专利名称：Sds-page法鉴别肉及肉制品中动物源性成份的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴别肉及肉制品中动物源性成份的方法，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴别肉及肉制品中猪、牛、羊、鸡、鱼源性成份， 属于食品卫生检验领域，在食品卫生安全检验方面具有非常重要的意义。
背景技术：
肉制品具有很高的营养价值，含有优质蛋白和多种必需氨基酸，是人类饮食中的重要食品。随着人们膳食结构的不断改变，肉类需求不断增加，市场上也出现了很多假冒羊肉或牛肉等现象，比如有人在病死猪肉内掺入羊油或牛油，装入塑料袋里冷冻后就变成了 “羊肉卷”、“牛肉卷”。由于疯牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的发现和流行，使得食品中的动物源性成份受到严格限制，不少人甚至害怕吃牛肉、猪肉和鸡肉等。此外，我国是一个多民族组成的国家，各种宗教习惯使得人们的饮食有所差异，对肉类的选择具有一定的倾向性；同时，一些特殊人群如患有高血压，脂肪肝等的患者对肉的选择具有特殊性。因此，食品中动物源性成份的鉴别已成为一个特别受人关注的问题。为了保护消费者的利益和进出口贸易的公平，对肉制品进行检测具有重要的社会和经济意义。传统的肉品检测采用感官检验和免疫学方法仅对其生鲜肉具有一定鉴别作用，但对加工处理的肉制品，由于其感官性状，蛋白质成分和其它免疫原性物质被破坏，难以鉴别，这给肉制品的交易和进出口带来了极大的不便。黄昆仑等人发明的专利(申请号 200710175520. 6 ；公开号:CN101173316A)提供了一种鸡肉、牛肉、猪肉和马肉多重PCR快速检测试剂盒的方法，该方法能够快速鉴别动物源性成份，但不够经济实用。杨德吉等人发明的专禾Ij (申请号200810243974. 7 ；公开号=CN 101435001A)提供了一种利用微卫星标记技术鉴别肉制品中源性成份的方法，其通过提取DNA模版，设计特异性引物，建立PCR检测方法，根据扩增产物片段大小及有无鉴定肉制品中动物源性成份，该方法能准确地鉴定肉制品的动物源性成份，但较繁琐。随着我国加入世界贸易组织，国际贸易量与日俱增。因此， 建立一种快速、准确、简便的动物源性成份鉴别的方法具有重大的意义。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前应用最广泛的电泳方法，该方法是对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济、快速而且可重复的方法。该方法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离鉴定。SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量呈正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去垢剂和强还原剂，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，成为许多研究领域中一种重要的分析技术。

发明内容
技术问题本发明的目的在于针对食品安全卫生检验方面动物源性成份鉴别困难的问题，提
3供一种利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术鉴别肉及肉制品中猪、牛、羊、鸡、鱼源性成份的方法。技术方案本发明提供一种利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术鉴别肉及肉制品中猪、牛、 羊、鸡、鱼源性成份的方法。该方法通过提取各种动物源性成份不同加热温度的可溶性蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳图谱鉴别肉制品中猪、牛、羊、鸡、鱼源性成份。上述鉴别肉及肉制品中猪、牛、羊、鸡、鱼源性成份的方法为(1)肉制品中可溶性蛋白质的提取称取去皮肌肉组织，每份2gOcmX IcmX Icm)左右，共7份，其中一份置于室温，其余6份分别置于50 V、60°C、70 V、80°C、90°CU00 V恒温水浴中加热3min，立即取出放于碾钵中，加入4°C预冷的0. 5M Tris-HCl缓冲液20ml，碾磨勻浆lOmin，直至溶液呈稀薄状，转移Iml处理好的样品，8000r/min离心15min，吸取100 μ L离心后的上清液即为可溶性蛋白质。(2)以可溶性蛋白质为供试样品，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳制胶分离胶浓度为12%，堆积胶浓度为5%，厚度为1mm。上样取20 μ L供试样品与5 μ L 5Χ样品缓冲液在Eppendorf管中混合，用微量注射器吸取样品10 μ L加入样品孔底部，避免混入气泡。电泳将电泳槽放置于4°C环境中进行电泳，调节堆积胶电泳电压为80V，电流为 100mA，当样品呈一条直线，接近分离胶时，将分离胶电泳电压调至120V，电流100mA，观察蓝色条带接近于分离胶底部时，停止电泳。(3)电泳结果检测将胶取出置于培养皿中，加入固定液振荡30min后，将固定液倒掉并将胶片用蒸馏水冲净，再加入等量的考马斯亮蓝染色液，摇床振荡Ih后倒掉染色液，加入脱色液，摇床振荡池后倒掉脱色液，观察结果。(4)样品鉴定肉制品中，由于未经处理样品蛋白质未发生热变性的原因，新鲜未经加热处理的动物肌肉组织的SDS-PAGE图谱具有条带分布多的特征，猪、牛、羊、鸡、鱼的电泳条带各不相同。根据电泳图谱可判断出未经加热处理的动物肌肉组织的种类。经过50 V、60°C、70 V、80°C、90°CU00 V处理后样品的SDS-PAGE图谱相比新鲜未经处理样品的SDS-PAGE图谱，具有以下几个特点经50°C、60°C处理后样品的SDS-PAGE图谱与新鲜未经处理样品比产生轻微差异， 表明动物肌肉组织经50°C、6(TC处理后有较轻的蛋白质热变性，其中猪肉样品分子量约为 97. 4KD的条带消失；牛肉和羊肉样品分子量约为25. 4KD和26. 3KD的两条带消失，大体可判断消失的两条条带为同种物质；鸡肉样品在50°C和60°C之间基本没有变化；鱼肉样品分子量约为55. 8KD和60. 7KD两条带消失。经70°C处理后样品SDS-PAGE图谱与未处理样品和50°C及60°C相比产生显著差异，电泳条带进一步变少且只在特定分子量处出现条带，猪肉和羊肉分别具有分子量约为 59. 8KD、43. OKD,41. 6KD、35. 9KD、34. 8KD的电泳条带；牛肉与猪肉和羊肉相比，缺少一条分
4子量约为41. 6KD电泳条带；鸡肉电泳条带仍较多；鱼肉有两条分子量约为30. 2KD、29. 74KD 的电泳条带。对于猪、牛、羊肉样品，经过80°C、90°C、100°C处理后SDS-PAGE图谱与相应新鲜未经处理样品差异最大，与相应70°C处理样品差异明显，猪肉和牛肉剩下35. 9KD、34. 8KD的电泳条带，羊肉分子量为59. 8KD的电泳条带消失；对于鸡肉和鱼肉样品，当达到70°C后，温度升高图谱不再变化。有益效果本发明提供一种利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术鉴别肉及肉制品中猪、牛、 羊、鸡、鱼源性成份的方法。该方法具有特异性和敏感性较强、操作简单、结果判定直观可靠的特点。对于防止各种动物疫病病原体传入我国、防止不法商家瞒报商品成份，保证人民饮食安全和身体健康，都具有非常重要的意义。
四

图1 图5 分别为猪、牛、羊、鸡、鲤鱼动物源性成份检测结果图。1 新鲜未经处理样品；2 :50°C ；3 :60°C ；4 标准蛋白(14. 4KD、20. 1KD、31. 0KD、 43. 0KD、66. 2KD、97. 4KD) ；5 :70°C ；6 :80°C ；7 :90°C ；8 :100°Co
五具体实施例方式实施例1 (一)采集样品在市场上随机采集猪、牛、羊、鸡、鲤鱼样品，总共5个样品。(二)样品制备称取去皮肌肉组织，每份2gOcmX IcmX Icm)左右，共7份，其中一份置于室温，其余6份分别置于50°C、60 V、70°C、80。C ,90°C UOO。C恒温水浴中加热 3min，立即取出放于碾钵中，加入4°C预冷的0. 5M Tris-HCl缓冲液20ml，碾磨勻浆lOmin， 直至溶液呈稀薄状，转移Iml处理好的样品，8000r/min离心15min，吸取100 μ L离心后的上清液即为可溶性蛋白质，将该样品作为供试样品。(三)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳制胶分离胶浓度为12%，堆积胶浓度为5%，厚度为1mm。上样取20 μ L供试样品与5 μ L 5 X样品缓冲液在Eppendorf管中混合，用微量注射器吸取样品10 μ L加入样品孔底部，避免混入气泡。电泳将电泳槽放置于4°C环境中进行电泳，调节堆积胶电泳电压为80V，电流为 100mA，当样品呈一条直线，接近分离胶时，将分离胶电泳电压调至120V，电流100mA，观察蓝色条带接近于分离胶底部时，停止电泳。(四)电泳结果检测将胶取出置于培养皿中，加入固定液震荡30min后，将固定液倒掉并将胶片用蒸馏水冲净，再加入等量的考马斯亮蓝染色液，摇床震荡Ih后倒掉染色液，加入脱色液，摇床震荡池后倒掉脱色液，观察结果。(五)样品鉴定肉制品中，由于未经处理样品蛋白质未发生热变性的原因，新鲜未经加热处理的动物肌肉组织的SDS-PAGE图谱具有条带分布多的特征，猪、牛、羊、鸡、鱼的电泳条带各不相同。根据电泳图谱可判断出未经加热处理的动物肌肉组织的种类。通过比较图1 图5可以发现经过50°C、60°C、70V ,80V,90°CUOOV处理后样
5品的SDS-PAGE图谱相比新鲜未经处理样品的SDS-PAGE图谱，具有以下几个特点经50°C、60°C处理后样品的SDS-PAGE图谱与新鲜未经处理样品比产生轻微差异， 表明动物肌肉组织经50°C、6(TC处理后有较轻的蛋白质热变性，其中猪肉样品分子量约为 97. 4KD的条带消失；牛肉和羊肉样品分子量约为25. 4KD和26. 3KD的两条带消失，大体可判断消失的两条条带为同种物质；鸡肉样品在50°C和60°C之间基本没有变化；鱼肉样品分子量约为55. 8KD和60. 7KD两条带消失。经70°C处理后样品SDS-PAGE图谱与未处理样品和50°C及60°C相比产生显著差异，电泳条带进一步变少且只在特定分子量处出现条带，猪肉和羊肉分别具有分子量约为 59. 8KD、43. 0KD,41. 6KD、35. 9KD、34. 8KD的电泳条带；牛肉与猪肉和羊肉相比，缺少一条分子量约为41. 6KD电泳条带；鸡肉电泳条带仍较多；鱼肉有两条分子量约为30. 2KD、29. 74KD 的电泳条带。对于猪、牛、羊肉样品，经过80°C、90°C、100°C处理后SDS-PAGE图谱与相应新鲜未经处理样品差异最大，与相应70°C处理样品差异明显，猪肉和牛肉剩下35. 9KD、34. 8KD的电泳条带，羊肉分子量为59. 8KD的电泳条带消失；对于鸡肉和鱼肉样品，当达到70°C后，温度升高图谱不再变化。
权利要求
1. 一种利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术鉴别肉及肉制品中动物源性成份的方法， 其特征在于(1)肉制品中可溶性蛋白质的提取称取去皮肌肉组织，每份2g0cmxIcmX Icm)左右，共7份，其中一份置于室温，其余6份分别置于50 V、60°C、70°C、80°C、90 V、100 V恒温水浴中加热3min，立即取出放于碾钵中，加入4°C预冷的0. 5M Tris-HCl缓冲液20ml， 碾磨勻浆lOmin，直至溶液呈稀薄状，转移Iml处理好的样品，8000r/min离心15min，吸取 100 μ L离心后的上清液即为可溶性蛋白质。(2)以可溶性蛋白质为供试样品，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。制胶分离胶浓度为12%，堆积胶浓度为5%，厚度为1mm。上样取20yL供试样品与5yL5X样品缓冲液在Eppendorf管中混勻，用微量注射器吸取样品10 μ L加入样品孔底部，避免混入气泡。电泳将电泳槽放置于4°C环境中进行电泳，调节堆积胶电泳电压为80V，电流为 IOOmA,当样品呈一条直线，接近分离胶时，将分离胶电泳电压调至120V，电流100mA，观察蓝色条带接近于分离胶底部时，停止电泳。(3)电泳结果检测将胶取出置于培养皿中，加入固定液振荡30min后，将固定液倒掉并将胶片用蒸馏水冲净，再加入等量的考马斯亮蓝染色液，摇床振荡Ih后倒掉染色液，加入脱色液，摇床振荡池后倒掉脱色液，观察结果。(4)样品鉴定肉制品中，由于未经处理样品蛋白质未发生热变性的原因，新鲜未经加热处理的动物肌肉组织的 SDS-PAGE图谱具有条带分布多的特征，猪、牛、羊、鸡、鱼的电泳条带各不相同。根据电泳图谱可判断出未经加热处理的动物肌肉组织的种类。经过50 V、60°C、70 V、80°C、90°CU00 V处理后样品的SDS-PAGE图谱相比新鲜未经处理样品的SDS-PAGE图谱，具有以下几个特点经50°C、6(TC处理后样品的SDS-PAGE图谱与新鲜未经处理样品比产生轻微差异，表明动物肌肉组织经50°C、6(TC处理后有较轻的蛋白质热变性，其中猪肉样品分子量约为 97. 4KD的条带消失；牛肉和羊肉样品分子量约为25. 4KD和26. 3KD的两条带消失，大体可判断消失的两条条带为同种物质；鸡肉样品在50°C和60°C之间基本没有变化；鱼肉样品分子量约为55. 8KD和60. 7KD两条带消失。经70°C处理后样品SDS-PAGE图谱与未处理样品和50°C及60°C相比产生显著差异， 电泳条带进一步变少且只在特定分子量处出现条带，猪肉和羊肉分别具有分子量约为 59. 8KD、43. 0KD,41. 6KD、35. 9KD、34. 8KD的电泳条带；牛肉与猪肉和羊肉相比，缺少一条分子量约为41. 6KD电泳条带；鸡肉电泳条带仍较多；鱼肉有两条分子量约为30. 2KD、29. 74KD 的电泳条带。对于猪、牛、羊肉样品，经过80°C、90°C、100°C处理后SDS-PAGE图谱与相应新鲜未经处理样品差异最大，与相应70°C处理样品差异明显，猪肉和牛肉剩下35. 9KD、34. 8KD的电泳条带，羊肉分子量为59. 8KD的电泳条带消失；对于鸡肉和鱼肉样品，当达到70°C后，温度升高图谱不再变化。
全文摘要
本发明涉及一种利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴别肉制品中动物源性成份的方法，属于食品卫生检验领域。利用该方法鉴别肉制品中猪、牛、羊、鸡、鱼源性成分，通过对新鲜动物肌肉组织进行不同温度热处理，对处理后的样品提取可溶性蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。根据电泳图谱判断肉制品中猪、牛、羊、鸡、鱼源性成份。该方法具有特异性和敏感性强，操作简单，结果判定直观可靠的特点。对于防止口蹄疫、禽流感等动物疫病病原体传入我国、防止不法商贩瞒报商品成份，保证人民的健康，具有非常重要的意义。
文档编号G01N33/12GK102213720SQ20101016285
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月8日 优先权日2010年4月8日
发明者周光宏, 孙京新, 徐幸莲, 罗欣, 董佩谕, 黄明 申请人:南京农业大学, 青岛农业大学