专利名称：使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的肝癌细胞的检测法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测受试者体内肝癌细胞的存在的体外免疫测定方法。
技术背景
由于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌中频繁地高度表达，所以认为肝癌中的磷脂 酰肌醇蛋白聚糖3的表达概况分析可能对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌中的功能鉴定、肝 癌的治疗或诊断及肝癌预后预测有用。通常进行蛋白质表达分析时，在病理诊断中广泛 采用免疫组织化学，特别是酶抗体法。免疫组织化学是使用抗体或酶等生物学试剂以高 灵敏度且特异性地检测生物体内物质(抗原)的存在和分布的方法。作为免疫组织化学 的特征，可以举出以下特征1、操作简便；2、可以广泛应用于将所得生物化学信息用 于形态学信息等；3、提供生物学和病理学方面的重要信息；4、需要注意因使用生物学 试剂所以与通常的方法不同。另外，免疫组织化学染色还具有下述优点，即，能够使用 新鲜冷冻切片、细胞学样本或固定组织的石蜡切片等广泛的样本，将其用于目标病理诊 断或形态学观察。
在免疫组织化学法中，由于基于酶抗体法的免疫染色可以采用通常病理诊断中 使用的福尔马林固定石蜡包埋组织，所以其应用范围非常广泛。但是，如果不充分注意 由于是福尔马林固定组织而引起的人为产物(Artifacts)等，那么不仅染色会失败，有时还 会引起因福尔马林固定及包埋导致的抗原变化、及抗体的渗透和反应性的变化，结果产 生假阳性或假阴性。上述假阳性或假阴性有时会导致对染色结果的曲解。
通常的组织学检索中使用的福尔马林固定对形态保持有用，但从保持与抗体的 结合性的观点考虑，福尔马林不是理想的固定液。因此，除福尔马林之外有时还使用乙 醇等作为固定液，但尚未确立形态保持优异、能够保存所有抗原与抗体的结合性的固定 法。因此，虽然福尔马林固定在保持与抗体的结合性方面存在问题，但仍然是广泛使用 的实际固定法。
因此，为了减弱福尔马林固定对保持与抗体的结合性的影响，已经公开了几种 方法。第一种方法是选择识别下述表位的抗体用于免疫染色，所述表位不受福尔马林固 定影响。在识别同一抗原的抗体中，通过将识别抗原中的不易受福尔马林固定影响的表 位的抗体用于免疫染色，可以减少假阴性。但是磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在细胞表面表达 后，经过蛋白酶等翻译后修饰，因此限定了能够与抗体结合的表位，从而不存在用于选 择合适的表位的表位多样性。
第二种方法是通过提高免疫染色的灵敏度检测出用通常的方法无法进行可视化 的抗原。最简便的方法是在显色时向通常免疫染色中使用的DAB(3，3’ -二氨基联苯 胺四盐酸盐)中加入铜等重金属，但不能期待灵敏度显著提高。还尝试了下述方法，即 ABC (抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合体(avidin-biotinylatedperoxidase complex)) 法及LSAB (标记链霉抗生物素蛋白生物素化抗体(labeled streptavidin biotinylated antibody))法等，所述方法通过使生物素化的二次抗体和ABC或酶标记的抗生物素蛋白与切片反复反应来提高灵敏度，但确认了存在随着反应次数增加背景的非特异性染色也 增强的倾向。进而，已经开始采用下述方法，即使用酶标记葡聚糖聚合物的EPOS (增强 聚合物一步染色(enhanced polymerone-step staining))法、及组合了生物素化Tyramide与 ABC法的CSA(催化信号扩增(catalyzed signal amplification))法，可以显著提高染色的灵敏度。但是，采用ABC法等现有方法检测福尔马林固定组织中的抗原时，将肿瘤组织判 断为阳性，并且将正常或非肿瘤组织判断为阴性，基于以上判断可以识别肿瘤组织和非 肿瘤组织，但由于使用高灵敏度方法时也会检测出非肿瘤组织内的微量抗原，所以有时 利用抗原也无法进行上述识别。另外，在使用高灵敏度方法的情况下，由于灵敏度高， 所以仍然存在背景染色增强的问题。
第三种方法是将因福尔马林固定导致与抗体的反应性减弱的抗原的反应性活化 的方法。在20世纪70年代引入的利用了蛋白酶的消化切片的方法(蛋白酶诱导表位活 化法(protease_:induced epitoperetrieval method)，以下称作 “PIER 法”或“蛋白酶抗原活 化法”)中，在免疫染色之前利用胰蛋白酶、胃蛋白酶等进行消化切片。该方法存在下 述问题因切片自身被消化导致的切片从玻璃上剥离、及染色结果不稳定等。
之后，在20世纪90年代开发了热诱导抗原活化法(heat-inducedepitope retrieval method,以下称作“HIER法”或“热诱导抗原活化法”)。已知利用微波、煮沸或高 压釜进行加热时，通过高温处理抗原会水解，结果表位能够与抗体结合。目前为止，磷 脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌中的表达也通过HIER法(非专利文献1 5及专利文献1)检 测。但是，由于抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体对血管及肝窦的上皮细胞显示出交叉反应 性，所以需要进行下述繁琐的处理预先进行与来自正常肝细胞的蛋白质溶胞产物的封 闭反应，排除上述交叉结合(非专利文献4)。因此，目前使用的HIER法无法以下述方 式准确地检测出肝癌组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的表达观察到在原有细胞膜中表达 的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3细胞质性地表达(非专利文献2)。要求开发出代替现有HIER 法的准确检测该表达的方法。
[非专利文献l]CapurroM，Wanless IR，Sherman Μ, Deboer G，Shi W, Miyoshi Ε, Filmus J.，(2003) Gastroenterology 125 (1), 89-97
[非专利文献 2]Yamauchi N，Watanabe A, Hishinuma Μ, Ohashi K, Midorikawa Y, Morishita Y, Niki Τ, Shibahara J, Mori Μ, Makuuchi Μ, Hippo Y, Kodama Τ, Iwanari H, Aburatani H, Fukayama Μ.，(2005) Mod Pathol 18 (12)，1591—8
[非专利文献3]LibbrechtL，Severi Τ, Cassiman D, Vander BorghtS，Pirenne J, Nevens F, Verslype C, van Pelt J, Roskams T.，(2006) Am J Surg Pathol 30 (11), 1405-11
[非专利文献4]Grozdanov PN, Yovchev MI, Dabeva MD.，(2006) Lab Invest 86(12)， 1272-84
[非专利文献5]Llovet，J.M., Chen, Y., Wurmbach, E.，Roayaie, S., Fiel, M.I., Schwartz, M., Thung, S.N.，Khitroy, G.，Zhang, W.，Villanueva, A., Battiston, C., Mazzaferro, V., Bruix, J.， Waxman, S., Friedman, S.L., (2006) Gastroenterology 131 (6)，1758-1767
[专利文献1]W02003100429
[专利文献2]W02006006693
[专利文献3]W02004022739 发明内容
本发明是鉴于上述情况完成的，其目的在于提供能够准确地检测出肝癌组织中 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达方式的方法。
本发明人等发现检测肝癌组织中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗原表达时，通过将 利用热诱导抗原活化法的抗原活化处理和利用蛋白酶抗原活化法的抗原活化处理组合， 能够采用免疫组织化学染色法检测出磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗原的表达量和表达方式的 差异，从而完成了本发明。由此，可以根据磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的表达量，对利用现 有HIER法确认到磷脂酰肌醇蛋白聚糖3高度表达的样本进行等级分类。
BP,本申请发明提供以下发明
[1] 一种用于检测受试者体内肝癌细胞的存在的体外免疫测定方法，包括下述步 骤
(a)提供来自同一受试者的至少两种能够视为相同的一组组织标本作为石蜡包埋 切片，所述组织标本在由上述受试者制备之后，被包埋在石蜡中并安装在透明性支持体 上；
(b)对上述一组组织标本进行除石蜡处理；
(c)对进行了上述(b)处理的能够视为相同的一组组织标本的一方，进行利用 热诱导抗原活化法的抗原活化处理，对另一方进行利用蛋白酶抗原活化法的抗原活化处 理；
(d)在适合于形成存在于经过上述(C)处理的组织标本中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的复合体的条件下，使抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体与 上述标本接触；
(e)检测复合体的存在，此处，存在复合体时判定受试者体内存在肝癌细胞。
[2]如[1]所述的方法，其中，上述热诱导抗原活化法利用微波加热。
[3]如[1]所述的方法，其中，上述热诱导抗原活化法利用高压釜加热。
[4]如[1]至[3]中任一项所述的方法，其中，上述蛋白酶抗原活化法中使用的蛋 白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K。
[5]如[1]至[4]中任一项所述的方法，其中，用于检测复合体的检测反应为酶反应。
[6]如[1]至[5]中任一项所述的方法，其中，上述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体 为与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的C末端多肽键合的抗体。
[7]如[6]所述的方法，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的C末端多肽为包含序列号 1表示的第359号氨基酸至第580号氨基酸的多肽，或者为包含第375号氨基酸至第580 号氨基酸的多肽。
[8]如[6]或[7]所述的方法，其中，上述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为GC33 抗体。
[9]如[1]至[5]中任一项所述的方法，其中，上述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体 为1G12抗体。
[10]如[1]至[9]中任一项所述的方法，其中，步骤(e)中，将复合体的存在经过 数值化并检测。
[11]如[10]所述的方法，其中，上述数值化按照下式算出
IRcp = PR+ (SI-Cp) +SP
式中，
IRcp为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达量的评分；
PR为对显微镜下检测出上述复合体的细胞比例进行评分得到的数值；
SI-Cp为对在显微镜下上述复合体在视野中细胞的细胞质中被检测出的染色强度 进行评分得到的数值；
SP为对在显微镜下的视野中细胞的细胞膜中显示出完全膜染色的细胞比例进行 评分得到的数值。
[12]如[10]所述的方法，其中，上述数值化按照下式算出
IRcm = PR+ (SI-Cm) +SP
式中，
IRcm为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的膜局部化的评分；
PR为对在显微镜下检测出上述复合体的细胞比例进行评分得到的数值；
SI-Cm为对在显微镜下检测出上述复合体在视野中细胞的细胞膜中的染色强度 进行评分得到的数值；
SP为对在显微镜下的视野中细胞的细胞膜中显示出完全膜染色的细胞比例进行 评分得到的数值。
[13] —种对肝癌细胞分类的方法，上述方法基于利用[11]及[12]所述的方法算出 的评分，对存在于受试者的肝癌细胞进行分类。
[14] 一种确定是否给与抗癌剂的方法，上述方法基于利用[11]及[12]所述的方法 算出的评分，确定是否给与受试者含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗癌剂。
[15]—种确定抗癌剂给与量的方法，上述方法基于利用[11]及[12]所述的方法算 出的评分，确定对受试者进行肝癌治疗中含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗癌剂的给与量。


[图1]为表示幻评分的各级的图。
[图2]为表示SP评分的各级的图。
[图3]为表示HuH-7及HepG2细胞移植模型标本的染色结果的图。
[图4]为表示由人肝癌的临床样本制备的标本的染色结果的图。
[图5A]为表示hGC33抗体在人肝癌移植小鼠模型中的抗肿瘤效果的图。
[图5B]为表示hGC33抗体在人肝癌移植小鼠模型中的抗肿瘤效果的图。
[图5C]为表示hGC33抗体在人肝癌移植小鼠模型中的抗肿瘤效果的图。
[图5D]为表示hGC33抗体在人肝癌移植小鼠模型中的抗肿瘤效果的图。
本说明书包含记载在作为本申请优先权基础的日本专利申请2008-068316号说 明书中的内容。
具体实施方式
组织标本
本说明书中使用的用语“组织标本”，是指由个体、体液(例如血液、血清、 血浆及脊髓液)、组织培养物或组织切片等得到的任意生物学标本。作为用作生物学标 本的例子，可以优选举出受试者标本。优选的受试者标本是由受试者得到的组织，更 优选受试者的肝组织。作为采集肝组织的方法，优选采用作为公知方法的活组织检查 (Biopsy)。肝活组织检查是指将细长的针直接从皮肤表面刺入肝脏采集肝脏组织的方 法。通常针穿刺的部位是右胸下部的肋间。手术之前，使用超声波检查装置确认穿刺部 位的安全性，并且对穿刺部位进行消毒。进而，以从皮肤至肝脏表面作为麻醉对象，将 穿刺部位的皮肤切开小口后，用穿刺针进行穿刺。
本发明中，由于组织标本是在显微镜下通过透射光进行观察，所以将组织标本 切成薄片，并且切至显微镜中使用的光线充分地透过的程度。作为切成薄片之前的步 骤，将组织标本固定。即，通过使组织 细胞的蛋白质脱水或变性使组织标本凝固，迅 速杀灭构成组织的细胞，使其结构稳定及不能溶解。首先，将作为固定对象的组织标本 用手术刀等刀具切成适于制作石蜡包埋切片的大小及形状的片断。接着，将该片断浸渍 在用于进行固定的试剂即固定液中。作为固定液，优选使用福尔马林，更优选中性缓冲 福尔马林。可以根据组织标本的特性或物性适当选择中性缓冲福尔马林的浓度。浓度可 以在1 50%、优选5 25%、更优选10 15%之间适当改变后进行使用。对浸渍了 组织标本的固定液使用真空泵适当脱气。固定如下进行在常压及室温条件下将组织标 本放置在固定液中数小时。固定所需要的时间可以在1小时 7日、优选2小时 3日、 更优选3小时 M小时、进一步更优选4小时 16小时的范围内适当选择。固定之后 再将其适当浸渍在磷酸缓冲液等中数小时(时间可以在2小时 48小时、优选3小时 24小时、更优选4小时 16小时的范围内适当选择)。
接着，可以由适于固定的组织标本利用冷冻切片法或石蜡切片法较好地制作切 片。作为冷冻切片法的优选例，可以举出下述方法向O.C.T.compound(Miles.Inc.)中加 入组织并冷冻，将所得产物使用恒冷切片机(冷冻切片制作装置)切成薄片。在石蜡切 片法中，通过将被固定的组织标本浸渍在包埋剂中并凝固，赋予该切片均与且适度的硬 度。作为包埋剂，可以优选使用石蜡。使用乙醇对被固定的组织标本进行脱水。具体 而言，通过将组织标本依次浸渍在70%乙醇、80%乙醇及100%乙醇中，对该组织标本 进行脱水。浸渍所需要的时间及次数可以在1小时至数日及1次至3次的范围内适当选 择。另外，也可以在室温或4°C下进行浸渍。在4°C下进行浸渍时，浸渍时间优选彻夜 等其时间较长的情况。然后，将其液相置换为二甲苯后，将组织标本用石蜡包埋。将其 液相置换为二甲苯所需要的时间可以在1小时 数小时的范围内适当选择。此时，可以 在室温下进行置换，也可以在4°C下进行置换，但在4°C下进行置换时，置换时间优选彻 夜等其时间较长的情况。石蜡包埋所需要的时间及次数可以在1小时至数小时及1次至 4次的范围内适当选择。此时，可以在室温下进行包埋，也可以在4°C下进行包埋。在 4°C下进行包埋时，包埋时间优选彻夜等其时间较长的情况。另外，石蜡包埋反应可以通 过使用经自动化处理的石蜡包埋装置(EG1160，Leica等)较好地对组织标本进行包埋。
如上所述，通过将被石蜡包埋的组织标本与支架Scaffold)连接来制作“组织 块”(block)，使用切片机将该组织块切成从Iym至20μιη厚度中选择的所期望厚度的薄 片。通过将切成薄片的组织切片静置在作为透明性支持体的玻璃载片上对其进行固定。 在上述情况下，为了防止组织切片的剥离，还可以优选使用在玻璃载片上涂布0.01% 聚-L-赖氨酸(Sigma)并干燥的玻璃载片。被固定的组织切片可以在从数分钟至1小时 之间选择的适当时间内风干。
本发明中，准备一组如上所述地制备的、安装于透明性支持体上的两种组织标 本。该组织标本优选组织学上能够视为相同的两种组织标本。所谓“能够视为相同”， 是指相比较的两种组织标本由提供该组织标本的受试者标本中基本相同的细胞或组织构 成。例如，作为相邻切片制备的两种组织标本是能够视为相同的两种组织标本。本发明 中，只要没有特别说明，“能够视为相同的两种组织标本”，是指作为相邻的切片制备 的两种组织标本，除此之外，即使不是作为相邻切片制备的组织标本，只要构成两种组 织标本的细胞或组织的构成在该两种组织标本之间能够视为相同，则也属于“能够视为 相同的两种组织标本”。作为细胞或组织的构成在该两种组织标本之间能够视为相同的 情况，例如可以优选举出下述情况(1)在位于组织切片中的平面坐标上同一位置处存 在来自同一细胞的细胞切片；(2)位于该平面坐标上的同一位置处该细胞切片存在的比 例至少为50%以上，优选为60%以上，更优选为70%以上，更进一步优选为80%以上， 较优选为90%以上，特别优选为95%以上。
抗原活化
本发明的方法中，对因福尔马林固定而减弱了与抗体的反应性的抗原反应性进 行活化。本发明中，对两种组织标本中的一种标本使用蛋白酶诱导抗原活化法(PIER 法)，对另一种标本使用热诱导抗原活化法(HIER法)，将与抗体反应时的两者间的染色 程度的差异进行数值化。
热诱导抗原活化法适当采用利用微波的加热法、利用高压釜的加热法，或利用 煮沸处理的加热法等。使液体温度保持为约98°C、在780W的输出功率下进行煮沸处 理时，处理等活化所需要的时间从5分钟-60分钟之间适当选择，例如为10分钟。抗 原活化处理可以在除IOmM柠檬酸钠缓冲液之外的市售靶向活化溶液(TargetRetrieval Solution) (DakoCytomation)等中进行。在下述实施例中，使用靶向活化溶液。作为活化 处理的结果，只要可以获得抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体识别的抗原中的表位与抗体的 结合性，检测出下述抗原与抗体的复合体即可，可以使用任一种缓冲液、水溶液。
对蛋白酶诱导抗原活化法中使用的蛋白酶的种类及来源没有特别限定，可以适 当选择使用通常能够购买到的蛋白酶。作为使用的蛋白酶的例子，可以优选举出0.01N盐 酸中浓度为0.05%的胃蛋白酶；进一步在pH 7.6的Tris缓冲液中含有浓度为0.1%的CaCl2 的浓度为0.1 %胰蛋白酶；含有IOmM EDTA及0.5% SDS的pH 7.8的IOmM Tris-HCl缓 冲液中浓度为1 50 μ g/ml的蛋白酶K。进而，使用蛋白酶K时，该反应液的pH在6.5 至9.5之间适当选择，还可以适当使用SH试剂、胰蛋白酶抑制剂或糜蛋白酶抑制剂。本 说明书实施例中记载的Histofine Her2 kit (MONO) (Nichirei Bioscience)附带的蛋白酶也可 以作为上述优选的蛋白酶的具体例。蛋白酶诱导抗原活化通常在37°C下进行，但反应温 度可以在25°C至50°C的范围内适当改变。蛋白酶诱导抗原活化在37°C下进行时，反应时9间例如在1分钟至5小时之间适当选择，例如为15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2 小时、3小时或4小时等。活化处理结束后，将进行了该处理的组织标本用清洗用缓冲液 清洗。清洗用缓冲液优选使用PBS (phosphate-buffered saKne)，除此之外，还可以优选使 用Tris盐酸缓冲液。作为清洗条件，通常采用在室温下清洗5分钟且重复3次的方法， 但可以适当改变清洗时间及温度。
抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体
本发明中使用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体只要具有与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 结合的活性即可，也可以优选使用任一种抗体。抗体的特别优选例包括下述实施例中公 开的GC33抗体(专利文献2)及1G12抗体(专利文献1)。另外，除上述公知的抗体之 外，也可以通过使用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作为免疫抗原对非人的动物进行免疫，由此 获得本发明中优选使用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。专利文献1、专利文献2记载了 上述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的制作方法，对本领域技术人员来说基于该方法可以 适当获得所期望的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的结合可以优选采用本领 域技术人员公知的方法检测。例如可以采用ELISA(酶联免疫吸附测定方法)、EIA(酶 免疫测定方法)、RIA(放射免疫测定方法)或荧光免疫测定方法等。一般的教科书如"Antibody A Laboratory Manual.Ed Harlow, David Lane, Cold SpringHarbor Laboratory,1988”中记载了上述方法。
作为测定抗体对表达抗原的细胞的结合活性的方法，例如可以举出Antibody A Laboratory Manual. (Ed Harlow, David Lane, ColdSpring Harbor Laboratory, 1988 中 的359-420页中记载的方法。即，结合活性可以优选根据以细胞作为抗原的ELISA或 FACS (荧光激活细胞分选术(fluorescence activated cell sorting))的原理进行评价。在 ELISA format中，通过比较由酶反应产生的信号水平，定量评价抗体对细胞的结合活 性。即，将受试抗体加到固定有强制表达了抗原的细胞的ELISA板上，利用识别受试抗 体的酶标记抗体，检测与细胞结合的抗体。或者在FACS中，制备受试抗体的稀释系列， 确定对强制表达抗原的细胞的抗体集合效价(titer)，由此可以比较其对细胞的结合活性。
可以通过FACS format测定在细胞表面上表达的抗原与对应于该抗原的抗体之 间的结合，所述细胞不与ELISA板等载体结合并悬浮于缓冲液等中。作为用于上述测 定的流式细胞仪，例如可以举出FACSCantoTMII、FACSAria 、FACSArray > FACS Vantage SE、FACSCalibur (以上 BD Biosciences)禾Π EPICS AL TRA HyPerSort、 Cytomics FC 500、EPICS XL-MCL ADC、EPICS XL ADC、Cell LabQuanta/Cell Lab Quanta SC (以上 Beckman Coulter)等。
作为测定抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体对抗原的结合活性的优选方法之一例， 可以举出使用二次抗体的方法，所述二次抗体识别与表达抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体 的细胞反应的受试抗体。使表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞与受试抗体反应，用经 FITC标记的二次抗体对细胞进行染色后，采用FACSCalibur(BD)进行测定，利用CELL QUEST软件(BD)解析其荧光强度。根据本方法，采用FACSCalibur进行测定时，利用 CELL QUEST软件解析其荧光强度，将根据上述方法得到的几何平均值(受试Ge0-Mean 值)与利用对照抗体作为一次抗体时的对照Ge0-Mean值进行比较，由此可以判断抗体对抗原的结合活性。求出Ge0-Mean(几何平均值)的计算式记载在CELL QUEST软件用 户指南(BD biosciences公司)中。
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对于经过利用热诱导抗原活化法的抗原活化处理的组织标本及经过利用蛋白酶 诱导抗原活化法的抗原活化处理的组织标本，以抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为一次 抗体进行反应。在下述条件下进行该反应，所述条件适合于抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗 体识别抗原中的表位，并形成抗原抗体复合体。通常该反应在4°C下进行一夜，或者在 37°C下进行1小时，但反应条件可以在适合抗体识别抗原中的表位并形成抗原抗体复合 体的范围内改变。例如，反应温度可以在4°C至50°C的范围内改变，反应时间可以在1 分钟至7日之间改变。在低温下进行反应时，优选反应较长时间。一次抗体反应结束 后，将组织标本用清洗用缓冲液清洗。清洗用缓冲液优选使用PBS(phosphate-buffered saline),除此之外，还可以优选使用Tris盐酸缓冲液。通常作为清洗条件，可以采用在 室温下清洗5分钟并重复3次的方法，但可以适当改变清洗时间及温度。
接着，使经过一次抗体反应的组织标本与识别一次抗体的二次抗体反应。通 常使用预先利用用于将二次抗体可见化的标记物质标记的二次抗体。作为标记物质， 优选举出 FITC (异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate))、Cy2 (Amersham)及 Akxa488(MolecularProbes)等荧光色素，过氧化物酶及碱性磷酸酶等酶，或胶体金等。
在下述条件下进行与二次抗体的反应，所述条件适合于使抗磷脂酰肌醇蛋白聚 糖3抗体与识别该抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的二次抗体形成抗原抗体复合体。通常 该反应在室温或37°C下进行30分钟至1小时，但可以在适合于使抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3抗体与二次抗体形成抗原抗体复合体的范围内进行改变。例如，反应温度可以在4°C至 50°C的范围内进行改变，反应时间可以在1分钟至7日的范围内进行改变。在低温下进行 反应时，优选反应较长时间。二次抗体反应结束后，将组织标本用清洗用缓冲液清洗。 清洗用缓冲液优选使用PBS (phosphate-buffered saline)，除此之外，还可以优选使用Tris 盐酸缓冲液。通常作为清洗条件，采用在室温下清洗5分钟且重复3次的方法，但可以 适当改变清洗时间及温度。
然后，使经过二次抗体反应的组织标本与将标记物质可见化的物质反应。使 用过氧化物酶作为二次抗体的标记物质时，用反应液培养组织标本，所述反应液如下得 到在即将培养前将0.02%过氧化氢水与用pH 7.2的0.1M Tris盐酸缓冲液调节至浓度为 0.1 %的DAB ( 二氨基联苯胺(diaminobenzidine))溶液等量混合。除DAB之外，还可以 适当选择DAB-Ni及AEC+(以上DAKO)等显色基质。在培养过程中，在时间间隔显微 镜下观察显色程度，在确认到适当显色的阶段，通过将组织标本浸渍在PBS中来终止可 见化反应。
使用碱性磷酸酶作为二次抗体的标记物质时，用BCIP (5-溴-4-氯_3_吲哚基磷 酸酯)/NBT (氮兰四唑(nitro bluetetrazolium)) (Zymed)基质溶液(在含有浓度为IOmM的 MgC12及浓度为^mM的NaCl的pH 9.8的50mM碳酸钠缓冲液中，溶解有浓度为0.4mM 的NBT及浓度为0.38mM下的BCIP)对组织标本进行培养。另外，除BCIP及NBT之 夕卜，还可以适当使用PermanentRed，Rist Red、或Richsin+(以上DAKO)等。在培养之 前，组织标本也可以用0.1M Tris盐酸缓冲液(pH 9.5)在室温下培养1分钟至数小时，所述Tris盐酸缓冲液含有浓度为ImM的鳌合碱性磷酸酶抑制剂即盐酸左旋咪唑(Nacalai)、 0.1M氯化钠及50mM氯化镁。在培养过程中，在时间间隔显微镜下观察，在观察到作为 反应最终产物的紫色的甲暨沉淀的阶段，将组织标本用水洗或用含有2%聚乙烯醇的TBS 终止反应后，用TBST (含有0.1% Tween 20的TBS)清洗。使用胶体金作为二次抗体的 标记时，通过利用银增感(silverenhancement)在金粒上附着金属银，由此使胶体金可见 化。银增感的方法是本领域公知的。
使用FITC (异硫氰酸荧光素)、Cy2 (Amersham)及 Alexa488 (Molecular Probes)等荧光色素作为二次抗体的标记物质时，无需可见化物质的反应步骤，照射该荧光物质 的激发波长的光，放出的光可以通过使用荧光显微镜适当检测。
肝癌组织的分类和治疗效果的预测
已知磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌组织中经过消化其N末端部分在血清中游离 (专利文献幻。因此，本发明的方法中，使用与上述经过消化在血清中游离的磷脂酰肌 醇蛋白聚糖3的N末端的部分肽进行键合的抗体时，经过消化后，该抗体无法与仍锚定 在细胞表面上的C末端部分的多肽进行键合。另一方面，本发明的方法中，使用与C末 端部分的肽进行键合的抗体时，经过消化后，该抗体可以与仍锚定在细胞表面上的C末 端部分的多肽进行键合。即，根据目的适当选择本发明中使用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3抗体，由此无论消化与否都可以检测出锚定在细胞表面上的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的部 分多肽，还可以检测出直至消化锚定在细胞表面上的经过消化后血清中游离的磷脂酰肌 醇蛋白聚糖3的部分多肽。
已经发现抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体对肝癌的治疗及预防有用(专利文献3)。 上述治疗用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体所发挥的杀灭细胞的活性主要通过抗体依赖性 细胞毒活性(ADCC活性)或补体依赖性细胞毒活性(CDC活性)发挥，所述细胞毒活性 通过效应细胞或补体与Fc部分结合而开始，所述Fc部分是与在锚定在细胞表面上的C末 端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的部分。因此，从抗磷脂酰肌醇蛋白 聚糖3抗体结合的表位是否存在于肝癌组织中的观点考虑，预测利用治疗用抗磷脂酰肌 醇蛋白聚糖3抗体的肝癌的治疗效果时，在本发明的方法中，可以优选使用与C末端的部 分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。
有文献暗示磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌组织中经过消化的部位为序列号1表示 的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的第358号和第359号氨基酸、或第374号和第375号氨基酸的 多肽键(专利文献3)。因此，作为本发明中优选使用的与C末端的部分多肽键合的抗磷 脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，可以举出与下述多肽键合的抗体，所述多肽为包含序列号1表 示的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的第359号至第580号氨基酸的多肽，或者为包含第375 号至第580号氨基酸的多肽。
另一方面，从磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子成熟的观点考虑，预测利用治疗用抗 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的治疗效果时，本发明的方法中能够使用与N末端的部分多 肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。上述情况下，将被与N末端的部分多肽键合的 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体识别的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子作为没有更成熟的治疗 靶分子，将表达上述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的肝癌细胞作为没有更成熟的治疗靶细 胞，可以分别对其赋予性格。与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多肽键合的12抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体无论是否成熟，检测出磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子。另一 方面，与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3抗体检测出成熟之前的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子，但没有检测出成熟之后的磷脂酰肌 醇蛋白聚糖3分子。S卩，通过使用与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多肽键 合的抗体、和与N末端的部分多肽键合的抗体这2种抗体，可以通过成熟的程度对利用本 发明的方法检测出的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子及表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的肝癌 细胞进行分类。
以下具体说明上述分类方法。作为一次抗体，准备2种抗体与磷脂酰肌醇蛋 白聚糖3分子的C末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，和与磷脂酰肌醇 蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。由同一受试 者制备2种组织标本，使其中的1种组织标本与作为一次抗体的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 抗体反应，所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体键合于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的N末端 的部分多肽；使另一种组织标本与作为一次抗体的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体反应， 所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体键合于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多 肽。使用与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚 糖3抗体检测的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子，从其成熟程度的观点考虑，可以评价为没有 更成熟的分子，表达上述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的肝癌细胞可以评价为没有更成熟 的细胞。另外，使用与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽键合的抗磷脂酰 肌醇蛋白聚糖3抗体没有检测出、但是使用与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分 多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体检测出的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子，从其成熟 程度的观点考虑，可以评价为更成熟的分子，表达上述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的肝 癌细胞，可以评价为更成熟的细胞。
与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3抗体和与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3抗体属于互不相同的抗体亚型时，或者是在不同种类的动物中产生时，可以使用1种组 织标本进行测定。在上述情况下，通过将二次抗体用不同种类的酶或荧光标记，可以在 1种组织标本上使用2种抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体进行检测，所述二次抗体为识别与 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的二 次抗体、和识别与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多肽键合的抗磷脂酰肌醇蛋 白聚糖3抗体的二次抗体。
ij抗磷H旨酉y几醇3抗体的反应+牛的数倌化
本发明基于抗原活化反应(即，热诱导抗原活化法及蛋白酶诱导抗原活化法)的 差异，提供下述方法将在显微镜下检测出的由磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和抗磷脂酰肌醇 蛋白聚糖3抗体形成的抗原抗体复合体的程度及形态的差异进行数值化。
在方案之一中，数值化如下进行
式(1)
IRcp = PR+ (SI-Cp) +SP
[式中，
IRcp为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达量的评分；
PR为对显微镜下的检测出上述复合体的细胞比例进行评分得到的数值；
SI-Cp为对在显微镜下上述复合体在视野中细胞的细胞质中被检测出的染色强度 进行评分得到的数值；
SP为对在显微镜下视野中的细胞的细胞膜中显示出完全膜染色的细胞比例进行 评分得到的数值]。
PR评分如下算出
(a)在使用4倍或10倍物镜的显微镜下的视野中的细胞中，
⑴将检测出上述复合体的细胞比例为0的样本的评分作为0分，
( )将该比例小于20%的样本的评价作为1分，
(iii)将该比例为20%以上且小于50%的样本的评分作为2分，
(iv)将该比例为50%以上的样本的评分作为3分；
SI-Cp评分如下算出
(b)在显微镜下视野中细胞的细胞质中，
⑴上述显微镜使用4倍或10倍的物镜时，将检测出上述复合体的细胞比例为0 的样本的评分作为0分，
(ii)上述显微镜使用10倍的物镜时，将虽然模糊但观察到轻微的阳性反应的样 本的评分作为1分，
(iii)将用4倍物镜观察到轻微的阳性反应的样本的评分作为2分，
(iv)将即使用4倍物镜也可以确认到能够充分地识别的阳性反应的样本的评分作 为3分，
(ν)将用4倍物镜可以清楚地识别、确认到强阳性反应的样本的评分作为4分；
SP评分如下算出
(c)在显微镜下视野中细胞的细胞膜中的上述复合体的检测中，
(i)将未确认到细胞膜中的阳性反应的样本的评分作为0分，
( )将确认有阳性反应的细胞中少于20%的细胞显示出完全膜染色的样本的评 分作为1分，
(iii)将确认有阳性反应的细胞中的20%以上且少于50%的细胞显示出完全膜染 色的样本的评分作为2分，
(iv)将确认有阳性反应的细胞中的50%以上的细胞显示出完全膜染色的样本的 评分作为3分。
另一个方案中，数值化根据下式( 进行，
式(2)
IRcm = PR+ (SI-Cm) +SP
[式中，
IRcm为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的膜局部化的评分；
PR为对显微镜下检测出上述复合体的细胞比例进行评分得到的数值；
SI-Cm为对在显微镜下检测出上述复合体在视野中细胞的细胞膜中的染色强度 进行评分得到的数值；
SP为在显微镜下视野中的细胞的细胞膜中显示出完全膜染色的细胞比例进行评分得到的数值]。
PR评分如下算出
(a)在使用4倍或10倍物镜的显微镜下的视野中的细胞中，
⑴将检测出上述复合体的细胞比例为0的样本的评分作为0分，
( )将该比例小于20%的样本的评价作为1分，
(iii)将该比例为20%以上且小于50%的样本的评分作为2分，
(iv)将该比例为50%以上的样本的评分作为3分；
SI-Cm评分如下算出
(b)在显微镜下视野中细胞的细胞膜中，
⑴上述显微镜使用4倍或10倍的物镜时，将检测出上述复合体的细胞比例为0 的样本的评分作为0分，
( )上述显微镜使用10倍的物镜时，将虽然模糊但观察到轻微的阳性反应的样 本的评分作为1分，
(iii)将用4倍物镜时虽然模糊但用10倍物镜时确认到可以充分识别的阳性反应 的样本的评分作为2分，
(iv)将即使用4倍物镜也可以确认到能够充分地识别的阳性反应的样本的评分作 为3分，
(ν)将用4倍物镜可以清楚地识别、确认到强阳性反应的样本的评分作为4分；
SP评分如下进行
(c)在显微镜下视野中细胞的细胞膜中的上述复合体的检测中，
(i)将未确认到细胞膜中的阳性反应的样本的评分作为0分，
( )将确认到阳性反应的细胞中少于20%的细胞显示出完全膜染色的样本的评 分作为1分，
(iii)将确认到阳性反应的细胞中的20%以上且少于50%的细胞显示出完全膜染 色的样本的评分作为2分，
(iv)将确认到阳性反应的细胞中的50%以上的细胞显示出完全膜染色的样本的 评分作为3分。
在上述情况下，针对经过热诱导抗原活化法的组织标本和经过蛋白酶抗原活化 法的组织标本，分别确定基于上述式(1)及( 算出的评分。基于式(1)算出的评分是 反映磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达量的评分，基于式( 算出的评分是反映磷脂酰肌醇蛋白 聚糖3在细胞膜中的表达局部化的评分。可以基于本发明的数值化方法，根据磷脂酰肌 醇蛋白聚糖3的表达量及表达方式，对存在于受试者的肝癌细胞进行分类。如下述实施 例所示，确认到使用从实际肝癌患者中采集的组织标本，可以有效地对其进行分类。进 而，确认到即使在移植了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达量被确定的肝癌细胞株即HuH-7或 HepG2的肝癌动物模型中，也可以有效地进行该分类。
本发明中，对肝癌动物模型给与治疗用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，结果证 实了根据本发明的方法通过数值化进行分类的肝癌中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的表达量及 表达方式的差异，与利用治疗用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体治疗肝癌的治疗效果的差 异相关。即，表明基于根据本发明进行数值化得到的评分的差异，可以判断治疗用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的治疗效果的差异。基于根据本发明的数值化的方法，可以预 测使用含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为有效成分的肝癌治疗剂的肝癌治疗效果。 另外，基于根据本发明的数值化的方法，能够确定为了在使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 抗体的肝癌治疗中获得所期望的效果所需的治疗用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的必需给药量。
实施例
以下，根据实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
(实施例1)
侧__嶋驢朋厕械-3 _鹿_，耐__膽汰_旨 酰肌醇蛋白聚糖3的人肝癌细胞株移棺到小鼠腹部皮下
(1)细胞株
作为肝癌细胞株，使用HuH-7 细胞(Health Science ResearchResources Bank)、 HepG2 细胞(ATCC)。HuH_7 在含有 10% FBS (BIONET)的 Dulbecco，s Modified Eagle' s 培养基6IGMA)中维持并传代培养，HepG2在含有10% FBS> lmmol/L MEM丙酮酸 钠(Invitrogen)、lmmol/L MEM 非必需氨基酸(Invitrogen)的 Minimum Essential Medium Eagle培养基6IGMA)中维持并传代培养。
(2)GPC3表达量的测定
(2-1)测定方法
HuH-7细胞及HepG2细胞中GPC3的表达量使用小鼠抗人GPC3单克隆抗体(克 隆名GC33，记载在 W02006/006693 中)，利用 QIFI-Kit(DakoCytomation)进行测定。测定方法根据附带的说明书所述的方法进行。
将使用的GC33抗体在室温下溶解后，用PBS调节至lmg/ml。作为阴性对照， 使用将冻干状态的mIgG&(l安瓿份)溶解在500 μ 1 “日本药典注射用水大塚蒸馏水” 中得到的抗体。将5Χ IO5的各细胞悬浮在添加有98 μ 1 0.5w/v% BSA(Sigma-Aldrich)的 CellWASH细胞清洗溶液(Becton · Dickinson)中(以下称作FACS-PBS)中。将分别添 加有2ylGC33及SylmIgGh的该各悬浮液在4°C下静置30分钟。之后，在4°C下将添 加有Iml FACS-PBS的该各悬浮液在以5000rpm进行离心分离操作1分钟，由此对细胞进 行分馏。将该细胞再次悬浮在98 μ 1的FACS-PBS中。
另外，也可以与上述操作平行地进行以下操作。在IOOylQIFIKIT附带的标准 颗粒(calibration beads)及测试颗粒(setup beads)中添加 Iml 的 FACS-PBS，在 4°C下以 5000rpm进行离心分离操作1分钟由此进行清洗。将该颗粒悬浮在98 μ 1的FACS-PBS 中。向上述细胞及颗粒中分别添加QIFIKIT附带的FITC标记山羊抗小鼠抗体各2ul， 使该细胞及颗粒在4°C下反应45分钟。接着，在4°C下，将添加有Iml的FACS-PBS的 上述反应液以5000rpm进行离心分离操作1分钟。将沉淀的细胞及颗粒悬浮在Iml的 FACS-PBS中。使用全自动细胞分析装置EPICS-XL (Beckman Coulter)，调节输出功率， 使通过测定经标记的测试颗粒而产生的2个峰进入测定画面内。使用全自动细胞分析 装置EPICS-XL，测定用于GC33抗体反应的细胞样本、用于mlgGh反应的细胞样本、 及标准颗粒发出的各种荧光的平均荧光强度(Mean fluorescence Intensity) (MFI)值。基 于标准颗粒的5个MFI值和抗体结合能力(Antibody-bindingcapacity) (ABC)值，利用Microsoft Office Excel 2003 SP2 (MicrosoftCorporation)绘制最佳直线。将各细胞的 MFI 值代入该直线的标准曲线求出ABC值。从用于GC33抗体反应的样本的ABC值中扣除用 于mlgGh反应的样本的ABC值，将所得的值作为抗体结合部位的数量。
结果，HuH-7中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的表达量为每个细胞1.25X IO5个分子。 HepG2中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的表达量为每个细胞9.67X IO5个分子。
(3) 月干翩胞廉_至帽腳打隨雜赚
使用含有等量(1)所述的其维持传代培养用培养基和MATRIGEL Matrix(BD Biosciences)的溶液分别制备HuH_7及HepG2细胞，使每Iml溶液中有5 X IO7个细胞。在将各细胞移植到小鼠的前一天，预先对雄性、5周龄的SCID小鼠(日本CLEA)腹腔内 给与100 μ 1抗脱唾液酸GMl抗体(和光纯药；将1安瓿的内容物溶解在Iml蒸馏水中， 再用4ml生理盐水稀释)。该抗脱唾液酸GMl抗体(和光纯药)如下制备将1安瓿的 内容物溶解在Iml蒸馏水中，再用4ml生理盐水稀释。次日，向该小鼠的腹部皮下移植 100 μ 1该各细胞悬浮液(即，每一只小鼠为5X IO6个细胞)。
(4)肿瘤组织切片的制作方法的研究
使用手术刀将从⑶中制作的HepG2移植模型中采集的均勻的移植组织片四等 分。将其中一个断片在10%中性缓冲福尔马林中固定M小时。然后，使用自动包埋装 置ETP-150C (Sakura FinetekJapan)，对被固定的组织片进行石蜡包埋，在4°C下保存(A法)。
接着，使用含有4%低聚甲醛的PLP固定液(浓度为IOmM的NaI04、浓度为 75mM的赖氨酸、浓度为37.5mM的磷酸缓冲液、浓度为2%的低聚甲醛)，在4°C下将另 一个断片固定6小时，之后，于4°C用PBS (磷酸缓冲生理盐水，10mM、pH 7.4)清洗。 然后，在4°C下将该断片用丙酮脱水一夜，及在室温下用丙酮脱水2小时。进而，将该断 片用苯甲酸甲酯清洗1小时及用二甲苯清洗1小时，与上述同样地对其进行包埋，在4°C 下保存(B法)。
在即将用于免疫组织染色之前，将A法及B法中制作的石蜡包埋标本在恒冷切 片机上切成薄片，风干后进行除石蜡处理，并进行染色。
接着，使用PLP固定液，在4°C下将另一个断片浸渍6至8小时后，在4°C下依次 浸润在具有梯度蔗糖浓度的PBS中(时间为在砂糖浓度为10%的PBS中4小时，在砂 糖浓度为15%的PBS中4小时，在20%砂糖中一夜)。然后，将该断片包埋在Tissue-Tek OCTcompound (Sakura Finetechnical)中，在干冰/丙酮浴中冷冻。将冷冻后的组织块在 恒冷切片机上切成薄片，风干后将薄切片在-80°C下保存(C法)。
于4°C，将另一个断片包埋在Tissue-Tek OCT compound中，在干冰/丙酮浴中 冷冻。将冷冻后的组织块在恒冷切片机上切成多个薄片后，将该切片风干，用下述不同 的方法将其固定。在4°C下，将其中一个切片在4%低聚甲醛中固定30分钟(D法)。 在4°C下，将另一个切片在丙酮中固定10分钟(E法)。进而，在室温下，将另一个切片 在10%中性缓冲福尔马林中固定30分钟(F法)。用Tris缓冲生理盐水(TBS，50mM、 pH 7.4),将利用D法、E法及F法固定的切片清洗5分钟共3次后，风干，在_80°C下保 存。
将如上所述制备的组织切片用于以下所示的免疫组织化学染色。作为一次抗体，GC33 抗体(IgG2a)及 1G12 抗体(BioMosaic，IgGl)分别以浓度为 2.5 μ g/ml 及 1.0 μ g/ml进行使用。染色时，染色所需的试剂使用LSAB_2kit(Dako Cytomation)中附带的试剂。染色方法按照试剂盒附带的说明书所述的方法进行。由于固定时间短，所以 不进行抗原活化。上述免疫组织化学染色过程中形成的抗原抗体复合体可以通过过氧化 物酶-二氨基联苯胺(DAB)反应进行可见化。作为对照染色，使用苏木精。需要说明 的是，作为一次抗体的对照抗体，在GC33的情况下使用小鼠IgG2，在1G12的情况下使 用[gGl。对每种方法用3个例子进行评价，结果示于表1。
[表1]
权利要求
1.一种用于检测受试者体内肝癌细胞的存在的体外免疫测定方法，包括下述步骤(a)提供来自同一受试者的至少两种能够视为相同的一组组织标本作为石蜡包埋切 片，所述组织标本由所述受试者制备之后，被包埋在石蜡中并安装在透明性支持体上；(b)对所述一组组织标本进行除石蜡处理；(c)对进行了所述(b)处理的能够视为相同的一组组织标本中的一方，进行利用热诱 导抗原活化法的抗原活化处理，对另一方进行利用蛋白酶抗原活化法的抗原活化处理；(d)在适合于形成存在于经过所述(c)处理的组织标本中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的复合体的条件下，使抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体与所述 标本接触；(e)检测复合体的存在，其中，当存在复合体时判定受试者体内存在肝癌细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述热诱导抗原活化法利用微波加热。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述热诱导抗原活化法利用高压釜加热。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述蛋白酶抗原活化法中使用的蛋 白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，用于检测复合体的检测反应为酶反应。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体 为与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的C末端多肽键合的抗体。
7.如权利要求6所述的方法，其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的C末端多肽为包含序 列号1表示的第359号氨基酸至第580号氨基酸的多肽，或者为包含第375号氨基酸至第 580号氨基酸的多肽。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中，所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为GC33 抗体。
9.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体 为1G12抗体。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，步骤(e)中，将复合体的存在进 行数值化并检测。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述数值化按照下式算出IRcp = PR+ (SI-Cp) +SP式中，IRcp为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达量的评分；PR为对显微镜下检测出所述复合体的细胞比例进行评分得到的数值；SI-Cp为对在显微镜下所述复合体在视野中细胞的细胞质中被检测出的染色强度进行 评分得到的数值；SP为对在显微镜下的视野中细胞的细胞膜中显示出完全膜染色的细胞比例进行评分 得到的数值。
12.如权利要求10所述的方法，其中，所述数值化按照下式算出IRcm = PR+ (SI-Cm) +SP式中，IRcm为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的膜局部化的评分；PR为对显微镜下检测出所述复合体的细胞比例进行评分得到的数值；SI-Cm为对在显微镜下所述复合体在视野中细胞的细胞膜中被检测出的染色强度进 行评分得到的数值；SP为对在显微镜下的视野中细胞的细胞膜中显示出完全膜染色的细胞比例进行评分 得到的数值。
13.一种对肝癌细胞分类的方法，所述方法基于利用权利要求11及12所述的方法算 出的评分，对存在于受试者体内的肝癌细胞进行分类。
14.一种确定是否给与抗癌剂的方法，所述方法基于利用权利要求11及12所述的方 法算出的评分，确定是否给与受试者含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗癌剂。
15.一种确定抗癌剂给与量的方法，所述方法基于利用权利要求11及12所述的方法 算出的评分，确定对受试者进行肝癌治疗中含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗癌剂 的给与量。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测受试者体内肝癌细胞的存在的体外免疫测定方法。在本发明的方法中，检测肝癌组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗原的表达时，通过将利用热诱导抗原活化法的抗原活化处理与利用蛋白酶抗原活化法的抗原活化处理组合，能够根据免疫组织化学染色法检测出磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗原的表达量及表达方式的差异。由此，可以根据磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的表达量，对利用现有HIER法确认到磷脂酰肌醇蛋白聚糖3高度表达的样本进行等级分类。
文档编号G01N33/574GK102027372SQ20098011681
公开日2011年4月20日 申请日期2009年3月16日 优先权日2008年3月17日
发明者加藤淳彦, 杉本正道, 片冈宽章, 铃木雅实, 高居宏武 申请人:中外制药株式会社, 国立大学法人宫崎大学