专利名称：蔬菜农药残留速测纸卡及其制备方法
技术领域：
本发明属于农药残留量分析，具体地说，本发明涉及一种蔬菜农药残留速测纸卡及其制备方法背景技术我国是一个农业大国，农作物种植很丰富，除了粮食作物、油料、纤维作物、糖料、瓜果、药材烟外，还有大面积的水果、蔬菜、草场、森林等。因此中国也是个农药应用大国。农药的发明和使用无疑大大提高了农业生产力，但每年发生喷洒化学农药防治病虫害仍为不可不用的必要措施。随着人们生活质量的提高，对安全、营养、无污染的蔬菜、水果呼声日趋强烈，而当前水果、蔬菜上的农药用量大、次数多，滥用现象严重，因此农药残留超标引起急性中毒事件屡有发生，农药残留还可以在人体内积累造成慢性中毒，甚至导致三致(致畸、致癌、致突变)，此外由于农残超标造成我国农产品被国外拒绝的报道也屡见不鲜。因此在现代化的农业生产中，如何快速检测农药残毒已成为食品安全和人民饮食卫生的迫切需求。
果蔬上农药残留的检测工作，在许多国家早已制度化，目前国外使用免疫分析、超临界流体提取与超临界流体色谱、毛细管区域电泳等技术检测果蔬中的农药残留，这些分离测试技术的精确度和精密度均很高。但需要配备昂贵的仪器和设备，耗费时间长，费用高；而且许多西方国家商品蔬菜的生产集中，当地的农药残毒检验单位有充裕的时间进行检测。而我国的果蔬生产相对分散，即采即卖，不可能对抽检的大量样品用气相色谱等分析仪器进行分析，因此国外惯用的农药残留分析方法在我国无操作性，不能适用我国小农经济即采即卖的现场快速检测。近年来我国的科学工作者也从不同的角度作了大量的研究工作，力图寻找对有机磷和氨基甲酸酯类农药检测灵敏度高的胆碱酯酶。目前使用较多的是从海洋生物、动物血清、家蝇中提取的胆碱酯酶，北京农学院和北京分析仪器研究所经过数年研究较早研制出了农药残留速测仪及所用的关键试剂-高活性酶，检测过程大致为1、取样2、提取3、培养4、显色5、仪器测定。蔬菜2001年第3期《果蔬农药残留快速检测方法比较试验》公开了对有机磷和氨基甲酸脂类农药检测灵敏度较高的胆碱脂酶，同时公开的速测卡测试方法是称取样品——加入磷酸缓冲液超声2-3min——将一滴样品提取液加到速测卡白色药片位置——室温静止约3min——农药残留速测仪40℃反映10min，肉眼直接观察颜色变化(同时测定空白样品作为对照)。检测灵敏度、检测重现性见下表检测灵敏度

从上表可以看出甲胺磷1.2mg/kg，速测卡可检测出来；敌敌畏0.1mg/kg，速测卡可检测出来；乐果2.0mg/kg，速测卡可检测出来；氯氰菊酯30mg/kg，速测卡可检测出来。但此速测卡还须配备一台农药残留速测仪，才能检测出来，而且此速测卡只能检测有机磷农药。

发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒的高灵敏度、及热稳定性好的酶源，及酶在常温下的保存技术。
本发明的另一目的是提供一种简便、快速检测农药残留量的速测纸卡及其制备方法。
本发明的第一方面，提供一种高灵敏度、及热稳定性好的的酶源。从不同动物体中提取的乙酰胆碱酯酶(以下简称酶)对各种高毒禁用农药，检测灵敏度存在着相当大的差异，有些胆碱酯酶对极微量的农药就有反应，而有些胆碱酯酶对中毒剂量的农药也无反应，(胆碱酯酶对农药检测敏感度一般以抑制率％来表示)以马血清、人血清、牛肝、蜜蜂头部、家蝇的头部等动物器官或血清等几种动物体为材料，按常规方法提取筛选高灵敏度的酶源——乙酰胆碱酯酶。经实验筛选，本发明的人血清提取的酶比已有技术马血清提取的酶、家蝇脑提取的酶的抑制率明显高，为高敏感度酶源，本发明提供的高敏感度酶，为人血清提取的乙酰胆碱酯酶。用本发明的酶制剂，检测各种农药最低检测限结果如表1。
表1 本发明的人血清酶制剂对各种农药最低检测限

将本发明的结果与《果蔬农药残留快速检测方法比较试验》的结果比较结果如下
甲胺磷已有技术最低检测限1.2mg/kg；本发明最低检测限0.8mg/kg敌敌畏已有技术最低检测限0.1mg/kg；本发明最低检测限0.1mg/kg乐果 已有技术最低检测限2.0mg/kg；本发明最低检测限1.2mg/kg.
敌百虫本发明最低检测限0.25mg/kg.
克百威本发明最低检测限0.001mg/kg.
灭多威本发明最低检测限0.08mg/kg.
甲萘威本发明最低检测限0.08mg/kg.
从表中可以看出，本发明的酶制剂与已有技术的酶制剂相比灵敏度显著高。且已有技术的速测卡只能检测有机磷农药，本发明不但能检测有机磷农药而且能检测氨基甲酸酯类农药。敏感度达0.001～1.2mg/kg。进一步说明本发明的积极效果。
将本发明筛选出来的高灵敏度的人血清酶粉用PH8.0，0.1M磷酸缓冲液分别稀释成0.5～1.5单位酶液，然后在酶液中加入0.5～1.％明胶或0.5～1.％海藻糖混合，滴一滴酶液(约30μl)在直径为1.0cm的定性滤纸上，置室温干燥，制成酶片。将酶片放在恒温恒湿箱(可调温度)处理，然后测试酶的热稳定性结果如表2。
表2 酶片热稳定测试

以上测试结果表明本发明筛选的酶，经实验表明，在90℃左右条件下，酶活性可保持5-6小时，在本发明的酶液中加入稳定剂0.5～1.％明胶或0.5～1.％海藻糖混合，在90℃左右条件下，本发明的人血清酶活性可保持7-8小时，解决了酶常温下的保存技术。本发明是一种热稳定性好的酶源，解决了目前国内外酶系在常温下只能保存数小时的问题，进一步说明了本发明的积极效果。
本发明的第二方面，提供最佳酶浓度，将PH8.0，0.1M磷酸缓冲液稀释本发明的人血清酶为0.5、0.75、1、1.25、1.5不同单位，甲胺磷农药浓度为5mg/kg，经实验比较，较佳浓度为0.5单位，更佳浓度为0.75单位。
本发明的第三方面，提供最佳底物浓度，将100ml蒸馏水加入0.0448g铁氰化钾(赤血盐)和0.0715g亚铁氰化钾(黄血盐)混合盐中制成混合液(PH5.5)，先分别滴加一滴(30μl)混合液在3片滤纸上，再分别滴加一滴(约30μl)吲哚乙酸酯180mg/10ml丙酮、吲哚乙酸酯270mg/10ml丙酮、吲哚乙酸酯360mg/10ml丙酮在3片滤纸上，干燥后与酶反应，较佳底物浓度为270mg/10ml，最佳的底物浓度为180mg/10ml。
本方发明的第四方面，提供本发明人血清酶与农药最佳作用时间，将含有人血清酶溶液的酶片浸入甲胺磷溶液，取出后与底物分别作用2、5、10、15分钟，较佳地作用时间为5分钟，最佳的作用时间为8分钟。
本发明的第五方面，提供速测卡的制备方法及使用方法。按常规方法提取人血清中的乙酰胆碱酯酶，冷冻干燥为酶粉，用PH8，0.1M的磷酸缓冲液稀释冷冻干燥的本发明人血清酶粉，在酶溶液中加入辅剂0.5～1.0％明胶或0.5～1.0％海藻糖，将配制好的酶溶液滴加到定性滤纸上制成酶片，放置室温干燥待用；在定性滤纸上滴加配制好的铁氰化钾和亚铁氰化钾混合液，再滴加配制好的吲哚乙酸酯180mg-360/10ml的丙酮溶液，制成底物片放置室温干燥备用。将一滴(30μl)的农药或蔬菜汁滴加到酶片上，湿润30秒，室温静止8分钟，或将酶片放入含有一定浓度的农药溶液或蔬菜汁中，同样浸渍30秒，将酶片捞取，放室温静止8分钟，将底物叠于酶片上，用手捏紧3分钟，揭开酶片，观察显色情况。
为了进一步说明本发明的积极效果，将本发明制备的速测纸卡检测8种农药的灵敏度结果如表3。
表3 本发明的速测卡对8种农药检测的灵敏度

从表3可以看出，本发明的速测纸卡不必借助仪器，对蔬菜上常用农药的检测限均在0.2～5mg/kg范围内，均在世界卫生组织(WHO)、世界粮农组织(FAO)提出的每日每人每公斤体重对农药的允许摄入量(ADI)规定的标准以下，因此依据速测卡测定为阴性的试样不会对人体造成急性危害，对于预防农药中毒，禁止毒菜进入市场将起到监督作用。
综合本发明的实验结果，人血清乙酰胆碱酯酶与已有技术的酶制剂相比灵敏度显著高。敏感度达0.001～1.2mg/kg。且本发明的人血清乙酰胆碱酯酶是一种热稳定性好的酶源，在90℃左右条件下，酶活性可保持5-6小时，在本发明的酶液中加入稳定剂0.5～1.％明胶或0.5～1.％海藻糖混合，在90℃左右条件下，本发明的人血清酶活性可保持7-8小时，解决了目前国内外酶系在常温下只能保存数小时的问题，用本发明的人血清酶制备的速测纸卡不必借助仪器，对蔬菜上常用农药的检测限均在0.2～5mg/kg范围内，均在世界卫生组织(WHO)、世界粮农组织(FAO)提出的每日每人每公斤体重对农药的允许摄入量(ADI)规定的标准以下，对于预防农药中毒，禁止毒菜进入市场将起到监督作用。本发明实用性强，且操作简单快速，一次测定仅需12分钟。成本低廉，是一种有广阔市场前景的产品下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。
实施例1、酶源的筛选以马血清、人血清、牛肝、蜜蜂头部、家蝇的头部等动物器官或血清为材料，按常规方法提取、筛选高灵敏度的酶源——乙酰胆碱酯酶。分别将冷冻的马血清、人血清、牛肝、蜜蜂脑、家蝇的脑捣碎，按1∶9(W/V)比例加蒸馏水，匀浆3分钟，以2000-3000r/min离心10分钟，上清液经滤纸过滤后，冷冻干燥，分装备用，置-20℃冻存，即为酶源。
1)试剂配制酶液配制用PH8.，0.1M磷酸缓冲液分别稀释冷冻干燥后的马血清酶粉、人血清酶粉、牛肝酶粉、蜜蜂脑酶粉、家蝇脑酶粉，，配制成0.75单位。
农药浓度甲胺磷为0.8ppm、呋喃丹0.002ppm。
底物硫代乙酰胆碱碘化物。
显色剂二硝基苯甲酸，测试浓度为0.08mg。
2.)仪器CL-I残留农药测定仪、专用分光光度仪410nm。
借助专用分光光度仪，利用酶抑制法对上述5种乙酰胆碱酯酶进行筛选结果如表4。
表4 5种乙酰胆碱酯酶对农药敏感度比较 从表4可以看出，从各种动物器官或血清中提取的胆碱酯酶对农药的灵敏度差异，本发明的人血清提取的酶比已有技术马血清提取的酶、家蝇脑提取的酶的抑制率明显高，为高敏感酶源，实施例2酶浓度的选择1)酶制剂配制将本发明冷冻干燥的人血清酶粉用PH8.0，0.1M磷酸缓冲液分别稀释成0.5、0.75.1.0、1.25、1.5不同单位。滴加一滴(约30μl)在直径为1.0cm的定性滤纸上，制成酶片。
2)底物将0.0448g铁氰化钾(赤血盐)、0.0715g亚铁氰化钾(黄血盐)混合，加入100ml蒸馏水(PH5.5)混合后，加一滴(约30μl)在边成为1.0cm2的定性滤纸上，再滴加30μl吲哚乙酸酯180mg/10ml丙酮溶液，制成底物片。
3)甲胺磷浓度为0.1mg/μl。
4)对照选用蒸馏水将五种酶浓度酶片与农药甲胺磷反应结果如表3表5 五种酶浓度对甲胺磷反应比较
*+++ 全对照色(酶催化底物正常水解，不含农药) 全蓝色++ 部分显色(酶与底物反应不完全)淡蓝+显色差(酶与底物反应差) 极浅蓝-全抑制(酶全被农药抑制) 白色从表5可以看出0.75单位酶浓度对照显色好，又能被0.1mg/μl甲胺磷农药抑制，对照与抑制色差明显，所以0.75单位为最佳酶浓度，0.5单位为较佳浓度。
实施例3最佳底物浓度的选择1)底物片的制备将0.0448g铁氰化钾(赤血盐)、0.0715g亚铁氰化钾(黄血盐)混合加入100ml蒸馏水，取混合液一滴(约30μl PH5.5)先分别滴加在3片边长为1.0em2定性滤纸上，然后再分别将一滴(约30μl)吲哚乙酸酯180mg/10ml丙酮液、吲哚乙酸酯270mg/10ml丙酮液、吲哚乙酸酯360mg/10ml丙酮液在3片定性滤纸上，室温干燥待用成为底物片.。
2)酶片的制备将本发明冷冻的人血清提取的酶粉用PH8.0，0.1M磷酸缓冲液分别稀释成0.5、0.75.不同单位。滴加在直径为1.0cm的定性滤纸上，制成酶片。
将0.5单位、0.75单位的酶片分别与底物片(吲哚乙酸酯180mg/10ml丙酮、吲哚乙酸酯270mg/10ml丙酮、吲哚乙酸酯360mg/10ml丙酮)反应结果如表6。
表6. 3种底物浓度与酶反应的显色比较 ++++ 全蓝色(酶与底物反应好)，显色好(50秒以内)；+++ 全蓝色(酶与底物反应好)，显色慢(超过50秒；)++ 不均匀显色(呈斑点状)，显色快(50秒以内)；+不均匀显色(呈斑点状)，显色慢(超过50秒)。
从表4可以看出0.75单位酶浓度，吲哚乙酸酯180mg/10ml丙酮底物浓度，全蓝色(酶与底物反应好)显色好，显色快，，0.5单位酶浓度，吲哚乙酸酯180mg/10ml丙酮底物浓度，全蓝色(酶与底物反应好)显色稍慢，所以吲哚乙酸酯180/10ml丙酮为最佳浓度。
实施例4酶与农药最佳作用时间的选择将本发明人血清酶制剂制成的酶片(0.75单位)浸入5mg/kg甲胺磷水溶液中，约30秒，取出放置8分钟，然后与实施例3所述的底物片分别叠合2、5、10、15分钟，观察酶片显色情况，区分抑制与否，结果如表5。
表7 酶与农药作用不同时间的比较 +(农药对酶未及抑制)全蓝色；-(农药对酶抑制)抑制色从表7可以看出。酶与农药作用的最佳时间为8分钟。
实施例5速测卡的制备和使用1、速测卡的制备a)酶的提取以人血清为材料，按1∶9(W/V)比例加蒸馏水，匀浆3分钟，以2000-3000r/min离心10分钟，上清液经滤纸过滤后，冷冻干燥，分装备用，置-20℃冻存，即为酶源。
b)酶片的制备用PH8.0，0.1M磷酸缓冲液稀释本发明从人血清提取的乙酰胆碱酯酶冷冻干燥酶粉成0.75单位酶液，在酶液中加入1％明胶混合，将配制好的酶液滴加在直径为1.0cm的定性滤纸上，放置室温干燥待用。
c)底物片的制备将0.0448g铁氰化钾(赤血盐)、0.0715g亚铁氰化钾(黄血盐)混合，加入100ml蒸馏水，取铁氰化钾和亚铁氰化钾混合液一滴(约30μl PH5.5)先滴加在边长为1.0cm2定性滤纸上，然后再将180mg吲哚乙酸酯与10ml丙酮溶液混合，再滴加30μl吲哚乙酸酯丙酮溶液在定性滤纸上，然后放室温干燥待用。
d)速测卡的制备取宽2cm、长5cm的长方形粗卡片衬纸，将a)制备好的圆型酶片用双面胶粘在纸卡的上方，将b)制备的正方形底物片用双面胶粘在纸卡的下，将速测卡的酶片与底物反向折叠，相互不接触待用。将制备好的速测卡放入小的塑料袋封口，放入冰箱(-20℃冻存)待用。
2、速测卡的使用a)将30μl量的农药或菜汁滴加到酶片上湿润30秒；b)将酶片放室温静止8分钟；c)将底物片叠合于酶片上，用手捏紧3分钟；
d)揭开酶片，观察显色情况。
全蓝色，无农药存在，浅蓝色或白色有农药或超标农药存在。
为了进一步说明本发明的积极效果，将本发明实施例5制备的速测纸卡，在全国部分地区的蔬菜地进行检测调查，结果如表8。
表8 速测卡在全国部分地区的蔬菜地进行检测调查结果

从表8可以看出，使用本发明的速测纸卡检测蔬菜敏感度达0.05～2.10mg/kg，且操作简单快速，一次测定仅需12分钟。成本低廉(0.5元)，而且不需要借助残留农药检测仪、就能明确判定可食用蔬菜上的残留农药是否超标，它不仅适用于家庭对食用蔬菜进行检测，还将给市场监督、田间蔬菜进行快速筛选监测、卫生防疫站、农业系统植检站等单位对蔬菜农药残留的检测带来极大的方便。亦可适用于水、土壤和其他农产品中有机磷农药、氨基甲酸酯类农药的测定，本发明实用性强，是一种有广阔市场前景的产品。
权利要求
1.一种蔬菜农药残留速测纸卡，包括衬纸、底物片和酶片组成，其特征在于所述的酶片中的酶为人血清中提取的乙酰胆碱酯酶。
2.如权利要求1所述的蔬菜农药残留速测纸卡，其特征在于在所述的人血清中提取的乙酰胆碱酯酶溶液中加入0.5～1.5％的稳定剂。
3.如权利要求2所述的蔬菜农药残留速测纸卡，其特征在于在所述的人血清中提取的乙酰胆碱酯酶酶溶液中加入1％的稳定剂。
4.如权利要求2的所述的蔬菜农药残留速测纸卡，其特征在于所述的稳定剂可选自明胶或海藻糖。
5.如权利要求1所述的蔬菜农药残留速测纸卡的制备方法，包括以下步骤1)酶的提取以人血清为材料，按1∶9(W/V)比例加蒸馏水，匀浆3分钟，以2000-3000r/min离心10分钟，上清液经滤纸过滤后，冷冻干燥，分装备用，置-20℃冻存。即为酶源。2)酶片的制备用PH8.0，0.1M磷酸缓冲液稀释人血清提取的乙酰胆碱酯酶冷冻干燥酶粉成0.5-1.0单位酶液，将配制好的酶液滴加在直径为1.0cm的圆型定性滤纸上，放置室温干燥待用。3)底物片的制备将0.0448g铁氰化钾(赤血盐)、0.0715g亚铁氰化钾(黄血盐)混合，加入100ml蒸馏水，取铁氰化钾和亚铁氰化钾混合液一滴(约30μl PH5.5)先滴加在边长为1.0cm2定性滤纸上，然后再将180-270mg吲哚乙酸酯与10ml丙酮溶液混合，再滴加一滴(约30μl)吲哚乙酸酯丙酮溶液在定性滤纸上，然后放室温干燥待用。4)速测卡的制备取宽2cm、长5cm的长方形粗卡片衬纸，将2)制备好的圆型酶片用双面胶粘在纸卡的上方，将3)制备的正方形底物片用双面胶粘在纸卡的下方，将速测卡的酶片与底物反向折叠，相互不接触，将制备好的速测卡放入小的塑料袋封口，放入冰箱(-20℃冻存)待用。
6.如权利要求5所述的蔬菜农药残留速测纸卡的制备方法，其特征在于所述的酶浓度，为0.5-0.75单位。
7.如权利要求6所述的蔬菜农药残留速测纸卡的制备方法，其特征在于所述的酶浓度，为0.75单位。
8.如权利要求5所述的蔬菜农药残留速测纸卡的制备方法，其特征在于所述的底物浓度，在酶浓度在0.5单位时，底物浓度为吲哚乙酸酯180mg/10ml丙酮为最佳浓度。
全文摘要
本发明提供了一种蔬菜农药残留速测纸卡及其制备方法，本发明的速测纸卡选用从人血清中提取的乙酰胆碱酯酶酶片，它对有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测灵敏达0.001～1.2mg/kg，是一种高敏感酶源，本发明也是一种热稳定性好的酶源，尤其在酶液中加入稳定剂明胶或海藻糖后，在90℃左右条件下，酶活性可保持7－8小时。本发明制备的速测纸卡，对蔬菜上常用农药都能检测，且操作简单快速，不需要借助残留农药检测仪、就能明确判定可食用蔬菜上的残留农药是否超标，一次测定仅需12分钟。成本低廉，它不仅适用于家庭检测，还将给市场监督、田间蔬菜进行快速筛选监测、卫生防疫站、农业植检站等单位对蔬菜农药残留的检测带来极大的方便。
文档编号G01N33/52GK1734257SQ20041005361
公开日2006年2月15日 申请日期2004年8月10日 优先权日2004年8月10日
发明者吴虹, 戴小杰 申请人:中国科学院上海生命科学研究院