专利名称：近红外光谱鉴别贝母品种及检测其总生物碱含量的方法
技术领域：
本发明属于光学应用领域，尤其是一种近红外光谱快速鉴别不同品种贝母及检测其总生物碱含量的方法。
背景技术：
各种贝母成分相近，利用贝母特有的化学成分来区别不同品种的贝母有相当的难度。中国药典中5种贝母则缺少理化鉴别项(中国药典二部，化学工业出版社，2005)。已有许多报道采用性状鉴别法、紫外光谱法、薄层色谱法、DNA芯片技术、质谱法、蒸发光散色法、 衍生化法等对贝母进行定性与生物碱定量，一些出版物利用形态学和组织学以及分子生物学方法来鉴定贝母的物种类别(贝母类药材的性状鉴别，药材，2002，25(5) :321-324)，这已被报告过。然而，由于缺乏足够的特征去表示不同贝母鳞茎，形态组织学鉴定方法不能进行明确鉴定。关于分子生物学方法，其成功的关键在于所加工材料的DNA质量(DNA芯片技术用于贝母的基因分型和种类鉴别，药学学报，2003，38 (3) : 185-190)。此外，上述两项方法未能解决鉴定在外观或纹理上已损坏的贝母草药。最近，通过二维相关红外光谱鉴定淀粉， 虽然这一技术进行许多优点，包括速度快，简易性和可以用不完整样本，其应用可能仍然有限，因为贝母淀粉通常认为是无效的和废弃的成分。其中贝母留体生物碱是贝母起药理作用的成分。传统的测定方法如紫外法(无紫外吸收的贝母总生物碱定量分析方法研究李萍，曾令杰，李松林中国药学志，2002， 37(8).)、两相滴定法(酸性染料两相滴定法测定浙贝母总生物碱的含量.中国现代应用药学杂志，1998，15(3).)、高效液相色谱法(HPLC法测定市售贝母中贝母乙素素含量.中草药.2001,32(1) :24 25)。样品处理过程及操作复杂，难以实现快速检测。

发明内容
为了克服不同品种贝母定性的不明确性及高效液相色谱法测定其生物碱含量的操作繁杂，本发明提供一种近红外光谱快速鉴别贝母品种及检测其总生物碱含量的方法。本发明的目的之一是提供一种近红外光谱鉴别贝母品种的方法，包括如下步骤①收集贝母样品；本发明中所建立的贝母样品库包括炉贝母、松贝母、青贝母、大浙贝母、小浙贝母、伊贝母和平贝母，其中浙贝母包括大贝和珠贝。②测定贝母样品的近红外漫反射光谱谱图，取谱图中4000 5000CHT1波段进行预处理，并对经预处理后的近红外光谱谱图进行聚类分析，建立定性模型；其中，谱图预处理的方法选自下列方法中的一种或几种一阶导数法、二阶导数法、矢量归一法、直线差减法、多元散射校正或最小-最大归一法，优选使用一阶导数法；建立定性模型的方法选自下列方法中的一种或几种第一范围标定法、标准算法、因子法、一阶导数法或二阶导数法，优选第一范围标定法；③测定待测贝母样品的近红外漫反射光谱谱图，采用与步骤②相同的预处理方法，处理所得谱图中4000 5000CHT1波段，并根据步骤②所建立的模型判断待测贝母样品的品种。

上述本发明的方法中，可以采用现有技术中的多种方式采集近红外光谱，发明人优选使用应用BRUKER公司的傅立叶变换近红外光谱仪采集样品的近红外漫反射光谱，其采样装置为积分球漫反射测样器件。本发明的另一目的是提供一种近红外光谱检测贝母总生物碱含量的方法，包括如下步骤①收集贝母样品，溴麝香草酚蓝比色法测定样品中生物碱含量；②测定贝母样品的近红外漫反射光谱谱图，取谱图中4000 7000CHT1波段内经预处理后得到的吸光度，与溴麝香草酚蓝比色法测得的该样品的生物碱含量相关联，采用偏最小二乘法、主成分回归法和多元线性回归法中的一种或几种方法建立校正模型；优选使用偏最小二乘法；③测定待测贝母样品的近红外漫反射光谱谱图，采用与步骤②相同的预处理方法处理所得谱图中4000 7000CHT1波段，将预处理后得到的吸光度值代入步骤②的校正模型，得到待测贝母样品中生物碱含量。本发明所述的该方法中，测定样品近红外漫反射光谱的扫描范围是3700 12000CHT1。谱图预处理方法选自下列方法中的一种或几种矢量归一化法、内标法法、多元散射校正法、一阶导数法和最小_最大归一化法。优选采用一阶导数法。下面对本发明的内容作详细描述。本发明分为两部分不同种类贝母的品种鉴别 (即定性鉴别)和总生物碱含量测定。一、对7种贝母的定性鉴别，包括2个步骤定性模型的建立和定性模型的验证。(一)建立定性模型1.样品浙贝母(大贝)Fritillariathunbergii Miq、伊贝母Fritillaria pallidiflora Schrenk、平贝母 Fritillaria ussuriensis Maxim、青贝母 Fritillaria unibraacteate Hsiao et. K. C. Hsia、松贝母Fritillaria cirrhosa D. Don、炉贝母Fritillaria delavayi Franch、浙贝母(珠贝)Fritillaria thunbergii Miq。共 7 种贝母。2.样品的预处理7种贝母药材经60°C烘干12h，瓷制研钵研粉碎30min，过100目筛，7种贝母样品各得到约6克粉末。3.贝母近红外光谱的采集取7种贝母适量，放入样品瓶中，以金箔为参比，积分球漫反射，扫描范围3700 12000CHT1，分辨率4cm—1。每个样品重复5次，取中间3次入库并求其平均光谱。谱图如图 1所示。4.数据处理本发明采用德国Bruker公司的OPUS软件进行数据处理。对7种贝母的谱图进行聚类分析，并建立定性模型。5.聚类分析(1)聚类分析方法选择为了得到最适宜的定性方法，首先对7种不同品种的贝母做聚类分析测试，经过经验方法，取光谱信息丰富、强度相对较大的3800 T^OcnT1的谱段进行聚类分析，通过实验结果比较，聚类参数选择一阶导数(First derivative)为光谱预处理方法，以第一范围标定(scaling to 1st range)为算法，平滑点数(smoothing points)设为13，以公式计算不同种类贝母近红外光谱的平均距离。(2)聚类分析结果聚类分析图(图2)中纵行高度为马氏距离，数值差别越大，表示不同类别贝母的光谱平均距离越大，表示分的越开。同为川贝的3种松贝、青贝、炉贝先聚为一类；平贝母、 大浙贝母聚为一类，再与伊贝母聚为一类，最后与小浙贝母聚为一类。在发明的光谱实验和聚类分析参数条件下，可以将7种贝母光谱分开。6.光谱预处理方法的选择不同种贝母药材的近红外光谱原谱很相似。截取光谱信息相对最丰富、强度相对较大的区段4000 9000CHT1，这种近红外光谱普遍存在的谱带重叠、解析较难等问题还是比较突出，必须应用光谱预处理方法进行处理后才能扩大谱图之间的差异，提取谱图变化的信息，并将其定性区分。首先对7种贝母的谱图进行预处理，通过预处理使谱图之间的差别得以扩大，提取更有效的光谱信息，提高信噪比，本文采用一阶导数法(first derivative)。7.光谱算法的选择参照聚类分析方法结果，以第一范围标定法(scaling to 1st range)为定性分析算法，平滑点数为13，选取优化后的波段4000 5000CHT1对谱图进行分析。8.阈值的设定Dt = Dfflax+x SDev.其中Dt为阈值，Dmax为最大匹配值(光谱距离最大值)、χ为统计学参数，SDev为标准偏差。求阈值时第一范围标定法的χ参数值射为4。对该方法的建立结果如表1。9.选择性参数S判定模型科学性以上定性方法的选择性系数S如表1表1第一范围标定法处理结果
权利要求
1.近红外光谱鉴别贝母品种的方法，包括如下步骤①收集贝母样品；②测定贝母样品的近红外漫反射光谱谱图，取谱图中4000 5000CHT1波段进行预处理，并对经预处理后的近红外光谱谱图进行聚类分析，建立定性模型；其中，谱图预处理的方法选自下列方法中的一种或几种一阶导数法、二阶导数法、矢量归一法、直线差减法、多元散射校正或最小-最大归一法；建立定性模型的方法选自下列方法中的一种或几种第一范围标定法、标准算法、因子法、一阶导数法或二阶导数法；③测定待测贝母样品的近红外漫反射光谱谱图，采用与步骤②相同的预处理方法处理所得谱图中4000 5000CHT1波段，并根据步骤②所建立的模型判断待测贝母样品的品种。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤①的贝母样品包括炉贝母、松贝母、青贝母、大浙贝母、小浙贝母、伊贝母和平贝母。
3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述谱图的预处理的方法是一阶导数法，建立定性模型的方法是第一范围标定法。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于所述贝母样品的近红外漫反射光谱采集方式是应用BRUKER公司的傅立叶变换近红外光谱仪采集样品的近红外漫反射光谱，其采样装置为积分球漫反射测样器件。
5.近红外光谱检测贝母总生物碱含量的方法，包括如下步骤①收集贝母样品，溴麝香草酚蓝比色法测定样品中生物碱含量；②测定贝母样品的近红外漫反射光谱谱图，取谱图中4000 7000CHT1波段内经预处理后得到的吸光度，与溴麝香草酚蓝比色法测得的该样品的生物碱含量相关联，采用偏最小二乘法、主成分回归法和多元线性回归法中的一种或几种方法建立校正模型；③测定待测贝母样品的近红外漫反射光谱谱图，采用与步骤②相同的预处理方法处理所得谱图中4000 7000CHT1波段，将预处理后得到的吸光度值代入步骤②的校正模型，得到待测贝母样品中生物碱含量。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于所述贝母样品的近红外漫反射光谱采集方式是应用BRUKER公司的傅立叶变换近红外光谱仪采集样品的近红外漫反射光谱，其采样装置为积分球漫反射测样器件。
7.权利要求5所述的方法，其特征在于所述谱图的预处理方法选自下列方法中的一种或几种矢量归一化法、内标法法、多元散射校正法、一阶导数法和最小-最大归一化法。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于所述谱图的预处理方法是一阶导数法。
9.权利要求5所述的方法，其特征在于步骤②建立校正模型的方法是偏最小二乘法。
全文摘要
近红外光谱鉴别贝母品种及检测其总生物碱含量的方法，包括如下步骤①收集贝母样品；②测定贝母样品的近红外漫反射光谱谱图，取谱图中4000～5000cm-1波段进行预处理，并对经预处理后的近红外光谱谱图进行聚类分析，建立定性模型；或者取谱图中4000～7000cm-1波段内经预处理后得到的吸光度，与溴麝香草酚蓝比色法测得的该样品的生物碱含量相关联，采用偏最小二乘法、主成分回归法和多元线性回归法中的一种或几种方法建立生物碱检测的定量校正模型；③采集待测样品近红外光谱谱图，进行相应的预处理后使用所建立的定性模型或定量模型鉴别贝母品种及检测其总生物碱含量。本发明方法快速、无损伤、环境友好、成本低廉。
文档编号G01N21/47GK102175648SQ20111000079
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月4日 优先权日2011年1月4日
发明者姜博海, 孟昱, 宋其玲, 李悦青, 王世盛, 蔡蕊, 赵伟杰, 高志刚 申请人:大连理工大学