羧基，以与抗体形成酰胺键。通过离心除去任何珠子聚集物，将完成的珠子冷冻贮存。在另一个实施方案中，珠子的抗-HSA抗体的饱和覆盖导致珠子质量增加约7%。在另一个实施方案中，使用共价连接从包含7mg的抗-HSA和IOOmg的珠子的混合物制备涂覆的珠子。通过使用该制剂，将约0.4nL的微滴(包含约1%的固体，在去离子水中)微分散(使用美国专利5，554，339的方法和装置，如上文所引用，并通过引用整体并入本文)至覆盖传感器96的光图案化的多孔PVA选择性渗透层上，然后使其干燥。干燥颗粒附着至多孔层并且显著阻止它们在血液样品或洗涤流体中的溶解。在本发明的一个实施方案中，对于BNP抗体，珠子表面的饱和覆盖导致约10%的珠子的质量增加。因此通过将IOmg抗-BNP连同偶联试剂一起添加至IOOmg珠子，实现饱和覆盖。随后将这些珠子微分散至传感器94上。在另一个实施方案中，用具有血浆蛋白抗体例如抗-HSA和分析物抗体例如抗-BNP的测定珠子涂覆免疫传感器94。利用约2mg或更少的抗-HSA/100mg珠子制备的并且用抗-BNP饱和涂覆的珠子在免疫传感器上提供了优良的NSB性质。已发现肌钙蛋白测定的斜率(信号对分析物浓度)未受实质影响，因为在珠子上存在充足的抗-BNP来捕获可用的分析物(抗原)。通过测定不同抗体的珠子饱和浓度和免疫传感器(具有只有针对靶分析物的抗体的珠子)的斜率，可测定具有针对给定的分析物和血浆蛋白的抗体的珠子的抗体组合的适当比率。具有参考免疫传感器的免疫传感器的重要方面是由一层血浆蛋白优选HSA/抗-HSA组合产生的表面的“人源化”。该表面“人源化”似乎使得珠子不那么容易被抗体-酶缀合物的NSB影响，其也似乎减少了珠子差异性。不受理论束缚，似乎随着传感器被样品覆盖，它们因抗-HSA表面而迅速被天然白蛋白涂覆。这与常规封闭材料相比较提供了优良结果，所述常规封闭材料在制造中被彻底干燥并且通常在长期贮存之后复水化。“人源化”传感器表面的另一个有利方面是其提供了对人抗-小鼠抗体(HAMA)和其它嗜异性抗体干扰的抗性的额外模式。HAMA对免疫测定的影响是公知的。在另一个实施方案中，可将免疫-参考传感器用于本发明的设备和方法中以监测分析循环中获得的洗涤效率。如上所述，本底噪声的一个来源是少量酶缀合物仍然存在于溶液中，或非特异性吸附在传感器上并且未被洗涤步骤除去。本发明的该方面涉及通过导入本文中描述的空气区段，使用小体积的洗涤液进行高效洗涤步骤。在安培计电化学系统的优选实施方案的操作中，通过分析仪记录因ALP的活性而产生的与免疫传感器94和免疫-参考传感器96上的对氨基苯酚的氧化相关的电流。对于银-氯化银参考电极，将免疫传感器和免疫-参考传感器的电位设置在相同的值上。为了除去干扰效应，根据上述公式(4)，分析仪从免疫传感器的信号扣除免疫-参考传感器的信号。当在两个传感器之间存在特征性常值偏移时，该值也被扣除。免疫-参考传感器不必具有所有与免疫传感器相同的非特异性性质，免疫-参考传感器仅需在测定的洗涤和NSB部分一致成比例。在一个实施方案中，植入分析仪中的算法可解释两种传感器之间的任何其它基本恒定的差异。免疫传感器与免疫-参考传感器的差异组合而非单独的免疫传感器的使用，给测定提供了下列改善。在优选实施方案中，筒设计提供了干试剂，所述干试剂产生约40-50亿个溶解至约10 μ L血液样品中的酶缀合物分子。在结合和洗涤步骤结束时，传感器上的酶分子的数目为约70，000个。在利用优选实施方案的实验中，在免疫传感器和参考免疫传感器上存在平均约200，000 (土约150,000)个酶分子，作为非特异性结合的本底。通过使用免疫-参考传感器的差异测量，消除了约65%的不确定度，显著提高了测定的性能。虽然其它实施方案可具有其它程度的提高，但关于测定性能的总体提高的基础仍然保持。任选的免疫-参考传感器的另一个用途是检测不规则样品状况，例如不恰当地抗凝化样品，其将材料沉积在整个导管中并且在免疫传感器和免疫-参考传感器上都引起增加的待测量的电流。该效应与在测量步骤中非特异性吸附的酶和保留在传感器上的洗涤流体的薄层中的酶相关。任选的免疫-参考传感器的另一个用途是校正洗涤效率的信号。在某些实施方案中，免疫传感器上的信号水平取决于洗涤的程度。例如，利用更多流体/空气区段转换的更长洗涤可因一部分特异性结合的缀合物被洗掉而产生更低的信号水平。然而这可能是相对小的影响，例如小于5%，校正可提高测定的总体性能。可基于传感器上的相对信号，或与位于与传感器相邻的导管中的电导传感器(用作用于检测和计数空气区段/流体转换的数目的传感器)结合来实现校正。这为嵌入分析仪的算法校正工具提供了输入。在利用内源蛋白质例如HSA的参考免疫传感器的另一个实施方案中，可通过利用以针对外源蛋白质例如牛血清白蛋白(BSA)的抗体涂覆的免疫-参考传感器来实现相同的目的。在该情况下，在与传感器接触前需要将一部分BSA溶解在样品中(作为额外的试剂提供)的步骤。可在筒的样品保持室中或在外部收集设备例如BSA涂覆的注射器中以BSA作为干试剂进行该溶解步骤。该方法提供了某些有利方面，例如，可就表面电荷、特定表面基团、糖基化程度等选择蛋白质。这些性质可以不必存在于内源蛋白质的可获得的选择中。除了盐以外，其它试剂也可提高免疫测定的全血精确度。应当以促进快速溶解的方式将此类试剂呈递给全血。在一些实施方案中，涂覆在血液保持室(或另一导管)的壁上的支持基质(包括纤维素、聚乙烯醇(PVA)和明胶(或其混合物))促进快速溶解，例如在小于15秒内完成超过90%。在另一个实施方案中，在覆盖分析物传感器的液体的薄膜中进行分析物测量。优选利用安培计量法进行此类薄膜测定。该筒与前述实施方案相异在于具有可关闭的阀门和导管内的排气口，当将样品排出通过阀门时所述可关闭的阀门被密封，所述排气口允许至少一个空气区段随后被导入测量流体，从而增加从传感器漂洗样品的效率，并且还允许在测量之前从传感器除去基本上全部液体，并且还允许新鲜液体区段被带动穿过传感器以允许就提高的精确度进行连续的重复测量以及重现性的内部检查。在非竞争性测定实施方案中，如上所描述的，用于检测低浓度免疫活性分析物的分析方案依赖于酶标记的抗体/分析物/表面结合的抗体的“夹心”复合物的形成。将样品中分析物的浓度转化为成比例的酶表面浓度。所述酶能够通过将底物转化成可检测的产物来放大分析物的化学信号。例如，当所述酶是碱性磷酸酶时，单个酶分子每分钟可产生约9000个可检测的分子，从而与其中将电活性物质附着至抗体(替代碱性磷酸酶)的方案相比较，在分析物的可检测性上提供了几个数量级的提高。在免疫传感器实施方案中，有利的是将传感器首先与样品，然后与洗涤流体接触，随后记录来自传感器的反应。在一些具体的实施方案中，除了利用IgG-涂覆的微粒修正以减少白细胞干扰外，还在修正的样品与传感器接触之前，利用结合样品中的目标分析物的抗体-酶缀合物(信号抗体)修正样品。样品中的结合反应产生分析物/抗体-酶复合物。传感器包括靠近电极表面附着的针对分析物的固定的抗体。在与传感器接触后，分析物/抗体-酶复合物结合电极表面附近的固定的抗体。有利地在该点尽可能多地从电极附近除去未结合的抗体-酶缀合物以使来自传感器的本底信号减小至最小。抗体-酶复合物的酶有利地能够转化流体中提供的底物以产生电化学活性物质。使该活性物质靠近电极产生，并且当施加适当的电位(安培计操作)时，其从电极上的氧化还原反应提供电流。或者，如果电活性物质是离子，可电压计量地测量它。在安培计测量中，可在测量过程中固定电位或按照预定的波形改变电位。例如，三角波可用于扫描限度之间的电位，如循环伏安法的公知技术中所使用。或者，可将数字技术例如方波用于改善电极邻近的电活性物质的检测的灵敏度。根据电流或电压测量，计算样品中分析物的量或存在。这些和其它分析电化学法在本领域是公知的。在其中筒包括免疫传感器的实施方案中，有利地从惰性金属例如金、钼或铱的基本传感器和覆盖有连接至微粒例如乳胶珠子的生物活性层的多孔选择性渗透层微制造免疫传感器。将微粒分配在覆盖电极表面的多孔层上，形成粘着的多孔生物活性层。生物活性层具有特异性结合目标分析物的性质，或当分析物存在时表现出可检测的变化的性质，最优选为针对分析物的固定的抗体。IX.用于减少或消除白细胞干扰的设备、试剂盒和方法本发明适用于夹心和竞争性免疫测定。在夹心测定实施方案中，样品与具有针对靶分析物的固定的第一抗体的免疫传感器和针对所述靶分析物的标记的第二抗体接触。在竞争性测定实施方案中，样品与包含针对所述靶分析物的固定的第一抗体的免疫传感器和竞争与靶分析物的结合的标记的靶分析物接触。常见的分析物包括但不限于Tn1、TnT、BNP、NTproBNP、proBNP, HCG、TSH、NGAL、地高辛、茶碱和苯妥英等。在本发明的一些实施文字中，首先收集样品例如全血样品，随后通过将包含磁性消耗珠子的干试剂溶解在样品中来修正样品。在某些实施方案中，使用充足的消耗珠子以提供相对于样品中的白细胞过量的珠子。这产生了具有至少5 μ g/μ L样品、例如至少10 μ g/ μ L样品、或至少15 μ g/ μ L样品的溶解的消耗珠子浓度的样品，所述浓度足以实质上啮合样品中的任何白细胞。就范围而言，干试剂优选溶解于样品中以产生约5yg至约40 μ g珠子/ μ I样品、优选约10至约20 μ g珠子/ μ L样品的消耗珠子浓度。取决于珠子的尺寸，这相应于至少约IO4个珠子/yL样品、至少约IO5个珠子/yL样品、或约IO5至约IO6个珠子/yL样品。因 此，在一些优选实施方案中，消耗珠子以足以提供至少IO4个珠子/ μ L样品、例如至少约IO5个珠子/ μ L样品或约IO5至约IO6个珠子/ μ L样品的溶解的消耗珠子浓度的量存在。一旦该步骤完成，可能对修正的样品进行免疫测定例如电化学免疫测定以测定分析物的浓度。干试剂的溶解和夹心形成步骤可同时发生或以逐步的方式发生。本发明的方法的实施方案主要针对作为心血管标志物的分析物，例如Tnl、TnT、CKMB、肌红蛋白、BNP、NT-proBNP和proBNP，但也可用于其它标志物例如β -HCG、TSH、髓过氧化物酶、肌红蛋白、D- 二聚体、CRP、NGAL和PSA。为了确保大部分白细胞在检测步骤之前已被隔离，优选使样品修正步骤进行约I分钟至约30分钟的范围内的选择的预定时间。 在优选实施方案中，在包括免疫传感器、导管、样品进入端口和样品保持室的筒中进行所述方法，其中用干试剂涂覆这些组件的至少一个的至少一部分。干试剂可包括如下的一种或多种:用于减少白细胞干扰的磁性消耗珠子、杀白细胞试剂、缓冲剂、盐、表面活性齐 、稳定剂、简单碳水化合物、复杂碳水化合物及各种组合。此外，干试剂还可包括针对分析物的酶标记的抗体(信号抗体)。
在测定步骤之前，将磁场施加至磁性消耗珠子以将它们与任何结合的白细胞一起保留在所述筒的表面上，例如筒的导管上，以及基本上不与免疫传感器接触。
在实际测定步骤中，在优选实施方案中，一旦在固定的抗体与信号抗体之间形成夹心，随后就将样品介质洗涤至废料室，然后将夹心暴露于能够与酶反应以形成能够电化学检测的产物的底物。优选形式是电化学酶偶联免疫吸附测定。
本发明的某些实施方案涉及用于进行免疫测定的试剂盒，其包括磁性消耗珠子。所述试剂盒或方法适用于包含白细胞的任何样品，例如全血，并且所述样品可以是利用抗凝剂例如EDTA、肝素、氟化物、柠檬酸盐等修正的血液样品。
在一些实施方案中，将磁性消耗珠子用于修正第一容器或位置中的生物样品例如血液，随后将样品通过具有捕获和信号抗体的第二容器或位置。在其它实施方案中，磁性消耗珠子包含在溶液中并与生物样品混合，将所得的修正的样品导入分析设备中。例如，可将血液样品与磁性消耗珠子混合以形成修正的样品，随后将该样品导入筒中。在某些实施方案中，所述分析设备例如筒包括小袋(pouch)，所述小袋包含含有磁性消耗珠子的液体，其可与生物样品在设备中混合，随后基本上如本文中所述进行处理以形成测定，例如夹心测定，以进行分析物检测。
在其它实施方案中，电润湿法(electrowetting)用于将包含磁性消耗珠子的第一液体与液体生物样品例如血液混合。在一个这样的施方案中，可提供用于操作微滴的装置。所述装置例如可具有单面电极设计，其中将所有导电组件包含在于其上操作微滴的一个表面上。在其它实施方案中，为了包含待操作的微滴，与第一表面平行地提供另外的表面。通过进行基于电润湿法的技术(其中以受控的方式相继激励和去激励包含在第一表面上或植入其中的电极)操作微滴。所述装置可使得能够进行多个微滴操作过程，包括将两个微滴融合和混合在一起，将微滴分成两个或更多个微滴，通过从液流形成单个可控微滴而从连续液流取样，以及迭代二元(iterative binary)混合或数字混合微滴以获得期望的混合比率。如此，可将包含磁性消耗珠子和任选地一种或多种杀白细胞试剂的第一液体的微滴与液体生物样品例如血液小心和可控地融合和混合。参见，例如，属于Pamula等人的美国专利6，911，132，将其整体通过引用并本文。
此外，可对本领域已知的现有免疫测定形式进行修饰以包括本发明的磁性消耗珠子，例如通过在样品预处理步骤中添加珠子。该预处理可通过将消耗珠子整合在血液收集设备中、独立容器中来实现，或可通过将消耗珠子整合在设备的测试循环中而在分析(免疫测定)设备本身中发生。
虽然已在脑利钠肽(BNP)测试筒的情景下描述了本发明，但其同样地适用于其中白细胞存在并且可以是干扰的原因的任何免疫测定。同样地，方法或试剂盒不限于BNP，而是可改造适用于任何免疫测定，包括但不限于proBNP、NTproBNP、cTnl、TnT、HCG、TSH、PSA、D- 二聚体、CRP、肌红蛋白、NGAL、CKMB、髓过氧化物酶和半乳糖凝集素-3。此外，所述方法和试剂盒适用于这样的测定:其中用任何非人(包括鼠、羊、牛和狼)IgG或其片段涂覆磁性消耗珠子，或者用活化的人IgG或其片段涂覆消耗珠子。磁性消耗珠子可包含用选自蛋白质、细菌、病毒和异型生物质的材料或其片段涂覆的基底珠子，或可由静止或稳定的细菌细胞、孢子或其片段例如大肠杆菌提供，任选地不具有基底珠子。
本发明的试剂盒或方法可包括以可溶解的干试剂的形式存在的第二标记的抗体。在一些实施方案中，可溶解的干试剂包括一种或多种杀白细胞试剂和/或受调理作用的消耗珠子作为可溶解的干试剂的部分，或其中各种组分存在于单独的干试剂位置中。关于杀白细胞试剂的讨论，参见共同在审的美国专利申请12/771，634，将其整体通过引用并入本文。注意，固定的和标记的抗体都可以是单克隆抗体、多克隆抗体、其片段及其组合。此外，第二抗体可用各种标记物包括放射性标记物、酶、生色团、荧光团、化学发光物质和免疫测定领域已知的其它标记物来进行标记。当用酶来标记第二抗体时，其优选为ALP、辣根过氧化物酶或葡萄糖氧化酶。
当所述方法或试剂盒用于进行非-竞争性免疫测定时，存在一系列的混合步骤，包括:(i)将怀疑包含分析物的血液样品与包含针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子的试剂混合；(ii)使磁性消耗珠子与白细胞结合；(iii)通过磁性将珠子和任何结合的白细胞保留在磁场区域；(iv)将血液样品与针对分析物的固定的第一抗体混合并且在固定的抗体与所述分析物之间形成复合物；和(V)将血液样品与标记的第二抗体混合以形成具有所述分析物和所述固定的抗体的复合物。注意，这些混合步骤可同时进行或按有序顺序进行。例如，步骤(iv)和(V)可同时进行，或可在步骤(iv)之前进行步骤⑴和(V)。在最后的步骤中，测定在固定的第一抗体、分析物与标记的第二抗体之间形成的复合物的量。实施例
根据下列非限定性实施例，本发明将变得更好理解。
实施例1
在一个实施方案中，未计量的流体样品通过样品进入端口 4被导入筒的样品保持室34。毛细管栓25阻止样品在该阶段进入导管15，并且使保持室34充满样品。关闭盖子2或组件200以阻止样品从筒渗漏。随后将筒插入读数装置，例如美国专利5，821，399 (将其通过引用并入本文)中公开的读数装置。将筒插入读数装置激活了机械装置，当包装被压靠在尖状物38上时，所述机械装置刺穿位于42上的包含流体的包装。从而流体被排入第二导管，以39、20、12和11的顺序到达。12上的缢缩阻止液体的进一步运动，因为残余静水压被经第二导管部分11进入废料室44的流体流动所消散。在第二步骤中，泵装置的操作对气囊43施加压力，迫使空气通过导管40，通过切除物17和18，在预定的位置27进入导管34。毛细管栓25和位置27界定了原始样品的计量部分。当样品在样品保持室34内时，其被室的内表面上的包含磁性消耗珠子和任选地非磁性消耗珠子和/或一种或多种杀白细胞试剂和任何其它期望的材料的干试剂涂层修正。然后，样品的计量部分被气囊43内产生的气压排出，通过毛细管栓。优选地，在足以(任选地通过样品的振荡来促进)允许样品中包含的白细胞结合磁性消耗珠子的条件下使样品例如在保持室34和/或导管15中与磁性消耗珠子混合。随后将磁场施加至样品以将磁性消耗珠子保留在导管的表面上并且基本上不与免疫传感器接触。然后样品与位于切除物35内的分析物传感器接触。
在使用位于切除物35内的免疫传感器的实施方案中，在样品到达传感器之前，利用例如酶-抗体缀合物(信号抗体)修正所述样品。为了促进分析物与传感器的高效结合，任选地将包含分析物的样品以振荡运动在传感器上方反复通过。优选，使用约0.2至2Hz，最优选0.7Hz的振荡频率。因此，使与信号抗体结合的信号酶紧邻安培计电极表面，与存在于样品中的分析物的量成正比。一旦已提供分析物/酶-抗体缀合物复合物结合免疫传感器的机会，就通过对气囊43进一步施加压力来射出样品，样品进入废料室44。洗涤步骤接着从传感器室除去非特异性结合的酶-缀合物和消耗珠子。通过泵装置43将第二导管中的流体移动至与传感器接触。分析流体被缓慢地拉动直至在电导传感器上检测到第一空气区段。可通过任何适当的方法在导管内产生空气区段，包括但不限于:(1)被动方法；(2)主动方法，包括使用泵短暂地降低导管内的压力，从而空气通过瓣或阀门被抽入导管；或(3)通过溶解预置于导管内的化合物，所述化合物在与导管内的流体接触后释放气体，其中这样的化合物可包括碳酸盐、碳酸氢盐等。该区段在从导管15清除样品污染的流体方面是极有效的。漂洗传感器区域的效率可通过如所描述的将一个或多个空气区段导入第二导管来极大地增加。使空气区段的前沿和/或后缘在传感器上通过一次或多次以漂洗和重悬浮可能已从样品沉积的外来物质。外来物质包括除特异性结合的分析物或分析物/抗体-酶缀合物复合物外的任何材料。然而，本发明的目的是使漂洗不要达到足以促进特异性结合的分析物或分析物/抗体-酶缀合物复合物从传感器分离的延长时间或剧烈程度。将空气区段导入流体的另一个有利方面是分割流体。例如，在流体的第一个区段用于漂洗传感器后，随后将第二区段置于传感器上，两个区段以最低限度混合。该特征通过更有效率地除去未结合的抗体-酶缀合物而进一步减小来自传感器的本底信号。在前沿洗涤后，分析流体被缓慢地拉动直至在电导传感器中检测到第一空气区段。该区段在清除与第一分析流体样品混合的样品污染的流体方面是极有效的。为了进行测量，将新的流体部分置于传感器上，并且将电流或电位记录为时间的函数(在对操作模式适宜的情况下)。实施例2现参考图12，其中显示了免疫传感器筒的俯视图。筒150包括底座和顶部，优选由塑料构成。两个部分通过薄的粘着性垫圈或柔性薄膜连接。如在先前的实施方案中一样，装配的筒包括样品保持室151 (通过样品入口 167将包含目标分析物的样品导入其中)。利用受调理作用的磁性消耗珠子修正样品，在递送至传感器芯片153之前使用磁铁168将加载有靶材料(例如，白细胞)的珠子从样品保留下来。如之前一样通过毛细管栓152 (优选由连接筒的两个部分的垫圈或膜中的0.012英寸(0.3mm)的激光掏槽孔(laser cut hole)形成)和位于样品保持室内的预定的点上的进入点155 (通过泵装置例如浆的作用压迫样品膈膜156将空气导入)的组合作用经样品导管154(第一导管)将样品的计量部分递送至传感器芯片153。在接触传感器以允许结合发生之后,样品被移动至排气口 157,该排气口包括吸收样品的芯吸材料，从而使排气孔关闭密封以防止液体或空气的进一步通过。芯吸材料优选是棉花纤维材料、纤维素材料或具有孔的其它亲水材料。在本申请中重要的是所述材料具有充足的吸收力(即，具有足够的芯吸速度)，阀门在与下文中描述的样品膈膜驱动装置的随后缩回相当的时间段内关闭，这样样品随后不被抽回传感器芯片的区域。如在特定的实施方案中显示的，提供了洗涤导管(第二导管)158，其在一端连接至排气口 159并且在另一端连接至位于排气口 157与传感器芯片153之间的样品导管的点160上的样品导管。在将筒插入读数装置后，流体被导入导管158。优选地，流体最初存在于箔袋161内，当驱动装置对袋施压时所述箔袋被刺破。还提供了通过垫圈163中的小开口将流体连接至导管154的短导管162。第二毛细管栓最初防止流体到达毛细管栓160，以便流体保留在导管158内。
在已关闭排气口 157后，开动泵，从而在导管154内产生降低的压力。排气口164(优选在垫圈中包括小瓣切(fiap cut)或振动以提供间断气流的膜)提供了用于空气经第二排气口 165进入导管158的装置。第二排气口 165优选还包括当被湿润时能够关闭排气口的芯吸材料，需要时，所述芯吸材料允许样品膈膜156随后凹陷以封闭排气口 165。与样品膈膜156的驱动同时，流体经毛细管栓160从导管158被抽入导管154。因为流体的流动被空气进入口 164打断，所以至少一个空气区段(区段或区段流)被导入。
样品膈膜156的进一步缩回将包含至少一个空气区段的液体抽回穿过传感器芯片153的传感表面。液体内空气-液体边界的存在增强了传感器芯片表面的漂洗以除去剩余样品。优选地，样品膈膜156的运动受到控制，与从安装在与分析物传感器相邻的传感器芯片内的电导电极接收的信号联合。这样，流体在芯片上的存在可被检测到，并且可通过在分开的步骤中通过流体的运动来进行多个读取。
有利的是,在只有流体薄膜覆盖芯片、接地芯片(ground chip) 165和传感器与接地电极之间的导管154的壁的连续部分时进行分析物测量。通过操作样品膈膜156抽出流体来获得适当的薄膜，直至相邻传感器的电导测定传感器显示大体积的液体不再存在于导管154的该区域中。已发现可在极低(nA)电流下进行测量，因接地芯片与传感器芯片之间的薄膜的增加的阻抗而产生的电位下降(与大体积流体相比较)不明显。
接地芯片165优选是银/氯化银。为了避免在相对疏水的氯化银表面上容易形成的空气区段，有利地将接地芯片图案化为散布有更亲水的区域例如二氧化硅的表面的银/氯化银的小区域。因此，优选接地电极构型包括密集排列的并且散布有二氧化硅的银/氯化银方块的阵列。如果银/氯化银的区域有些凹陷，对于避免非有意的区段是更有利的。
现参考图13，其中显示了免疫传感器筒的优选实施方案的流控技术的图解视图。区域R1-R8表示与特定操作功能相关的导管的特定区域。因此Rl表示样品保持室，R2表示籍以将包含白细胞的样品的计量部分转移至捕获区域的样品导管。可利用涂覆在Rl或R2的壁上的物质例如受调理作用的磁性消耗珠子修正样品。如上所述，优选针对白细胞对珠子进行调理作用，所述珠子在溶解于样品中后结合白细胞。在磁铁区域65中，将磁铁用于通过磁性保留磁珠和来自样品的结合的白细胞基本上不接触免疫传感器。R3表示捕获区域，其安放有电导测定传感器和分析物传感器。R4和R5表示任选地用于进一步利用涂覆在导管壁上的物质修正流体的第一导管的部分，通过其实现更复杂的测定方案；R6表示在将筒插入读数装置后，向其中导入流体的第二导管的部分。R7包括位于毛细管栓160与166之间的导管的一部分，在所述部分中可进行进一步修正。R8代表位于点160与排气口 157之间的导管154的部分，其还可被用于修正包含在其中的液体。
本发明的实施方案适用于其中可存在残留白细胞(虽然有意地通过离心或过滤除去它们)的样品，例如血浆。某些实施方案也适用于可以例如利用缓冲液稀释的样品。此夕卜，虽然本发明通常涉及通过将干试剂溶解在样品中来修正样品，但其也实际上在其它实施方案中用于在分析过程中或在样品收集过程中将试剂例如磁性消耗珠子以液体形式添加至样品。此外，本发明的范围意在仅受下列权利要求的范围限制。
权利要求
1.在分析物免疫测定中减少来自白细胞的干扰的方法，包括: 在足以使生物样品中的至少一部分白细胞结合至磁性消耗珠子的条件下，将包含白细胞的生物样品与针对所述白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子接触；和通过磁性使所述磁性消耗珠子保留而基本上不与免疫传感器接触。
2.权利要求1的方法，其中所述免疫测定为夹心测定。
3.权利要求1的方法，其中所述免疫测定为竞争性测定。
4.权利要求1的方法，其中所述生物样品为血液样品。
5.权利要求1的方法，其中所述生物样品为全血样品。
6.权利要求1的方法，其中利用抗凝剂修正所述生物样品。
7.权利要求1的方法，其中所述磁性消耗珠子包含利用苯乙烯-丙烯酸共聚物涂覆的磁铁矿(Fe3O4)核心。
8.权利要求1的方法，其中所述磁性消耗珠子包括利用非人IgG或其片段涂覆的磁性珠子。
9.权利要求1的方法,其中所述磁性消耗珠子具有0.01 μ m至20 μ m的平均粒度。
10.权利要求1的方法，其中所述磁性消耗珠子具有0.1 μ m至5 μ m的平均粒度。
11.权利要求1的方法,其中所述磁性消耗珠子具有3μ m至5 μ m的平均粒度。
12.权利要求1的方法，其`中所述磁性消耗珠子存在于一种或多种可溶解的干试剂涂层中。
13.权利要求1的方法，其中利用永久磁铁来实现保留。
14.权利要求1的方法，其中利用电磁铁来实现保留。
15.权利要求1的方法，其中至少50wt.%的磁性消耗珠子被保留而不与免疫传感器接触。
16.权利要求1的方法，其中至少75wt.%磁性消耗珠子被保留而不与免疫传感器接触。
17.用于在血液样品中进行分析物夹心免疫测定的方法，包括: 将包含白细胞的血液样品导入测试筒的保持室，其中用针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子涂覆保持室的一部分； 在足以使生物样品中的至少一部分白细胞结合至磁性消耗珠子的条件下将血液样品与磁性消耗珠子接触； 使血液样品移动进入导管，其中定位于导管的至少一部分的磁场吸引磁性消耗珠子并且将其保留在导管壁的至少一部分上，从而基本阻止了磁性消耗珠子与免疫传感器接触；将血液样品与免疫传感器接触以形成包含固定的捕获抗体、样品分析物和信号抗体的夹心； 任选地从免疫传感器洗涤血液样品；和 基于由信号抗体提供的信号检测分析物的存在。
18.权利要求17的方法，其还包括: 从免疫传感器洗涤血液样品；和 将免疫传感器与能够与所述信号抗体反应的试剂接触以在免疫传感器上产生与样品分析物在血液样品中的存在相关的信号。
19.权利要求17的方法，其中所述血液样品为全血样品。
20.权利要求17的方法，其中利用抗凝剂修正所述血液样品。
21.权利要求17的方法，其中所述磁性消耗珠子包含利用苯乙烯-丙烯酸共聚物涂覆的磁铁矿(Fe3O4)核心。
22.权利要求17的方法，其中所述磁性消耗珠子包括利用非人IgG或其片段涂覆的磁性珠子。
23.权利要求17的方法，其中所述磁性消耗珠子具有0.01 μ m至20 μ m的平均粒度。
24.权利要求17的方法，其中所述磁性消耗珠子具有0.1 μ m至5 μ m的平均粒度。
25.权利要求17的方法，其中所述磁性消耗珠子具有3μ m至5 μ m的平均粒度。
26.权利要求17的方法，其中所述磁性消耗珠子存在于一种或多种可溶解的干试剂涂层中。
27.权利要求17 的方法，其中利用永久磁铁来产生磁场。
28.权利要求17的方法，其中利用电磁铁来产生磁场。
29.权利要求17的方法，其中所述磁场由埋植在测试筒中的磁铁产生。
30.权利要求17的方法，其中至少50wt.%的磁性消耗珠子被保留而不与免疫传感器接触。
31.权利要求17的方法，其中至少75wt.%的磁性消耗珠子被保留而不与免疫传感器接触。
32.权利要求17的方法，其中所述样品分析物选自肌钙蛋白1、肌钙蛋白T、BNP、肌酸激酶MB、原降钙素、proBNP、NTproBNP、肌红蛋白、PSA、D- 二聚体、CRP、HCG、NGAL、髓过氧化物酶和TSH。
33.权利要求17的方法，其中将固定的捕获抗体附着至传感器，所述传感器选自安培计电极、电位测定电极、电导测定电极、光波导、表面等离子体共振传感器、声波传感器和压电式传感器。
34.权利要求17的方法，其中将所述固定的捕获抗体附着至测定珠子，并且所述测定珠子连接至安培计电极。
35.在血液样品中进行分析物竞争性免疫测定的方法，包括: 将包含白细胞的血液样品导入测试筒的保持室，其中用针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子涂覆保持室的一部分； 利用标记的分析物修正血液样品； 在足以使生物样品中的至少一部分白细胞结合至磁性消耗珠子的条件下将血液样品与磁性消耗珠子接触； 施加定位至导管的至少一部分上的磁场以吸引磁性消耗珠子并且将其保留在导管壁的至少一部分上，从而基本上阻止了磁性消耗珠子与免疫传感器接触； 将血液样品与免疫传感器接触以形成结合的样品分析物与结合的标记的分析物的竞争性比率； 任选地从免疫传感器洗涤血液样品；和 基于通过结合的标记的分析物提供的信号测定的竞争性比率检测分析物的存在。
36.权利要求35的方法，还包括: 从免疫传感器洗涤血液样品；和将免疫传感器与能够与标记的分析物反应的试剂接触以在免疫传感器上产生与样品分析物在血液样品中的存在反相关的信号。
37.权利要求35的方法，其中所述生物样品为全血样品。
38.权利要求35的方法，其中利用抗凝剂修正所述血液样品。
39.权利要求35的方法，其中所述磁性消耗珠子包含利用苯乙烯-丙烯酸共聚物涂覆的磁铁矿(Fe3O4)核心。
40.权利要求35的方法，其中所述磁性消耗珠子包括利用非人IgG或其片段涂覆的磁性珠子。
41.权利要求35的方法，其中所述磁性消耗珠子具有0.01 μ m至20 μ m的平均粒度。
42.权利要求35的方法，其中所述磁性消耗珠子具有0.1 μ m至5 μ m的平均粒度。
43.权利要求35的方法，其中所述磁性消耗珠子具有3μ m至5 μ m的平均粒度。
44.权利要求35的方法，其中所述磁性消耗珠子存在于一种或多种可溶解的干试剂涂层中。
45.权利要求35的方法,其中利用永久磁铁来产生磁场。
46.权利要求35的方法,其中利用电磁铁来产生磁场。
47.权利要求35的方法，其中所述磁场由埋植在测试筒中的磁铁产生。
48.权利要求35 的方法，其中至少50wt.%的磁性消耗珠子被保留而不与免疫传感器接触。
49.权利要求35的方法，其中至少75wt.%的磁性消耗珠子被保留而不与免疫传感器接触。
50.权利要求35的方法，其中所述样品分析物选自地高辛、苯巴比妥、苯妥英、茶碱、丙戊酸和万古霉素。
51.权利要求35的方法，其中所述标记的分析物存在于一种或多种可溶解的干试剂涂层中。
52.权利要求35的方法，其中所述标记的分析物用选自放射性标记物、酶、生色团、荧光团、化学发光物质、离子载体和电活性物质的标记物进行标记。
53.权利要求35的方法，其中所述标记的分析物用选自荧光素、二茂铁和对氨基苯酚的标记物来进行标记。
54.用于进行怀疑存在于血液样品中的样品分析物的竞争性免疫测定的筒，所述筒包括: 用于接收血液样品的样品入口； 用于计量血液样品以形成计量样品的计量室； 一个或多个包含针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子和标记的分析物的干试剂涂层； 包含针对样品分析物和针对标记的分析物的固定抗体的电极；和 用于将计量样品和标记的分析物移至电极的一个或多个泵件。
55.权利要求54的筒，还包括磁铁，其用于磁性消耗珠子的位置保持。
56.用于进行怀疑存在于血液样品中的样品分析物的非竞争性免疫测定的筒，所述筒包括:用于接收血液样品的样品入口； 用于计量血液样品以形成计量样品的计量室； 一个或多个包含针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子和针对分析物的信号抗体的干试剂涂层； 包含针对样品分析物的固定抗体的电极；和 用于将计量样品移至电极的一个或多个泵件。
57.权利要求56的筒，还包括磁铁，其用于磁性消耗珠子的位置保持。
58.用于在全血样品中进行分析物免疫测定的试剂盒，其包括: 针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子，其中磁性消耗珠子能由磁场移动； 用于保留磁性消耗珠子的磁铁；和 免疫传感器，其中全血样品中的白细胞能与所述磁性消耗珠子结合，并且其中所述磁场能够保留所述磁性消耗珠子的至少一部分而不与所述免疫传感器接触。
59.权利要求58的试剂盒，其中所述免疫测定是夹心测定。
60.权利要求58的试剂盒，其中所述免疫测定是竞争性测定。
61.权利要求58的试剂盒，其中利用抗凝剂修正所述全血样品。
62.权利要求58的试剂盒，其中所述磁性消耗珠子包括利用苯乙烯-丙烯酸共聚物涂覆的磁铁矿(Fe3O4)核心。
63.权利要求58的试剂盒，其中所述磁性消耗珠子包括利用非人IgG或其片段涂覆的磁性珠子。
64.权利要求58的试剂盒，其中所述磁性消耗珠子具有0.01 μ m至20 μ m的平均粒度。
65.权利要求58的试剂盒，其中所述磁性消耗珠子具有0.1 μ m至5 μ m的平均粒度。
66.权利要求58的试剂盒，其中所述磁性消耗珠子具有3μ m至5 μ m的平均粒度。
67.权利要求58的试剂盒，其中所述磁性消耗珠子存在于一种或多种可溶解的干试剂涂层中。
68.权利要求58的试剂盒，其中所述磁铁是永久磁铁。
69.权利要求58的试剂盒，其中所述磁铁是电磁铁。
70.权利要求58的试剂盒，其中至少50wt.%的磁性消耗珠子被保留而不与免疫传感器接触。
71.权利要求58的试 剂盒，其中至少75wt.%的磁性消耗珠子被保留而不与免疫传感器接触。
全文摘要
提供了用于在分析物免疫测定中减少来自白细胞的干扰的方法和设备。在一个实施方案中，提供了方法，所述方法包括下列步骤利用针对白细胞进行了调理作用的磁性消耗珠子修正生物样品，将样品中的白细胞与磁性消耗珠子结合，以及通过磁性保留珠子而不与免疫传感器接触。
文档编号G01N33/543GK103154738SQ201180037381
公开日2013年6月12日 申请日期2011年6月14日 优先权日2010年6月14日
发明者J·L·E·坎贝尔, G·戴维斯 申请人:雅培医护站股份有限公司