专利名称：一种用于动物血浆米尔贝肟含量测定lc-ms/ms方法
技术领域：
本发明属于兽药含量测定及药代动力学研究领域，涉及一种兽药在生物样品中测 定含量的方法，尤其涉及一种测定动物血浆中米尔贝肟含量的方法及样品前处理方法。
背景技术：
米尔贝肟是大环内酯类抗体内外寄生虫药物，是米尔贝霉素A3和A4的肟衍生物， 主要通过增强虫体的抑制性神经递质Y “氨基丁酸的释放使虫体麻痹死亡，通常用来预防 恶丝虫病，控制线虫、钩虫引发的犬、猫疾病及犬的鞭虫病。1997年，我国台湾地区推出台湾 诺华股份有限公司生产的以米尔贝肟为主要成分的倍脉心，作为犬猫预防心丝虫与肠内寄 生虫内服药，是米尔贝肟首次在中国应用。由于米尔贝肟对体内外寄生虫均有很好的驱杀 作用，并对阿维菌素类药物敏感的犬毒性较小，其应用和研究越来越受到重视。现用于大环内酯类抗寄生虫药物检测的方法有薄层层析法、免疫化学法和高效液 相色谱法，其中薄层层析法主要用于伊维菌素在牛粪便中的降解评价，实验操作繁琐、耗 时，且荧光衍生物易降解；免疫化学方法存在较强的交叉反应性；高效液相色谱法因其高 分离能力而占有很大优势，在大环内酯类抗寄生虫药物检测中的应用越来越广泛，其中包 括紫外检测器、荧光检测器、质谱检测等，紫外检测因为灵敏度不够高，而主要用于药物含 量较高的样品；荧光检测器检测涉及到衍生化，虽然衍生化方法越来越成熟，由最初的用十 个小时的反应时间，到现在的几十秒钟，衍生化产物的稳定性也有所提高，但因米尔贝肟5 位有肟基团，有多个共轭二烯结构，衍生化产物复杂，不利于检测，且该法检测下限仅达能 达到0. 5μ g/mL，远远达不到血浆样品低含量检测的需要；尤其在药代动力学、药物残留规 律研究中，生物样品如血浆、组织中的药物浓度极微量情况下，上述测定方法难以满足检测 要求；而LC-MS/MS是以质谱为检测手段的色谱技术，它集液相色谱的高分离能力和质谱的 高灵敏度和高选择性于一体，在药物的定量分析中占有很大的优势。但目前尚无该法用于 动物血浆中米尔贝肟的含量测定。

发明内容
本发明针对上述现有用于检测动物血浆中米尔贝肟含量技术存在的问题，研究提 供一种用于动物血浆中米尔贝肟的含量测定LC-MS/MS方法，具有简单快速、灵敏度高、检 测限低的特点。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种用于动物血浆米尔贝肟含量测定LC-MS/MS方法，血浆样品进行如下处理 ImL血浆样品加入4mL乙腈和0. 3g氯化钠，在微型混合器上充分涡旋lmin，以3500r/min 离心5min，取上清于尖底玻璃离心管中，50°C氮气流下吹干，残留物按1 9比例加3mL甲 醇-5mmol/L乙酸铵，涡旋混勻，于C18固相萃取柱进行纯化；依次用3mL甲醇、3mL水活化 萃取小柱，加入上样液，用2mL水冲洗，再用3mL 10 90体积比的甲醇-5mmol/L乙酸铵和 3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，50°C氮气流下吹干，残渣用ImL流动相溶解，过0. 22 μ m微孔尼龙膜，取5 μ L进样，采用液相色谱_质谱联用仪按以下色谱条件进行LC-MS/MS分析离子化方式为电喷雾条件，氮气喷雾压力49psi，喷雾电压4800V，氩气压力 20psi，温度300°C，Source CID-12V。米尔贝肟检测的m/z为536。全扫描方式检测m/z为 536的碎片离子；流动相组成乙腈0. 5mmol/L乙酸铵=85 15，流速0. 25mL/min，柱温 20°C。所述的生物样品优选为犬血浆。本发明具有以下优点1.专属性强本发明经空白血浆样品和含药血浆样品的LC-MS/MS分析，可见血浆 中米尔贝肟的A3和A4分离良好，无内源性物质干扰，证明该法对血浆中米尔贝肟的检测专 属性强；2.标准曲线回归性好，定量限低本发明经线性范围与血浆标准曲线测定试验， 证明米尔贝肟在2 500ng/mL范围内，浓度与响应比呈良好的线性关系，犬血浆样品工作 曲线为y = 94. 2379x-60. 4477，r = 0. 999551，定量限为5ng/mL，能够满足于低含量药物的 检测；3.基质效应小本发明在试验中证明，米尔贝肟在5. 0,150. 0,400. 0ng/mL3种浓 度在Beagle犬血浆中的基质抑制率均小于17%，在质谱检测要求范围内；4.精密度和准确度高本发明在试验中证明，米尔贝肟在5. 0,150. 0,400. Ong/mL 3种浓度测定的批内和批间RSD%均在5%之内，血浆样本的分析方法符合有关规范要求；5.稳定性好本发明在试验中证明，米尔贝肟血浆样品冰冻放置六个月后，所有 样品的准确度绝对值均小于15%，表明长期冰冻放置血浆样品，不影响本方法对样品浓度 进行准确测定；血浆样品室温放置12h后测定，所有样品的准确度绝对值均小于15%，说明分析 测试过程中的样品较为稳定；血浆样品经反复冻融3次，每一冻融周期超过24h，与未经冻融的样品进行对比， 所有样品的准确度绝对值均小于15%，说明反复冻融血浆样品，不影响本方法对样品浓度 进行准确测定。


图1米尔贝肟A3扫描质谱2米尔贝肟A4扫描质谱3米尔贝肟标准品色谱4空白血浆色谱5血浆添加米尔贝肟标准品色谱6待测样品色谱7米尔贝肟血浆样品标准曲线图
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明。实施例1本发明动物血浆中米尔贝肟含量LC-MS/MS测定方法的建立
1.标准溶液的配制称取0. 5mg米尔贝肟标准品，置于IOOmL容量瓶中，用乙腈定容 至刻度，配制成相当于米尔贝肟5 μ g/mL的标准储备液。根据试验需要，用流动相稀释至所 需浓度的标准工作液，用于绘制标准曲线。标准储备液和标准工作液均在_20°C保存；2.血浆样品前处理ImL血浆样品加入4mL乙腈和0. 3g氯化钠，在微型混合器上 充分涡旋lmin，以3500r/min离心5min，取上清于尖底玻璃离心管中，50°C氮气流下吹干， 残留物按1 9比例加3mL甲醇-5mmol/L乙酸铵，涡旋混勻，于C18固相萃取柱进行纯化。 依次用3mL甲醇、3mL水活化萃取小柱，加入上样液，用2mL水冲洗，再用3mL 10 90体积 比的甲醇-5mmol/L乙酸铵和3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，50°C氮气流下吹干，残渣用ImL流 动相溶解，过0. 22 μ m微孔尼龙膜，取5 μ L进样，进行LC/MS/MS分析；3.检测仪器及分析条件美国Firmigan公司TSQ Quantum型液相色谱-质谱联用 仪即LC-MS/MS，由Finnigan Surveyor LC泵、Surveyor AS自动进样器、电喷雾离子化电离 源及三极串联质谱组成。控制软件为X caliber 1. 4，质谱数据分析采用LcqUan2. 0数据处 理系统；LC-MS/MS分析条件离子化方式为ESI电喷雾条件，氮气喷雾压力49psi，喷雾电 压4800V，氩气压力20psi，温度300°C，Source CID-12V。米尔贝肟检测的m/z为536。全 扫描方式检测m/z为536的碎片离子；流动相组成乙腈0.5mmol/L乙酸铵=85 15， 流速 0. 25mL/min,柱温 20 °C ；4.线性范围与血浆标准曲线测定取犬空白血浆lmL，依次加入米尔贝肟标准液 0. ImL,配制成相当于血浆浓度为5，10，50，100，150，200，500ng/mL的血浆样品，每点为3个 样本。按“血浆样品前处理”项下操作，建立工作曲线，连续测定3天。以待测物浓度为横 坐标，待测物色谱图的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得直线回 归方程，即为工作曲线；5.方法的专属性试验取Beagle犬空白血浆lmL，除不加标准工作液外，按“线性范 围与血浆标准曲线测定”项下方法操作，获得空白样品的色谱图；将一定浓度的米尔贝肟加 入Beagle犬空白血浆，依同法操作，获得相应色谱图；同样方法获得Beagle犬给药后血浆 样品色谱图，考察犬血浆中内源性物质对米尔贝肟的测定有无干扰；6.提取回收率测定按“线性范围与血浆标准曲线测定”项下方法分别配制米尔贝 肟犬血浆中5. 0，150. 0,400. Ong/mL 3个标准浓度的样品，每点为6个样本，以提取后的米 尔贝肟色谱图的峰面积与空白血浆提取后加入相应浓度标准系列溶液处理后的样品进样 所得色谱图峰面积之比，考察样品的提取回收率；7.精密度试验用空白血浆加入米尔贝肟标准品溶液制成5. 0，150. 0,400. Ong/mL 3种浓度的血浆样品，按照“线性范围与血浆标准曲线测定”项下操作，每个浓度测定5个样 品，连续测定3天，并与标准曲线同时进行，以当日的标准曲线计算样品浓度，计算日内、日 间精密度；8.检测限和定量限的确定向空白血浆中添加米尔贝肟标准品来确定检测限，将信 噪比为10的检测量定为定量限，信噪比为3的检测量定为检测限；9.基质效应空白血浆基质添加5. 0，150. 0,400. Ong/mL浓度的标准品，对相应浓 度的标准品，测定计算基质抑制效应；10.稳定性试验米尔贝肟血浆样品在冷冻条件下保存的稳定性按线性范围与血浆标准曲线测定”项下方法制备标准质控样品，每点3个样本，冰冻放置6个月后测定样品 浓度；待测样品溶液室温稳定性按“线性范围与血浆标准曲线测定”项下方法制备标准 质控样品，每点3个样本，于室温放置0h、24h后分别测定；血样冻融稳定性按“线性范围与血浆标准曲线测定”项下方法制备标准质控样 品，每点3个样本，经反复冻融3次(每一冻融周期超过24h)后处理样品并测定，与未经冻 融的样品进行对比。试验结果如下1.方法的专属性波长238nm时米尔贝肟的紫外检测色谱图显示出A3肟和A4肟 的保留时间分别为4. 947min和5. 564min，两峰分离良好，然后在液质确定的条件下对两峰 分析。取一定浓度的米尔贝肟标准溶液，测定其扫描色谱图及质谱图，以确定选择离子检测 的质量数。米尔贝肟A3和A4的LC/MS/MS扫描质谱图见图1和图2，m/z分别为538. 94和 556，子离子有m/zl67. 0，230. 2，245. 0和538. 2，以m/zl67. 0和538. 2为监控离子进行定 量。米尔贝肟在Beagle犬血浆中的LC-MS/MS选择离子流色谱图分别见图3 5，从图中可 以看出，米尔贝肟的保留时间为1.51min，血浆中内源性物质不干扰米尔贝肟的测定。图6 为Beagle犬给药后药物血浆色谱图，可见该方法可用于样品检测。2.标准曲线及线性范围由图7可见米尔贝肟在2 500ng/mL范围内，浓度与响 应比呈良好的线性关系，犬血浆样品工作曲线为y = 94. 2379X-60. 4477，r = 0. 999551。定 量限为5ng/mL。3.提取回收率3个浓度下犬血浆的提取回收率分别平均为(87. 5士6.1)%、 (86. 4士7. 9) % 0、(95. 4士 13. 2) %，符合质谱检测的要求，见表1。表1米尔贝肟在Beagle犬血浆中的提取回收率(η = 5，[士SD) 4.基质效应由表2可见米尔贝肟低、中、高三种浓度在Beagle犬血浆中的基质 抑制率均小于17%，在质谱检测要求范围内。表2米尔贝肟在Beagle犬血浆中的基质抑制率(n = 5，i ±SD ) 5.精密度和准确度由表3可见，米尔贝肟低、中、高三种浓度测定的批内和批间 RSD%均在5%之内，血浆样本的分析方法符合有关规范要求。表3米尔贝肟在犬血浆中的精密度和准确度( 士 SD) 6.稳定性试验由表4可见，米尔贝肟血浆样品冰冻放置6个月后，所有样品的准 确度绝对值均小于15%，表明长期冰冻放置血浆样品，不影响本方法对样品浓度进行准确 测定；由表5可见，血浆样品室温放置12h后测定，所有样品的准确度绝对值均小于15%， 说明分析测试过程中的样品较为稳定；血浆样品经反复冻融3次，每一冻融周期超过24h， 与未经冻融的样品进行对比，所有样品的准确度绝对值均小于15%，说明反复冻融血浆样 品，不影响本方法对样品浓度进行准确测定，见表6。表4血浆样品中米尔贝肟6个月冻存稳定性 表5犬血浆样品中米尔贝肟室温放置12h稳定性 表6血浆样品中米尔贝肟的反复冻融稳定性 实施例2本发明动物血浆中米尔贝肟含量LC-MS/MS测定方法及样品前处理方法 在犬血浆药代动力学研究中的实际应用采用米尔贝肟片及健康无任何急性和慢性疾病比格犬进行方法应用考察，米尔贝 肟片即倍脈心，规格2. 5mg/片，批号090601，日本三共制药生产。按照米尔贝肟0. 25mg/kg 剂量对6只Beagle犬单次口服给药，给药前禁食12h，自由饮水，于给药后0. 5、1、1. 5、2、4、 6、8、12、24、36、48h，四肢静脉交替采血5mL，肝素抗凝，以3500r/min离心lOmin，分离血浆， 置-20°C保存待测。按照血浆样品处理方法进行处理和测定。结果表明，犬口服米尔贝肟片后的血药浓度见表7，药代动力学参数见表8 ;Cmax 为(74. 25士2. 06)ng/mL ;Tmax 为(4.07±0.20h) ；t1/2(ke)为(11. 66士0. 93)h ;AUC。_t 为 (1517. 99士70. 84)ng · h/mL, AUCchoo分别为(1649. 64士82. 61)ng · h/mL。表7Beagle犬单次口服给药后的血药浓度Time(h)浓度(ng/mL)/i ±SD 对口服给药后米尔贝肟血药浓度-时间数据进行房室模型拟合，结果表明受试 化合物在犬体内的动力学过程符合一室模型。
权利要求
一种用于动物血浆米尔贝肟含量测定LC MS/MS方法，其特征在于血浆样品进行如下处理1mL血浆样品加入4mL乙腈和0.3g氯化钠，在微型混合器上充分涡旋1min，以3500r/min离心5min，取上清于尖底玻璃离心管中，50℃氮气流下吹干，残留物按1∶9比例加3mL甲醇 5mmol/L乙酸铵，涡旋混匀，于C18固相萃取柱进行纯化；依次用3mL甲醇、3mL水活化萃取小柱，加入上样液，用2mL水冲洗，再用3mL 10∶90体积比的甲醇 5mmol/L乙酸铵和3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，50℃氮气流下吹干，残渣用1mL流动相溶解，过0.22μm微孔尼龙膜，取5μL进样，采用液相色谱 质谱联用仪按以下色谱条件进行LC MS/MS分析离子化方式为电喷雾条件，氮气喷雾压力49psi，喷雾电压4800V，氩气压力20psi，温度300℃，Source CID 12V；米尔贝肟检测的m/z为536；全扫描方式检测m/z为536的碎片离子；流动相组成乙腈∶0.5mmol/L乙酸铵＝85∶15，流速0.25mL/min，柱温20℃。
2.根据权利要求1所述的一种用于动物血浆米尔贝肟含量测定LC-MS/MS方法，其特征 在于所述生物样品优选为犬血浆。
全文摘要
一种用于动物血浆米尔贝肟含量测定LC-MS/MS方法属兽药含量测定、药代动力学及残留规律领域；1mL血浆样品加4mL乙腈和0.3g氯化钠，混合后离心，上清液用氮气吹干，残留物以1∶9比例加3mL甲醇-5mmol/L乙酸铵，于C18固相萃取柱净化；采用液相色谱-质谱联用仪按以下条件分析电喷雾离子化方式，氮气喷雾压力49psi，喷雾电压4800V，氩气压力20psi，温度300℃，Source CID-12V。m/z 536；全扫描方式检测m/z为536的碎片离子；流动相组成乙腈∶0.5mmol/L乙酸铵＝85∶15，流速0.25mL/min，柱温20℃；本发明具有快速、灵敏、检测限低的特点。
文档编号G01N30/72GK101915818SQ20101025261
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者于晓蕾, 刘永, 向文胜, 张耀藤, 徐倩倩, 曲明丽, 李继昌 申请人:东北农业大学