专利名称：一种液-质联用检测奶粉中双氰胺的方法及样品前处理方法
技术领域：
本发明属于食品检测领域，具体涉及一种快速检测奶粉中双氰胺的方法，以及液-质联用检测双氰胺的样品前处理方法。
背景技术：
双氰胺(D⑶)，又名二氰二胺、二聚氰胺，化学式为C2H4N4，是一种工业原料，常作为复合肥料的添加剂使用，以控制硝化菌的活动，调节氮肥在土壤中的转化速度，减少铵态氮的流失，达到提高肥料使用效率的目的。2013年I月，新西兰乳业巨头恒天然集团被爆出其生产的部分奶粉中含有双氰胺，其缘由是由于新西兰奶农使用了含有双氰胺的化肥，从而导致奶粉中产生了双氰胺残留。双氰胺是生产三聚氰胺的原料，同样属于非蛋白高氮物质，其安全性尚未得到评估，此外，双氰胺作为单氰胺的二聚体，其对小鼠毒害症状与单氰胺三聚体三聚氰胺类似，13000mg/kg剂量的双氰胺和三聚氰胺给药后的小鼠出现一致毒害症状，均出现不安，跳跃，呼吸急促，随后在几十分钟内便死亡。鉴于其可能会像三聚氰胺一样对婴幼儿产生危害，新西兰政府禁止销售含有双氰胺的奶制产品。我国是新西兰奶粉的主要进口国，目前市面上约40%的奶粉来自新西兰，此次事件再度引起了人们对奶粉安全的闻度关注和质疑。中国专利文献CN102419354A公开了一种液态奶中小分子有害物质的通用快速检测方法，并具体公开了采用超高效液相色谱与三重四级杆质谱联用测定其中的小分子有害物质的方法；所述方法适用于检测液态奶中三聚氰胺、双氰胺等小分子有害物质。中国专利CN102435699A公开了一种液相色谱串联质谱快速检测乳与乳制品中三聚氰胺的方法，并具体公开了在待测乳制品中加入内标，用乙腈提取三聚氰胺，以正相色谱柱串联质谱MRM定性、定量的分析、测量乳制品中三聚氰胺的步骤。可见，目前检测乳或奶制品中双氰胺或三聚氰胺等小分子有害物质时，液相-质谱连用的方式成为最快速准确的检测方式。但在实际研究中发现，上述以液相-质谱联用的方式进行检测奶粉中的双氰胺时发现，由于奶粉的性质不同于液态奶或是乳制品，使得采用上述方法进行奶粉中双氰胺检测时的检出效果并不理想，最主要的是上述两种方法中的样品的前处理方法并不适用于奶粉中双氰胺的检测，无论是中国专利CN102419354A提及的以保护剂和乙腈-乙醇混合液进行提纯处理的方式还是中国专利CN102435699A中提及的以乙腈提取三聚氰胺提纯的前处理方式，得到的上样液(即待测样品)，其中均不可避免的仍然存有大量蛋白质分子、脂肪分子以及一些与双氰胺分子量相近的干扰分子，从而即使采用具有干扰性小、检出限低、灵敏度高、重现性好等优势的超高效液相色谱与三重四级杆联用对上述待测液进行测定时，精确度仍然较差，这主要是由于奶粉在制备待测样品时，一般均是简单的以水溶解，导致很多蛋白质分子和脂肪分子无法因有效的溶解而利用乙腈提纯，也就直接影响了后续的检出灵敏性，因此， 亟需开发出一种新的适用于奶粉中双氰胺快速检测的样品前处理方法，尤其是适用于液-质联用检测的高效灵敏的样品前处理的方法。

发明内容
本发明所要解决的问题在于现有技术中对奶粉中双氰胺的检测由于样品前处理方式导致检测结果精度较差的问题，进而提供一种适用于快速检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，尤其是适用于液-质联用检测的样品前处理方法；本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种能够快速检测出奶粉中双氰胺的方法。为解决上述技术问题，本·发明提供的技术方案为:一种液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其包括下列步骤:(I)将奶粉样品溶解得水溶液，并加入有机提取液进行双氰胺的提取；(2)向提取后的混合液中加入MgSO4和NaCl使所述有机提取液与水相分层，离心
得第一上清液；(3)在所述第一上清液中加入吸附剂进行净化，离心得第二上清液；(4)将所述第二上清液经浓缩、复溶、过滤步骤，得到所需的待测样品。所述步骤(I)中，所述有机提取液提取双氰胺的步骤是在超声条件下进行的，并优选超声的频率为40kHz。所述步骤(I)中，所述有机提取液为乙腈、酸化乙腈、氨化乙腈、乙酸乙酯、甲醇或乙醇中的一种或几种的混合物。所述有机提取液可以根据样品水溶液的浓度高低或体积的变化一次或多次分批加入提取，达到提取双氰胺的目的即可，优选所述有机提取液的体积与所述样品水溶液的体积比为5:1。所述步骤(2)中，所述MgSO4的添加量与所述奶粉样品的质量为1:1-3:1,所述NaCl的添加量与所述奶粉样品的质量为0.5:1-1:1。所述步骤(3)中，所述吸附剂为粒径40-60μπι的C18吸附剂。所述吸附剂的添加量与所述奶粉样品的质量比为0.15:1-0.3:1。所述步骤(4)中，所述浓缩步骤采用以氮气吹干的方式进行。所述复溶步骤是采用乙腈和0.1%的甲酸水溶液的混合液进行的，所述乙腈与所述甲酸溶液的体积比为3:7。 所述过滤采用孔径为0.22 μ m滤膜。进一步地，本发明还提供一种液-质联用检测奶粉中双氰胺的方法，其包括如下步骤:(a)按照权利要求1-9任一所述的方法对所述奶粉进行前处理，得到所需的待测样品；(b)采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对奶粉中含有的双氰胺进行检测。所述步骤(b)中所述高效液相色谱的检测条件为:色谱柱:WatersACQUITY UPLC HSS T32.1 X 150mm, 1.8 μ m ;柱温:30°C;流动相A: IOmmoI/LNH4Ac水溶液,流动相B:乙腈；
流速:0.25mL/min ；进样量:IOyL;洗脱方式:梯度洗脱；所述三重四级杆质谱的检测条件为:质量分析器:三重四级杆；离子源:ESI+；毛细管电压:4kV;锥孔电压:25V ；离子源温度:150°C;脱溶剂温度:400°C ；中心气体流速:50L/Hr ；脱溶剂气体流速:800L/Hr ；碰撞气流速:0.15mL/min。所述高效液相色谱的梯度洗脱程序为:
权利要求
1.一种液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，包括下列步骤: (1)将奶粉样品溶解得水溶液，并加入有机提取液对双氰胺进行提取； (2)向提取后的混合液中加入MgSO4和NaCl使所述有机提取液与水相分层，离心得第一上清液； (3)在所述第一上清液中加入吸附剂进行净化，离心得第二上清液； (4)将所述第二上清液经浓缩、复溶、过滤步骤，得到所需的待测样品。
2.根据权利要求1所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述MgSO4的添加量与所述奶粉样品的质量比为1:1-3:1。
3.根据权利要求2所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述NaCl的添加量与所述奶粉样品的质量比为0.5:1-1:10
4.根据权利要求1-3任一所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述步骤(I)中，所述有机提取液提取双氰胺的步骤是在超声条件下进行的。
5.根据权利要求1-4任一所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述步骤(I)中，所述有机提取液为乙腈、酸化乙腈、氨化乙腈、乙酸乙酯、甲醇或乙醇中的一种或几种的混合物。
6.根据权利要求1-5任一所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述吸附剂为粒径40-60μπι的C18吸附剂。
7.根据权利要求6所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述吸附剂的添加量与所述奶粉样品的质量比为0.15:1-0.3:1。
8.根据权利要求1-7任一所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述步骤(4 )中，所述浓缩步骤采用以氮气吹干的方式进行。
9.根据权利要求8所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述复溶步骤是采用乙腈和0.1%的甲酸水溶液的混合液进行的，所述乙腈与所述甲酸溶液的体积比为3:7。
10.一种液-质联用检测奶粉中双氰胺的方法，其特征在于，包括如下步骤: Ca)按照权利要求1-9任一所述的方法对所述奶粉进行前处理，得到所需的待测样品； (b)采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对奶粉中含有的双氰胺进行检测。
11.根据权利要求10所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的方法，其特征在于，所述步骤(b)中所述高效液相色谱的检测条件为:色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T32.1 X 150mm，1.8 μ m ; 柱温:30°C ; 流动相A: IOmmoVLNH4Ac水溶液，流动相B:乙腈；流速:0.25mT,/mi η ； 进样量:10μ L ; 洗脱方式:梯度洗脱； 所述三重四级杆质谱的检测条件为: 质量分析器:三重四级杆； 尚子源:ESI ； 毛细管电压:4kV ；锥孔电压:25V ； 离子源温度:150°C ; 脱溶剂温度:400°C ； 中心气体流速:50L/Hr ； 脱溶剂气体流速:800L/Hr ； 碰撞气流速:0.15mL/min。
12.根据权利要求11所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的梯度洗脱程序为:
全文摘要
本发明提供一种液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，包括下列步骤样品前处理样品用水溶解，并加入有机提取液进行提取，随后加入MgSO4和NaCl使所述有机提取液与水相分层，离心得第一上清液，在所述第一上清液中加入吸附剂进行净化后，离心得第二上清液，取第二上清液经浓缩、复溶、过滤，制得待测样品；接着，采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对奶粉中含有的双氰胺进行检测。本发明所述适用于液-质联用检测的样品前处理方法通过提取、净化除去了干扰分子，使得样品检测具有较高的精确度。
文档编号G01N30/06GK103217498SQ20131014279
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月23日 优先权日2013年4月23日
发明者严华, 刘鑫, 张朝晖, 李建辉, 崔凤云, 云环, 杨金良 申请人:北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心