专利名称：一种a-型原花青素代谢产物的分析方法
技术领域：
本发明涉及一种A-型原花青素代谢产物的分析方法。
背景技术：
原花青素(procyanidins，PC)是植物界中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称，自然界中的原花青素是由不同数量的儿茶素和表儿茶素结合而成的，因其单体连接方式不同，可以分为A-型(C2-0-C7或C2-0-C5连接)和B-型(C4-C8或C4-C6连接)两种。 A-型原花青素具有较强的清除自由基、抑菌、降血脂、抑制动脉粥样硬化等的抗氧化活性， 具有极大的开发和利用价值。A-型原花青素在生物体内经过动物小肠吸收进入血液，以单体及其甲基化形式存在，到达结肠后被肠道微生物降解，形成了多种酚酸及其衍生物并通过尿液排出。目前，在药物代谢动力学研究中，常通过动物体内和体外的研究方法，揭示药物在体内的动态变化规律，获得药物的基本代谢参数。体内药物分析所采用的生物样品包括血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、胆汁、胃液、淋巴液、粪便等，其中最常见的是血清和尿液，能很好的体现药物浓度和治疗作用之间的关系。生物样品中的目标物质必须进行分离纯化才能进行检测分析，对于药物或其代谢物与体内内源性物质结合生成的缀合物，在分离纯化之前还需要进行水解使之释放。检测分析方法包括高效液相色谱法(HPLC)、 液相色谱-质谱联用法(HPLC-MQ、气相色谱法(GC)、紫外分光光度法、荧光偏振免疫法等。到目前为止，国内外还尚未见关于A-型原花青素的代谢产物及其代谢产物分析方法的报道。单一黄烷醇类物质的代谢产物可直接利用有机溶剂对酶解产物进行萃取分离，继而对有机相进行检测，这是目前最常用的样品处理方法。但如果代谢产物组分较为复杂，目标物含量较少时，就会导致萃取回收率低，目标物受到干扰。A-型原花青素组分复杂，与单一受试物相比，仅利用有机溶剂提取并不能完全地将代谢产物分离纯化，且不易检出定量。

发明内容
本发明的目的是提供一种A-型原花青素代谢产物的分析方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的—种A-型原花青素代谢产物的分析方法，所述分析方法包括生物样品的采集、 A-型原花青素代谢产物溶液的制备以及A-型原花青素代谢产物的检测，所述A-型原花青素代谢产物溶液的制备包括以下步骤(1)制备水解产物用0. 2-1. Ommol/L的醋酸溶液调节生物样品的pH值至5. 5，加入β -葡萄糖醛酸酶，37°C水解1-3小时后，用2-6mol/L的盐酸溶液调节pH值至2后终止反应，于4°C下离心10分钟，取上清液，得到水解产物；(2)制备代谢产物粗提物将水解产物用乙酸乙酯萃取，合并酯相，真空浓缩除去乙酸乙酯后复溶于甲醇水溶液中，得到代谢产物粗提物；
(3)代谢产物粗提物的纯化将代谢产物粗提物经过C18固相萃取柱吸附纯化，用清水洗净，再用甲醇洗脱定容，得到A-型原花青素代谢产物溶液。所述生物样品为动物血清和/或尿液。步骤(1)中所述的离心为10000-15000转/分的高速离心。步骤(3)中所述的甲醇洗脱的流速为Hml/分。本发明的有益效果1、由于A-型原花青素代谢产物组分较为复杂，本发明采用固相萃取的方法对粗提物进行分离纯化，将C18填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品上柱时， 由于受到“吸附”、“分配”或其他作用，药物被保留在固定相上，用纯水清洗，以甲醇为洗脱剂洗脱，从而达到分离纯化的目的。该方法有效避免了液液萃取中水相和有机相的乳化现象，减少了杂质引入和环境污染。2、本发明能够用于分析多种生物样品中的A-型原花青素代谢产物，对处理后的代谢产物进行HPLC和HPLC-MS分析，结果准确性高、重现性好。3、本发明的分析方法高效快速，不仅有助于了解A-型原花青素的代谢机理和代谢产物，也为进一步利用A-型原花青素起到了重要的作用。


图1 :A-型原花青素的HPLC色谱图。图2 尿液代谢产物固相萃取前的HPLC色谱图。图3 尿液代谢产物固相萃取后的HPLC色谱图。图4 血清代谢产物固相萃取后的HPLC色谱图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明实施例1一种A-型原花青素代谢产物的分析方法，包括以下步骤1、生物样品的采集(1)分组取SD大鼠15只，雄性，体重200 士 20g，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。实验分3组，正常组，低剂量(150mg/kg)和高剂量(300mg/kg)A-型原花青素组，每组5只大鼠。(2)给药将SD大鼠在SPF级动物房饲养一个星期后，开始实验。将冷冻干燥的 A-型原花青素粉末150mg、300mg溶于IOml生理盐水中配成混悬液，给予低剂量和高剂量组大鼠灌胃，正常组直接以生理盐水替代。灌胃前大鼠禁食给水12-18h，于下午4点开始灌胃，灌胃后将大鼠置于代谢笼中，收集其18h内排出的尿液，分析前-80°C冷冻保存。(3)采血将冷冻干燥的A-型原花青素粉末300mg溶于IOml生理盐水中配成混悬液，正常组以生理盐水代替。灌胃前大鼠禁食给水12-1他，于下午4点灌胃，灌胃Ih后， 对大鼠腹腔注射水合氯醛局部麻醉，颈部脱白处死，从大鼠肝门静脉抽取血液，于4°C下高速离心IOmin取上清，分析前-80°C冷冻保存。2、代谢产物的制备
(1)制备水解产物用0. 2-1. Ommol/L的醋酸溶液调节生物样品的pH值至5. 5，加入β -葡萄糖醛酸酶，37°C水解1-3小时后，用2-6mol/L的盐酸溶液调节pH值至2后终止反应，于4°C下离心10分钟，取上清液，得到水解产物；(2)制备代谢产物粗提物将水解产物用乙酸乙酯萃取，合并酯相，真空浓缩除去乙酸乙酯后复溶于甲醇水溶液中，得到代谢产物粗提物；(3)代谢产物粗提物的纯化将代谢产物粗提物经过C18固相萃取柱吸附纯化，用少量清水洗净，再用甲醇洗脱定容，得到A-型原花青素代谢产物溶液。所述β -葡萄糖醛酸酶为Type H_5型，每100微升血清中加入200-500U，每毫升尿液中加入0. 5-1. 5KU进行水解。3、代谢产物的检测(1)代谢产物的HPLC检测色谱柱ZORBAXEclipse XDB-Cw (150mmX 4. 6mm，5 μ m)；柱温28°C ；检测波长 280nm ；流速:lmL/min ；流动相=A为0. 4%的醋酸水溶液，B为乙腈。洗脱梯度:0-40min, 5-35 % B ；40-45min, 35-50 % B ；45_50min，50-80 % B ；50_55min，80-5 % B,柱平衡 IOmin,进样量20μ 1。(2)代谢产物的HPLC-MS检测液相色谱条件同上，质谱选用负离子模式，电喷雾气压为20psi，干燥气流速为 7.0L/min，干燥温度为325°C。离子扫描范围50-1200m/z，重点关注分子量300左右的小分子物质，同时进行二级破碎。(3) A-型原花青素药物的HPLC检测对大鼠灌胃药物A-型原花青素进行HPLC分析，色谱条件同代谢物的检测，进样量 10 μ 1。A-型原花青素代谢产物的分析结果尿液和血液中A-型原花青素的代谢产物，经过HPLC和HPLC-MS检测分析Α_型原花青素代谢后主要以3-羟基苯乙酸，3-羟基苯丙酸，4-羟基苯丙酸，ρ-香豆酸，m-香豆酸， 咖啡酸，香草酸，莽草酸及其衍生物等小分子酚酸的形式通过尿液排出；而在血清中仅发现有少量原花青素单体及其甲基化形式的物质存在。1、尿液代谢产物的HPLC分析由于A-型原花青素的代谢产物比较复杂，如图2所示，未经过固相萃取柱纯化的尿液代谢产物，不能通过C18色谱柱有效分离，拖尾现象非常严重，无法对其中的产物进行质谱解析。C18柱吸附纯化后，从图3中明显可以看到，在10-35min之间出现了 10余种物质，其中大部分都在277nm左右有最大吸收峰，可推断其属于黄烷醇类物质。说明纯化后极大地优化了代谢产物的可检测性，且准确性更高。2、尿液中代谢产物的鉴定利用HPLC-MS对尿液中A-型原花青素的代谢产物进行分析，通过与灌胃原样(如图1所示)和与酚酸标准品的比对，发现A-型原花青素经过代谢产生了多种酚酸及其衍生物，一部分未被吸收利用的原花青素以其母体或甲基化的形式通过尿液排出体外。特别鉴定了其中存在的儿茶素、表儿茶素、A2和三聚体{表儿茶素—8，2β —0 — 7)-表儿茶素— 8)-表儿茶素}及其衍生物等，见表1。目前已经鉴定的酚酸包括3-羟基苯乙酸，3-羟基苯丙酸，4-羟基苯丙酸，ρ-香豆酸，m-香豆酸，咖啡酸，香草酸和莽草酸。多次重复后，结果重现性高。继续进行定量分析，可以得到各代谢物的排出量。3、血液中原花青素的代谢产物从图4中不难看出，大鼠血清中含有一定量的表儿茶素单体(表幻，可通过计算得到其浓度，并作为评价A-型原花青素在生物体内吸收率的一种手段。表1大鼠尿液中A-型原花青素的代谢产物分析
权利要求
1.一种A-型原花青素代谢产物的分析方法，其特征在于所述分析方法包括生物样品的采集、A-型原花青素代谢产物溶液的制备以及A-型原花青素代谢产物的检测，所述A-型原花青素代谢产物溶液的制备包括以下步骤(1)制备水解产物用0.2-1. Ommol/L的醋酸溶液调节生物样品的pH值至5. 5，加入 β-葡萄糖醛酸酶，37°C水解1-3小时后，用2-6mol/L的盐酸溶液调节pH值至2后终止反应，于4°C下离心10分钟，取上清液，得到水解产物；(2)制备代谢产物粗提物将水解产物用乙酸乙酯萃取，合并酯相，真空浓缩除去乙酸乙酯后复溶于甲醇水溶液中，得到代谢产物粗提物；(3)代谢产物粗提物的纯化将代谢产物粗提物经过C18固相萃取柱吸附纯化，用清水洗净，再用甲醇洗脱定容，得到A-型原花青素代谢产物溶液。
2.如权利要求1所述的A-型原花青素代谢产物的分析方法，其特征在于所述生物样品为动物血清和/或尿液。
3.如权利要求1所述的A-型原花青素代谢产物的分析方法，其特征在于步骤(1)中所述的离心为10000-15000转/分的高速离心。
4.如权利要求1所述的A-型原花青素代谢产物的分析方法，其特征在于步骤(3)中所述的甲醇洗脱的流速为Hml/分。
全文摘要
本发明公开了一种A-型原花青素代谢产物的分析方法，该方法包括生物样品的采集、代谢产物溶液的制备以及代谢产物的检测等步骤，其中代谢产物溶液的制备包括制备水解产物、制备代谢产物粗提物和代谢产物粗提物的纯化三个步骤。本发明样品分离纯化的效果好，方法高效快速，结果准确性高、重现性好，不仅有助于了解A-型原花青素的代谢机理和代谢产物，也为进一步利用A-型原花青素起到了至关重要的作用。
文档编号G01N1/40GK102539220SQ20121001991
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月21日 优先权日2012年1月21日
发明者刘亮, 周玮婧, 孙智达, 李书艺, 肖娟, 谢笔钧, 隋勇 申请人:华中农业大学