专利名称：荧光标记免疫抗体测定法医物证血型试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光标记免疫抗体测定法医物证血型的试剂盒，属于法医 物证检验领域的发明。
背景技术：
ABO血型系统的确立，至今已有百余年的历史，该系统的确立是人类医学发 展的里程碑，它也是法医学检验上应用的最早血型系统，它的应用给案件的侦 破及诉讼带来极大的方便。目前ABO血型系统仍然是我国法医学上的应用最为普遍的系统，只要犯罪 现场发现生物检材，就必须测定其血型，以便作为物证在案件起诉和审判时使 用。目前生物检材血型测定仍然采用传统的血清学方法检验。该方法检验生物 检材的血型，具有很大的弊端。第一，灵敏度低。检验需要一定的"量"，有时 在现场提取的检材由于量太少，不足以鉴定血型；第二，准确性差。对于现场 提取的不洁净检材的检验，由于特异性差，所以结果不准确；第三，该方法受 血清质量的制约，有时由于血清的质量不稳定导致错误的鉴定结论；第四，费 时费力。测定一个样品需要3-4小时；第五，对疑难检材极难测定血型。比如 毛干、指(趾)甲、汗液指纹血型的测定用传统的血清学方法就难以准确测定， 而上述的检材却是刑事案件中比较常见的生物检材，这种检材血型的测定对排 査犯罪嫌疑人、縮小侦察范围、案件的侦破、起诉以及审判都是必不可少的。 第六，传统的血清学方法每次检验都必须使用新鲜的A型、B型指示红细胞，在 司法实践中难以获得，也很不方便。
免疫荧光技术是近年来发展起来的一门广泛应用于现代生物学和医学中的 新兴技术，免疫荧光技术具有灵敏度高、特异性好、显色特别、检测速度快和 在细胞水平定位准确等优点，'己在免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临 床检验等许多方面得到广泛应用。免疫荧光技术根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧 光素，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检査细胞或组织内的相应抗原(或抗 体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受激 发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量 子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光(黄绿色或桔 红色)，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体 的性质和定位。发明内容本发明涉及一种用于测定法医物证血型的荧光标记抗体试剂盒，是由分离包装的抗A和抗B荧光标记抗体和0. 01M冊7. 2的PBS缓冲洗脱液组成，抗A 和抗B抗体均采用单克隆抗体。抗A荧光抗体用四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethylrodamineisothiocyanate， TMRITC,最大吸收光谱为550nm，最大发 射光谱620nm呈橙红色荧光)进行标记，抗B荧光抗体用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC,最大吸收光谱为490-495nm，最大发射光谱 为520-530nm，呈现黄绿色荧光)进行标记。 需要说明的是两种荧光标记物可以互换。
具体实施例方式
一、荧光抗体的标记1、 单克隆抗A抗体荧光标记(1) 单克隆抗A抗血清在0.01mo1/1 PH9.5碳酸盐缓冲液中透析过夜。(2) 将四甲基异硫氰酸罗达明溶于二甲亚砜(lmg/ml)，取此溶液300ul，逐 滴加入单克隆抗A抗血清溶液中(每毫克IgG加入5ixg)，同时电磁搅拌。(3) 在室温中搅拌12h，避光。(4) 把结合物移入直径3 cm，高30cm大小的Bio - gel P-6层析柱(用0. Olmol/1 PH8. O的PBS平衡过)，流速为1. 5ml/min。(5) 收集先流出的红色结合物，即为标记抗体，稀释到O. lmg/ml，分装，4°C 保存。2、 单克隆抗B抗体荧光标记(1) 抗体的准备取适量单克隆抗B抗血清(5mg/ml)溶液，置入三角烧瓶中， 加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌(速度适当以 不起泡沬为宜)5 10min。(2) 荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光 素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。(3) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入单克隆抗B抗血清溶液中，避免将荧 光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上(大约5 10min内加完)，加毕后，继续搅 拌12 18h。结合期间应保持蛋白溶液于4'C左右。(4) 透析结合完毕后，将溶液离心(2500r/min) 20min，除去其中少量之沉 淀物，装入透析袋中后再置于烧杯中，用PH8. 0缓冲盐水透析(0 4°C)过夜。(5) 过柱取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离荧 光素，收集标记的荧光抗体，稀释到0.1mg/ml，分装，4。C保存。
二、 试剂盒的制作-荧光标记抗A单克隆和荧光标记抗B单克隆抗体各1-2ml，分别包装； 0. 01M PH7. 2的PBS缓冲洗脱液20-50ml单独包装。三、 试剂盒的使用欲检验的检材转移到X光载物片的塑料胶带上，经过甲醇固定，每份检材 分别加荧光标记的抗A和抗B血清一滴，37。C吸收30分钟；用0.01MPH7.2的 PBS缓冲液洗脱没有结合的抗血清；荧光显微镜镜检。呈现红色荧光反应的为抗 A阳性，说明含有A抗原；呈现绿色荧光反应的为抗B阳性，说明含有B抗原； 无荧光反应者为O型检材。本发明可快速、准确获得法医物证的ABO血型，可用于法医物证检验。
权利要求
1、荧光标记免疫抗体测定法医物证血型试剂盒，该试剂盒包括a)两种荧光标记免疫抗体，b)0.01M PH7.2的PBS缓冲洗脱液，其特征是荧光标记免疫抗体由分别包装的抗A和抗B荧光标记抗体组成。
2、 根据权利要求1所述荧光标记免疫抗体测定法医物证血型试剂盒，其特 征为抗A荧光抗体由四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethyl rodamine isothiocyanate， TMRITC)进行标记，抗B荧光抗体用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)进行标记，两种荧光标记物可以互换，两种抗体均采用 单克隆抗体。
3、 权利要求1所述的荧光标记免疫抗体测定法医物证血型试剂盒，在测定 法医物证血型中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于测定法医物证血型的试剂盒，是由分离包装的抗A和抗B荧光标记抗体和0.01MPH7.2的PBS缓冲洗脱液组成，抗A和抗B抗体均采用单克隆抗体。本发明采用荧光标记抗体的方法，抗A荧光抗体由四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethyl rodamine isothiocyanate，TMRITC)进行标记，抗B荧光抗体用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)进行标记。荧光标记抗体和相应的抗原结合后，通过荧光显微镜，在特定激光的激发下，发出稳定的荧光。本发明可快速、准确获得法医物证的ABO血型，可用于法医物证检验。
文档编号G01N33/80GK101158692SQ20071011277
公开日2008年4月9日 申请日期2007年6月17日 优先权日2007年3月24日
发明者王瑞恒 申请人:辽宁师范大学