专利名称：梅花鹿γ-干扰素双抗体夹心ELISA检测方法及试剂盒与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物基因工程技术领域和动物传染病技术领域。具体涉及梅花鹿γ-干扰素检测方法及试剂盒与应用。

背景技术：
鹿结核病(Cervus Tuberculosis，CTB)主要是由牛型分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种慢性人兽共患传染病。该病其易传染，一年四季均可发生，呈世界性流行，曾经是引起人畜死亡数最多的疾病之一，被世界动物卫生组织(OIE)定为B类动物传染病，中国将其列为二类动物疫病。主要引起人和动物结核病的分枝杆菌有3种人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、禽型结核分枝杆菌。国内外结核病原学调查均发现，牛结核、人结核和鹿结核是相互传染的。因此，控制牛结核病和人结核，必须兼顾鹿等野生动物结核病的防制。由于目前为止尚未发现有效药物与疫苗用于鹿结核病的防治，一些国家普遍采用的是“检疫-捕杀”政策，即检疫出的阳性鹿一律捕杀来实现控制鹿结核病。因此，准确而及时的诊断方法对于该病的防治显得尤为重要。
OIE唯一推荐的方法是牛型结核菌素皮内变态反应(Tuberculin skin test，TST)。但由于结核菌素可能包含有与其它分枝杆菌相同的非特异性抗原组份，检测时容易出现假阳性；结核菌素皮内变态反应对感染后期的开放性结核及全身性结核不敏感。此外，TST程序繁琐、耗时费力、结果判断主观性强，需专业人员操作，使“检疫-扑杀”政策的实施效果大打折扣，且其只能进行活体试验，而不能对保存的样品进行回顾性分析，更不适用于野生动物和边远山区的牛型结核病普查。因此，人们致力于开发一种更加简便、快速、高特异性、高敏感性的新型诊断方法。
γ-干扰素(简称IFN-γ)是CD4+Th1细胞、CD8+细胞毒性T细胞和NK细胞等在抗原(细菌、病毒等)及有丝分裂原(ConA和PHA等)刺激下产生的一种细胞因子。IFN-γ具有抗感染、抗肿瘤活性和免疫调节作用，如活化巨噬细胞、提高MHC I类和II类分子的表达、促进抗原提呈等，在机体抗感染与免疫中发挥重要作用。基于IFN-γ与感染之间的密切联系，医学及兽医学上均利用病原体特异性抗原体外刺激单核细胞产生IFN-γ进行传染病诊断。该方法灵敏度与特异性均高，显示出很大的应用前景。IFN-γ体外释放检测法是用分枝杆菌特异性或非特异性抗原外刺激受检动物全血或外周单个核细胞(PBMC)，使少量T细胞充分接受刺激，从而分泌大量IFN-γ，然后用酶联免疫吸附法检测IFN-γ浓度的细胞方法，IFN-γ体外释放检测法对结核病潜伏感染的早期诊断具有重要意义。
IFN-γ试验较高的特异性将有助于低流行国家对结核隐性感染(LTBI)进行更加精确的诊断并对检出个体及时进行针对性的抗结核治疗，减少耐药性结核分枝杆菌的传播及控制抗生素的滥用。抗原特异性IFN-γ试验可以用于检测抗结核治疗的效果。根据抗原特异性IFN-γ试验的试验原理，在体内环境下，最近接触过TB特异性抗原的效应淋巴细胞再次遇到相同的抗原时，只需数小时即可产生IFN-γ。与效应淋巴细胞不同的是，记忆T淋巴细胞往往需要几天时间才能生成IFN-γ。因此，如果在检测中全血的培养时间为24小时或者更短的时间，检测的主要是效应淋巴细胞产生的IFN-γ，而不是由记忆T淋巴细胞所产生。而如果延长培养时间，则检测的将主要是记忆T细胞产生的IFN-γ，这可能使得经过治疗或者感染已被清除的患者产生阳性结果。因此，抗原特异性IFN-γ试验可以用来作为TB机体病情发展及治疗效果的进行评价。


发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种梅花鹿γ-干扰素双抗体夹心ELISA检测方法、试剂盒及在梅花鹿结核病体外诊断中的应用。
本发明的要点是获得具有很好特异性、敏感性和稳定性的单克隆抗体细胞株，通过对梅花鹿γ-干扰素(IFN-γ)单/多克隆抗体最佳工作浓度的确定、最佳封闭浓度和时间的确定、最佳抗体结合(孵育)时间的确定、最佳待检血浆刺激浓度和时间的确定和最佳待检细胞因子(IFN-γ)浓度的确定，最终建立梅花鹿IFN-γ结核病的检测方法和专用试剂盒与应用。
本发明通过以下技术方案实现 本发明将构建的重组融合载体质粒pET-32a-IFN-γ转移到大肠杆菌BL21感受态细胞中，诱导表达获得一种具有抗病毒、抗肿瘤活性、免疫调节作用和强耐热性的可溶性IFN-γ蛋白。利用纯化的IFN-γ蛋白免疫小鼠，用真核细胞系稳定分泌表达上清筛选阳性杂交瘤细胞，获得一株高效价的单克隆抗体。用所获得的单克隆抗体及兔抗IFN-γ多克隆抗体建立了梅花鹿IFN-γ的双抗体夹心ELISA检测方法及其专用试剂盒，其检测灵敏度达到24.9pg/ml。
申请人:将获得的一株能够稳定分泌梅花鹿干扰素-γ单克隆抗体的细胞株CerIFN-γ4C于2009年12月1日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NOC200966。
申请人:建立了一种梅花鹿γ-干扰素的双抗体夹心ELISA检测方法，其步骤包括 (1)用包被液将保藏号为CCTCC NOC200966的梅花鹿γ-干扰素单克隆抗体稀释到工作浓度(50ng/孔)加入酶标板孔内，每孔100μl，37℃作用1h后置4℃冰箱过夜； (2)弃去孔内液体，用冲洗液洗酶标板3次，每次3min，用吸水纸拍干； (3)在各酶标板孔的孔中加入封闭液100μl，37℃作用1h，按步骤(2)的方法洗涤； (4)将诱导的待测的梅花鹿全血培养上清，加入包被有梅花鹿γ-干扰素单克隆抗体的ELISA板孔中，每孔100μl；同时将收集的阴性和阳性对照培养上清分加加入孔中，37℃作用1h，重复步骤(2)的方法洗涤； (5)用冲洗液将兔抗梅花鹿γ-干扰素多克隆抗体按工作浓度(50ng/孔)稀释，每孔加入100μl，37℃作用1h，重复步骤(2)的方法洗涤； (6)用冲洗液将辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG按工作浓度稀释(按照体积比1∶5000)，每孔加入100μl，37℃作用1h，重复步骤(2)的方法洗涤； (7)在酶标板孔的每孔中加入显色液100μl，室温避光显色10min； (8)在酶标板孔的每孔中加入50μl终止液使其终止反应； (9)在酶联免疫检测仪上于630nm波长处测定步骤(8)光吸收值； 其中 步骤(1)所述的包被液配制如下碳酸钠1.59g；碳酸氢钠2.93g；用蒸馏水定容至1000ml； 步骤(2)所述的配制如下氯化钠8.0g；氯化钾0.2g；磷酸氢二钠0.2g；磷酸二氢钾2.9g；吐温-200.5ml；用蒸馏水定容至1000ml，pH7.4； 步骤(3)所述的封闭液配制如下冲洗液100ml；脱脂牛奶10g； 步骤(7)所述的显色液配制如下磷酸氢二钠7.16g；柠檬酸1.92g；用蒸馏水定容至100ml，得到A液；磷酸氢二钠7.16g；柠檬酸1.92g；用蒸馏水定容至100ml，pH 5.0，得到0.1mol/L的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液100ml，再添加邻苯二胺40mg；30％浓度的过氧化氢0.15ml，得到B液，混合所述的A液和B液，得到显色液。
步骤(8)所述的终止液配制如下2mol/L的硫酸22.2ml，蒸馏水177.8ml。
申请人:还组装了与上述检测方法相适应的梅花鹿γ-干扰素的双抗体夹心的ELISA检测试剂盒，它包括保藏编号为CCTCC NOC200966的梅花鹿γ-干扰素单克隆抗体，梅花鹿γ-干扰素多克隆抗体，保藏号为CCTCC NOM208244(专利申请号为2009100609131，专利公开号为CN101538578A)牛结核特异性三基因融合抗原蛋白RCE，辣根过氧化物标记羊抗兔IgG，显色液和终止液。
其中所述的显色液和终止液的组分及配制方法如下 显色液磷酸氢二钠7.16g；柠檬酸1.92g；用蒸馏水定容至100ml，得到A液；磷酸氢二钠7.16g；柠檬酸1.92g；用蒸馏水定容至100ml，pH 5.0，得到0.1mol/L的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液100ml，添加邻苯二胺40mg；30％浓度的过氧化氢0.15ml，得到B液，混合所述的A液和B液，得到显色液。
终止液2mol/L硫酸22.2ml；蒸馏水177.8ml。
更详细的技术方案如《具体实施方式
》所述。



序列表SEQ ID NO1是本发明的梅花鹿IFN-γ基因片段的DNA序列。
序列表SEQ ID NO3-4是本发明中扩增梅花鹿IFN-γ基因片段的引物序列。
图1是本发明的总体技术路线图。
图2是本发明所用原核表达载体pET32a(+)图谱。
图3是本发明PCR扩增梅花鹿IFN-γ电泳图谱。图中M、DNA标准DL2000；1、阴性对照；2、RT-PCR产物 图4是本发明制备的SDS-PAGE检测梅鹿IFN-γ蛋白表达形式鉴定图谱。图中M、蛋白分子质量标准；1、CerIFN-γ上清蛋白；2、纯化CerIFN-γ蛋白。
图5是本发明制备的梅花鹿IFN-γ蛋白Western-Blot图。图中1、重组pET32α-CerIFN-γ；2、阴性质对照；M、蛋白标准品。
图6是本发明通过间接ELISA检测检测梅花鹿IFN-γ单克隆抗体(McAb)效价滴度图。
图7是本发明通过间接ELISA检测检测梅花鹿IFN-γ多克隆抗体(PcAb)效价滴度图。
图8是本发明通过间接ELISA检测检测梅花鹿IFN-γ单克隆抗体(McAb)灵敏度滴度图。

具体实施例方式 实施例1目的基因梅花鹿IFN-γ的克隆 1、质粒与宿主菌来源 本实施例所用的pET-32a(+)质粒载体购自Novagen公司。大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞购自湖北省武汉生命技术有限公司。
2、引物设计与合成 根据根据GenBank上发布的梅花鹿IFN-γcDNA序列(GenBank accession NoX63079)设计原核表达引物。引物由上海生工生物技术有限公司合成。
原核表达引物序列如下上游引物5’ATATGGATCCGATCTTATGGCCAGGGCCCA3’(下画线为BamHI位点)；下游引物5’TAATAAGCTTTTACGTTGATGCTCTCCGGCCTCG3’(下画线为HindIII位点)。
3、目的基因的PCR扩增 无菌采取梅花鹿颈静脉血，肝素抗凝，取10mL梅花鹿的全血，加刀豆球蛋白A(英文缩写Con A，购自Sigma公司)60μg/mL于37℃和5％CO2环境下培养24h。提取Con A刺激的外周血白细胞总RNA作为RT-PCR的模板，利用一步法扩增得到梅花鹿IFN-γ成熟肽序列，见序列表SEQ ID NO1所示，序列全长为438bp。
PCR扩增反应体系为10×Taq Buffer 5.0μL，25mmol/L MgCl21.0μl，2mmol/L dNTPs 1.5μL，20μmol/L上、下游引物各1.0μL，Taq DNA聚合酶1.0μL，模板3μL，无菌双蒸水加至50μL。扩增的循环参数95℃预变性5min；然后95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收试剂盒(购自上海生工生物工程技术有限公司，参照该试剂盒说明书)纯化PCR产物。
4、PCR产物回收 采用上海生工生物技术有限公司生产的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA片段，按照该UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒的说明书的提供步骤进行，具体操作如下 用0.8％的琼脂糖胶电泳，使目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，在长波紫外灯下，用在酒精灯火焰上烧过的手术刀片切下含有目的DNA片段的琼脂块，放入1.5mL灭菌离心管中。
按每100mg琼脂糖胶加入400μL Binding Buffer，置50-60℃水浴中10min，使琼脂糖凝胶彻底融化(加热溶胶时，每2min混匀一次)。
将UNIQ-10柱放入收集管中，将融化的胶溶液转移到UNIQ-10柱中，室温静置2min，室温8000r/min离心1min。
取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500μL WashSolution，室温8000r/min离心1min。
再加入500μL Wash Solution，取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，室温12000r/min离心15sec。
将UNIQ-10柱放入一个灭菌的1.5mL离心管中，根据PCR产物量的相对多少，在柱子底部的膜中央加10-20μL Elution Buffer或ddH2O，室温或37℃放置2min室温12000r/min离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。
实施例2、重组质粒pET-32a-IFN-γ的构建 1、载体质粒pET-32a和IFN-γPCR回收产物的连接 通过限制性内切酶BamH I和Hind III(购自宝生物工程(大连)有限公司)分别同时双酶切原核表达载体pET32a和回收得到的IFN-γPCR产物，酶切产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收试剂盒纯化酶切产物。将纯化的酶切产物用T4DNA Ligase(购自Fermentas公司)进行粘末端连接，16℃水浴连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
2、连接产物的转化 取感受态细胞DH5α100μL加入到灭菌1.5mL EP管中，将连接后的中间质粒pET-32a-IFN-γ各10μL加入并混匀。置冰上30min后，42℃热激90sec，冰浴3-5min。加入400μL LB液体培养基(每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，用10mol/L NaOH调pH至7.5，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。在每100毫升LB液体培养基中加入1.5g琼脂粉即为固体LB培养基，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用)，于37℃恒温摇床200r/min振荡培养45min使其复苏。复苏后的重组大肠杆菌悬液于4℃5000r/min离心10min，弃去400μL上清，用剩余的100μL重悬沉淀涂布于含有25μg/mL卡那霉素(购自Invitrogen公司)的LB琼脂平板。37℃增殖1h，再将平板翻过来，倒置37℃培养14-16h至菌落出现。
3、质粒的提取 使用碱裂解法(参照萨姆布鲁克.J，弗里奇.E.F，曼尼阿蒂斯.T主编，分子克隆实验指南，黄培唐等译，第三版，科学出版社，北京，2002版的方法)进行，具体操作如下 用灭菌牙签在LB平板上随机挑取数个单菌落，分别接种于3mL 25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃恒温摇床200r/min振荡培养过夜。
将菌液转入1.5mL离心管内，于4℃8000r/min离心3min，弃上清，再将剩余的1.5mL菌液重复离心，倒立离心管于吸水纸上，使液体流尽。
加入100μL冰预冷的溶液I(0.05mol/L葡萄糖，0.025mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.01mol/L EDTA)，涡旋使菌体充分悬浮，再加入200μL新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS，现配现用)，反复颠倒离心管数次，冰浴5min，最后加入150μL冰预冷的溶液III(5mol/L乙酸钠60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL，pH5.0)，温和颠倒离心管数次，冰浴10min。
于4℃以12000r/min离心10min，吸取上清至另一支1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混和均匀，室温静置5min。
室温12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用75％冷乙醇漂洗后，真空干燥或自然干燥。
沉淀用200μL含20μL Rnase(20μg/mL)的TE(pH8.0)溶解，56℃水浴30min或37℃水浴1h以除去RNA。
加7.5mol/L NH4Ac 100μL，室温静置5min，再于室温12000r/min离心5min。
吸取上清到另一1.5mL的EP管中，加入2倍体积的冷无水乙醇，冰浴置10min。
于4℃12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用75％冷乙醇漂洗后，真空干燥后溶于20μL ddH2O或TE(1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-Cl，pH8.0)，置-20℃冰箱保存备用。
4、重组质粒pET-32a-IFN-γ的酶切鉴定 利用限制性内切酶BamH I和Hind III分别进行单酶切和双酶切中间质粒pET-32a-IFN-γ，酶切后出现预期大小的外源片段和载体片断，将包含该中间质粒的大肠杆菌DH5α菌液送上海生工生物技术工程有限公司测序，测序结果与Genbank(序列登录号X63079)中公布的梅花鹿IFN-γ的序列比对，结果符合率100％，说明该发明中构建的重组质粒构建成功，可以用于大肠杆菌中表达。
实施例3、目的融合基因在大肠杆菌中的表达及纯化 1、目的基因的诱导表达 将包含有重组表达载体的大肠杆菌菌株DH5α接种于含有25μg/mL卡那霉素的3mL LB液体培养基，于37℃摇床培养至OD600达到0.6-0.8。从培养好的菌液中取100μL接种于10mL含有25μg/mL卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，于37℃振荡培养约3h，至OD600达到0.6-0.8，加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG，购自Invitrogen公司)至终浓度为0.8mmol/L，继续培养3h后收集菌体。
2、表达产物的SDS-PAGE电泳分析 2.1SDS-PAGE电泳样品的制备 将诱导后的重组大肠杆菌8000r/min离心15min。沉淀用1/10体积的50mM Tris-HCl(pH8.0)重悬，冰浴30min。冰浴条件下进行超声碎破，直至菌液不再粘稠，10000r/min，离心30min。分别取少量裂解后的上清和沉淀，加入2×蛋白电泳上样缓冲液(100mmol/L Tris-HCl(pH6.8)，200mmol/L二硫苏糖醇(DTT，购自Amresco公司)，4％SDS(电泳级)，0.2％溴酚蓝，20％甘油)125μL，振荡混匀，100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取上清进行SDS-PAGE电泳分析。
2.2SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制及电泳 15％分离胶配制纯化水1.6mL，30％丙烯酰胺溶液2.0mL，1.5mol/L Tris-Base溶液(pH8.8)1.3mL，10％SDS 0.05mL，10％过硫酸铵0.05mL，TEMED 0.003mL；各成分加入后迅速混合，加入制胶板中，上面加异丁醇。
5％浓缩胶配制纯化水2.1mL，30％丙烯酰胺溶液0.5mL，1.0mol/L Tris-Base溶液(pH6.8)0.38mL，10％SDS 0.03mL，10％过硫酸铵0.03mL，TEMED 0.003mL；各成分加入后迅速混合，加入制胶板的分离胶的上面，灌满后插入加样梳。待积层胶凝固后，取下梳子；将凝胶固定于电泳装置上，加入足够量的Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入各样品；电泳电压80V，待溴酚蓝至分离胶界面时，电压改为120V，至溴酚蓝泳出胶底面，终止电泳。
2.3聚丙烯酰胺凝胶染色与脱色 卸下凝胶，用考马斯亮蓝R250染色液(45％甲醇，45％纯化水，10％冰乙酸，0.25％的考马斯亮蓝R250)染色4h以上，再用脱色液(45％甲醇，45％纯化水，10％冰乙酸)进行脱色至背景色完全脱去，观察结果。确定目的蛋白是可溶性表达还是以包涵体的形式表达。
2.4重组蛋白的纯化 将收集的重组蛋白表达菌BL/pET-32a-IFN-γ用购自Novagen公司的试剂盒自带的缓冲液重悬，超声波破碎，4℃12000g离心15min取上清上样。使用Ni-NTA His·Band层析柱(购自Novagen公司)纯化目的蛋白。分别使用结合Binding buffer和洗涤缓冲液Washing buffer(20mM Tris-HCl pH7.9，15mMImidazole，0.5M NaCl)洗柱直至OD值达到基线附近，换用洗脱缓冲液Elute buffer(20mM Tris-HCl pH7.9，40mM Imidazole，0.5M NaCl)洗脱结合的重组蛋白，收集波峰部分蛋白作为纯化的重组蛋白用于进一步分析。
3、目的蛋白表达最佳条件的确定 根据上述步骤2(即表达产物的SDS-PAGE电泳分析)的方法，检测表明本发明制备的重组融合蛋白IFN-γ为可溶性表达。重新复苏保存的转化有pET-32a-IFN-γ的大肠杆菌BL21(DE3)菌液，37℃摇床培养至OD600达到0.6-0.8时，按照IPTG浓度分别为0.4mM、0.8mM和1.0mM，和分别于诱导前和诱导后3h、4h、5h取样，SDS-PAGE分析。
确定IFN-γ蛋白的最佳表达条件为IPTG 0.8mmol/L，37℃诱导3h表达量最高。
4、重组蛋白纯化最佳条件的确定 为摸索Wash Buffer中最佳的咪唑浓度，将Wash Buffer中咪唑浓度按终浓度30mM、40mM、50mM三个梯度稀释，将细菌破碎后离心得到的上清上柱后、加Binding Buffer后、依次加三个浓度Wash Buffer后分别接收样品，SDS-PAGE分析。
确定IFN-γ蛋白纯化的最佳Wash Buffer咪唑浓度为30mM。
实施例4重组蛋白IFN-γ单/多克隆抗体的制备 1、用重组蛋白IFN-γ免疫小鼠和大白兔 本实施例所用的Balb/C小鼠和日本长耳大白兔均购自湖北省预防疾病控制中心，4-6周龄的雌性Balb/C小鼠6只，按200μg/只皮下多点接种纯化的重组IFN-γ，首免等量福氏完全佐剂重组抗原，2周后加强免疫等量福氏不完全佐剂抗原，2周后再次皮下注射无佐剂的等量抗原。至少间隔1个月后，在融合前的第3天，选择抗体滴度高的Balb/C小鼠，按500μg/只抗原剂量每天进行腹腔注射，连续免疫3天后，对小鼠进行尾静脉采血，间接ELISA检测血清抗CerIFN-γ抗体的效价。
同时，将纯化的CerIFN-γ按以上程序免疫三只2.0kg以上体重的雌性日本长耳大白兔，抗原免疫剂量为700μg/只，三免后通过间接ELISA测定血清抗体效价，抗体滴度达到要求后放血，利用饱和硫酸铵法纯化高免血清。
2、梅花鹿IFN-γ细胞融合 2.1SP2/0骨髓瘤细胞的活化 本实施例所用的骨髓瘤(SP2/0)细胞购自中国兽药监察所，将复苏的SP2/0细胞，收集起来用0.5mLRPMI-1640基础液悬浮(0.5～1×106)注射Balb/C小鼠背部皮下。待9～10d实体瘤生长后，视大小选择取瘤细胞的时间。
2.2细胞融合 分别取免疫小鼠脾脏细胞和活化的SP2/0骨髓瘤细胞，在融合剂的作用下将二者融合，同时制备饲养细胞，以辅助杂交瘤细胞的生长，方法简述如下(史良如，1984) 2.2.1SP2/0瘤细胞的制备 若是细胞瓶中培养，直接用RPMI-1640基础液洗下，离心收集即可。从小鼠瘤子中制备的方法如下小鼠断颈处死，75％酒精浸泡5mim，超净台无菌状态取瘤，先将肿瘤块剪下，放于一无菌；平皿中，先将共剪成几小块，再移至匀浆器中，加5mL RPMI-1640基础液充分研磨后，补加10mL RPMI-1640液，静置2min，待较大的组织团块沉于管底后，吸取上层的细胞悬液于另一离心管备用，再补加10mL RPMI-1640液，重复一次，将取出的细胞悬液体积控制在30mL。于另一50mL离心管中加入15mL淋巴细胞分离液，将细胞悬液轻轻地加在分离液之上(比例为1∶2到1∶1)，1800～2000r/m 20min，用吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，用RPMI-1640液洗2遍，计数后备用。
2.2.2免疫脾细胞的制备 (1)取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。
(2)将消毒好的老鼠固定于解剖板上，前肢固定，后肢交叉(左后肢在上)固定，用镊子夹住下腹部皮肤，剪一小口，撕开皮露出腹膜，换一套镊子和剪刀，剪开腹膜，暴露出脾脏，再换一套器械，用镊子夹住脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织，剪破脾脏外膜，放入灭菌的匀浆器中。
(3)加3mL RPMI-RPMI-1640基础液于匀浆器中，研磨(不要太剧烈，以免损伤脾细胞，可选用比较松的匀浆器)，挤压出脾细胞，取出匀浆棒，补加7mL RPMI-1640基础液，静置2min，吸取上层细胞悬液于另一无菌的50mL离心管，再补加10mL RPMI-1640液于匀浆器中，同上重复2次。
(4)1000r/m离心10min去上清，细胞重悬后计数。
2.2.3饲养细胞的制备 (1)取一只未免疫的Balb/C鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。
(2)四肢固定后，先撕开皮，露出腹膜，在腹膜上剪一小口(在腹部中央)，然后用吸管3mL RPMI-1640液注入小鼠腹腔，吸打几次，再将液体吸出放于一50mL离心管，再重复一次，此为腹腔巨噬细胞。
(3)同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。
(4)1000r/m离心10min去上清，细胞重悬后计数。
2.2.4细胞融合 (1)先将饲养细胞离心1000rpm，5min去掉上清，于37℃放置备用。
(2)将1-2×107个SP2/0与108个免疫细胞(1∶10-1∶15)于50mL离心管中混匀，1500r/m，离心10min。
(3)倒空上清(可用灭菌的滤纸吸干)，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动。
(4)将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的50％PEG 0.8mL，边加边轻轻用吸管尖搅拌1min。
(5)然后慢慢加入37℃预温的RPMI-1640基础液10mL。具体方法为第一分钟逐滴滴入1mL。第二分钟加1mL，第3-4分钟加3mL，第5分钟加其余的5mL，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后加入30mL RPMI-1640液，也需慢慢加入。
(6)8000r/m离心5min，去上清于37℃放置5-8min。
(7)用HAT培养基悬浮，同时也用HAT培养基悬浮饲养脾细胞与融合后的细胞混合，根据需要补加适量HAT培养基，分种于96孔培养板，约250μL/孔。一次融合可接种4-8块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含104左右个SP2/0细胞。
(8)于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(9)融合后第二天开始观察，有无污染，于第4天补加1滴HAT培养基，第8-10天吸去100μL培养基换HT培养基100μL。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。
2.2.5间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清，筛选阳性杂交瘤细胞 于测定前一天4℃包被过夜(gG50ng/孔)，洗涤液洗三次拍干，37℃封闭1h，洗涤液洗三次拍干，加入杂交瘤细胞培养上清，于37℃温育1h，洗涤液洗三次拍干，加入1∶10000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃温育45mins，洗涤5次，加入TMB底物100μL，避光显色10min，最后加入50μL终止液终止反应，用酶标仪在630nm波长下测定OD值，同时设SP2/0细胞的培养上清作为阴性对照，OD630大于阴性对照2倍的样品为阳性。
2.2.6杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法) (1)克隆前或者前一天制备小鼠饲养细胞层。
(2)将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，血细胞计数板计数活细胞数。
(3)将细胞用完全培养基稀释到5、10、50个细胞/毫升。
(4)将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的96孔培养板，100μL/孔，使相应的每孔分别含0.5、1和5个细胞。
(5)培养第4天换液一次，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录。
(6)特异性抗体的检测在克隆后第7-9天，细胞克隆长满1/3-1/2个视野时，即可检测，如检出细胞生长孔有特异性抗体，可选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的细胞孔，继续同法再克隆或扩大培养。
(7)阳性孔的细胞可移至24孔培养板，并在原孔中补加另一批培养基，以防二者同时污染或细胞死亡。待24孔板中的细胞生长良好时，可转种至小方瓶中，并冻存2支以上的细胞。
实施例5梅花鹿IFN-γ单克隆抗体的鉴定 1、杂交瘤细胞染色体数的检测 在细胞传代培养48h后加入秋水仙胺，使其最终浓度达到0.04μg/mL，继续培养2-2.5h。终止培养后，将贴壁的细胞全部用吸管吹下，移入10mL的离心管，以1000r/m离心10min，弃去上清液。加入37℃预温的0.075mol/L的氯化钾低渗溶液5mL，用吸管吹打均匀，置37℃水浴15-20min。每管加入新鲜配制的固定液(甲醇∶冰乙酸＝3∶1)1mL混匀，以1000r/m离心10min，去上清。再每管加固定液5mL，轻轻混匀，静止30min后，以1000r/m离心10min，弃上清。再次固定，加固定液5mL，轻轻混匀静止30min，以1000r/m离心10min，弃上清，用同样方法加固定液5mL打匀，封上管口于4℃静止过夜。轻轻吸去上清液，留下0.5mL左右的上清液，混匀使细胞悬浮，用滴管吸取细胞悬液2-3滴，滴在已用冰水浸泡的洁净的载玻片上，立即吹散，并在火焰上通过几次，促使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。以10％Giemsa染液染色10min，洗去洗液自然干燥。最后于显微镜下观察计数(章谷生，容秉培，1987)。
2、单克隆抗体的生产和效价测定 建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液，用间接ELISA测定效价。也可在小鼠体内诱生小鼠腹水生产单克隆抗体，取8-10周龄的小鼠，腹腔注射灭菌的液体石蜡0.5mL/只，7-10天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105/只，7-10天后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存。
3、Western-blot分析单克隆抗体的特异性 将上述纯化的重组融合蛋白IFN-γ进行SDS-PAGE电泳。
转移切出6张Whatman 3M滤纸和1张硝酸纤维膜(NC膜)，滤纸和膜的大小要和凝胶的大小完全相等或略小于凝胶，用铅笔在滤膜一角作标记，确保转印后膜与凝胶的相对方向；将硝酸纤维膜在纯化水中浸泡5min；在另一浅托盘中加入少量转移缓冲液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris碱，0.037％ SDS(电泳级)，20％甲醇)，将6张Whatman 3M滤纸浸泡于其中。然后按照如下方法安装转移电泳槽平放石墨电极的底座(负极)，依次放3层3M滤纸、聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维膜和3层3M滤纸。彻底排除各层间的气泡；将转移电泳槽的上盖扣到石墨电极-转移膜胶复合体上；连接电源，根据凝胶板面积按照0.65-1.0mA/cm2的参数接通电流，电泳转移0.5-2h。
将NC膜置于含1％BSA和5％的脱脂奶粉的1×TBST(10mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，0.05％Tween-20，pH8.0)中，室温封闭过夜或至少30min； 洗膜弃封闭液，用1×TBST洗涤NC膜3遍，每次5min； 一抗孵育将NC膜放入用1×TBST稀释的梅花鹿IFN-γ单克隆抗体(体积比为1∶3000)，37℃孵育1h； 洗膜取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次10min； 二抗孵育将膜转入1×TBST稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗牛IgG(购自Sigma公司)抗体(体积比为1∶5000)，37℃孵育1h； 洗膜取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次10min； 显色将NC膜置于新配置的DAB显色液中，置暗处显色，待蛋白带的颜色深度达到要求后，用1×TBST冲洗以终止反应。
结果表明，梅花鹿IFN-γ单克隆抗体表现出很高的特异性，而阴性对照组(pET32a(+)载体表达菌)没有出现反应。
实施例6梅花鹿IFN-γ双抗体夹心ELISA方法的建成立 1.梅花鹿IFN-γ单克隆抗体敏感度的测定 利用双抗体夹心ELISA测定梅花鹿IFN-γ单克隆抗体敏感度。用包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)保守值3000倍稀释单克隆抗体，按每孔100μl加入ELISA板孔中，4℃包被过夜。次日用PBST(含0.05％Tween20的PBS，pH7.4)充分洗涤后加入5％脱脂奶粉37℃封闭45min。PBST充分洗涤后，用洗涤液递增稀释抗原(CerIFN-γ标准品)，稀释后为50ng、25.5ng、12.75ng、6.375ng、3.1875ng、1.593ng、0.79ng、0.398ng、0.199ng、0.099ng、0.498ng、0.025ng、0.012ng、0.006ng、0.003ng和0.002ng 12个梯度，37℃孵育1h，重复洗涤。用洗涤液保守值5000倍稀释的兔抗CerIFN-γ多克隆抗体，每孔100μl，37℃孵育45min后充分洗涤。加1∶5000稀释的HRP-羊抗兔IgG，每孔100μl，37℃30min，充分洗涤后每孔100μlTMB/H2O2底物液，室温避光反应10min后，每孔加入50μl终止液(0.25％氢氟酸)终止反应，读取波长630nm的光密度值(OD)。
2.梅花鹿IFN-γ单/多克隆抗体最佳工作浓度的确定 利用方阵间接滴定确定最佳最佳工作浓度确定。用梅花鹿IFN-γ作为抗原，分别以50ng、25.5ng、12.75ng、6.375ng、3.1875ng、1.593ng、0.79ng、0.398ng、0.199ng、0.099ng、0.498ng、0.025ng、0.012ng、0.006ng、0.003ng和0.002ng 12个梯度按每孔100μL包被96孔ELISA板，4℃包被过夜。次日用PBST充分洗涤后加入5％脱脂奶粉37℃封闭30min。用洗涤液200、400、800、1600、3200、6400、12800和25600倍8个梯度稀释的CerIFN-γ单克隆抗体(或用洗涤液400、800、1600、3200、6400、12800、25600和51200倍8个梯度稀释的CerIFN-γ多克隆抗体)，每孔100μL，37℃孵育30min后充分洗涤。加1∶5000稀释的HRP-羊抗鼠IgG(或HRP-羊抗兔IgG)，每孔100μl，37℃30min，充分洗涤后每孔100μL TMB/H2O2底物液，室温避光反应10min后，每孔加入50μL终止液(0.25％氢氟酸)终止反应，读取波长630nm的光密度值(OD) 3.梅花鹿IFN-γ体外特异性释放 抽取梅花鹿颈静脉血，肝素抗凝。将全血按1.5ml/孔分别加入24孔细胞培养板的三个孔中，其中阳性对照含有60μg刀豆球蛋白A(Con A)，检测孔80μg结核菌特异性蛋白Rv3872-CFP10-ESAT6融合蛋白，空白对照孔含50μ基础1640培养液。轻微振荡培养板，使各孔试剂与血液充分混合，于含5％CO2的细胞培养箱中37℃培养16-24h。次日收集培养上清液，夹心ELISA检测IFN-γ浓度。
4.梅花鹿IFN-γ检测夹心ELISA的建立 用包被液适当稀释单克隆抗体，按每孔100μl加入ELISA板孔中，4℃包被过夜。次日用PBST充分洗涤后加入5％脱脂奶粉37℃封闭45min。PBST充分洗涤后，每孔100μl上述三种上清液，37℃孵育1h，重复洗涤。用洗涤液适当稀释的兔抗CerIFN-γ多克隆抗体，每孔100μl，37℃孵育45min后充分洗涤。加1∶5000稀释的HRP-羊抗兔IgG，每孔100μl，37℃30min，充分洗涤后每孔100μlTMB/H2O2底物液，室温避光反应10min后，每孔加入50μl终止液(0.25％氢氟酸)终止反应，读取波长630nm的光密度值(OD)。
实施例7梅花鹿IFN-γ检测结核病检测法的应用 1.样品的处理 取120份抗凝梅花鹿鹿血样品，按1.5ml/孔分别加入24孔细胞培养板的三个孔中，其中阳性对照含有60μg刀豆球蛋白A(购自Sigma公司)，检测孔80μg保藏号为CCTCC NOM208244(专利申请号为2009100609131，专利公开号为CN101538578A)牛结核特异性三基因融合抗原蛋白RCE，空白对照孔含有50μ基础1640培养液(配方见附录1)。轻微振荡培养板，使各孔试剂与血液充分混合，于含5％CO2的细胞培养箱中37℃培养16-24h，次日收集培养上清液。
2.用商品化ELISA试剂盒检测上述样品(对照试验1) 本实施例所用的商品化ELISA试剂盒购自武汉科前动物生物制品有限责任公司。方法如下使用保藏号为CCTCC NOM208244(专利申请号为2009100609131，专利公开号为CN101538578A)牛结核特异性三基因融合抗原蛋白RCE，于4℃过夜包被酶标板，洗涤液洗涤3次，用洗涤液稀释的5％脱脂奶粉37℃封闭1h，洗涤液洗板3次后加入1∶100(体积比)倍稀释血清，100μL/孔，每孔重复3次，37℃反应30min。洗板3次后加入体积比为1∶10000(体积比)稀释的羊抗牛IgG，37℃反应30min。洗板5次后加入100μL底物液(含1mg/mL TMB和0.03％H2O2)，避光显色10min后加入0.25％HF终止反应，于OD630读数。(结果表1) 3.用商品化试纸条检测上述样品(对照试验2) 本实施例所用的商品化试纸条购自韩国动物遗传公司(公司的英文名称Animal Genetices，Inc，商品名称为Anigen Rapid Bovine TB Ab Test Kit)。按照试纸条的说明书操作将上述待检梅花鹿的血样取100μL加入试纸条检测孔中，10min后观察结果(结果表2)。
4.用本发明的梅花鹿γ-干扰素双抗体夹心ELISA方法检测 具体方法如下用包被液(见附录2)按照50ng/孔稀释单克隆抗体，按每孔100μl加入ELISA酶标板孔中，4℃包被过夜。次日用冲洗液(见附录2)充分洗涤后加入5％脱脂奶粉37℃封闭45min。用冲洗液充分洗涤后，每孔100μl上述三种上清液(待检血样)，37℃孵育1h，重复洗涤。用冲洗液(50ng/孔)稀释的兔抗梅花鹿γ-干扰素多克隆抗体，每孔100μl，37℃孵育45min后充分洗涤。加1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，每孔100μl，37℃30min，充分洗涤后每孔100μl显色液，室温避光反应10min后，每孔加入50μl终止液(见附录3)终止反应，在酶联免疫检测仪上于630nm波长处测定吸光度值。
表1120份待测样品检测结果
表2120份待测样品检测结果
5.结果的判定 当阳性与阴性对照孔的OD值差≥0.25，特异性抗原(RCE)与阴性对照孔的OD值差≥0.1时，判断为结核病阳性； 当阳性与阴性对照孔的OD值差≥0.25，特异性抗原(RCE)与阴性对照孔的OD值差＜0.1时，判断为结核病阴性； 当阳性与阴性对照孔的OD值差＜0.25，特异性抗原(RCE)与阴性对照孔的OD值差＜0.1时，结果无法确定。
附录1 1、RPMI1640基础培养液的配制 (1)量取去离子水950ml，置于一定的容器中； (2)将RPMI1640粉剂(购自上海碧云天生物技术有限公司)10g加于15℃-30℃的去离子水中，边加边搅拌，得到培养液； (3)向步骤(2)的培养液中按1000ml培养液加2g碳酸氢钠； (4)加水至1000ml，用CO2将培养液pH值调至pH6.5-6.8，在过滤之前应盖紧容器瓶塞； (5)立即用孔径为0.22μm的微孔滤膜正压过滤除菌，4℃冰箱保存备用。
附录2 (1)冲洗液氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠0.2g，磷酸二氢钾2.9g，吐温-200.5ml，用蒸馏水定容至1000ml，pH7.4。
(2)包被液碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，用蒸馏水定容至1000ml。
(3)封闭液冲洗液100ml，脱脂牛奶10g。
附录3 显色液的配制 显色A液的配制磷酸氢二钠71.6g，柠檬酸19.2g，用蒸馏水定容至1000ml。
显色B液的配制0.1mol/L pH5.0的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液100ml(磷酸氢二钠7.16g，柠檬酸1.92g，用蒸馏水定容至100ml)，邻苯二胺40mg，30％浓度的过氧化氢0.15ml。
终止液2mol/L硫酸22.2ml，蒸馏水177.8ml。
说明本发明所述的“梅花鹿γ-干扰素”与生物材料样品保藏证明中命名的“梅花鹿干扰素-γ”为同一种生物材料样品，本说明书将生物材料样品命名的“梅花鹿干扰素-γ”修改为“梅花鹿γ-干扰素”更适合中文的表述习惯。
序列表
<110>华中农业大学
<120>梅花鹿γ-干扰素双抗体夹心ELISA检测方法及试剂盒与应用
<130>
<141>2010-01-28
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>438
<212>DNA
<213>梅花鹿(Cervus nippon)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(438)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(438)
<223>
<400>1
tct tat ggc cag ggc cca ttt ttt aaa gaa ata gaa aac tta aag gag 48
Ser Tyr Gly Gln Gly Pro Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys Glu
1 5 10 15
tat ttt aat gca agt aac cca gat gta gct gag ggt ggg cct ctt ttc 96
Tyr Phe Asn Ala Ser Asn Pro Asp Val Ala Glu Gly Gly Pro Leu Phe
20 25 30
ata gaa att ttg aag aat tgg aaa gag gag agt gac aga aaa att att144
Ile Glu Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Ile
35 40 45
cag agc caa att gtc tcc ttc tac ttc aaa ctc ttt gaa aac ttc aaa192
Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Glu Asn Phe Lys
50 55 60
gat aac cag gtc att cag agg agc gtg gat atc atc aag caa gac atg240
Asp Asn Gln Val Ile Gln Arg Ser Val Asp Ile Ile Lys Gln Asp Met
65 70 75 80
ttt cag aag ttc ttg aat ggc agc tct gag aaa ctg gag gac ttc aaa288
Phe Gln Lys Phe Leu Asn Gly Ser Ser Glu Lys Leu Glu Asp Phe Lys
85 90 95
aag ctg att caa att tcg gtg gat gat atg cag atc cag cgc aaa gcc336
Lys Leu Ile Gln Ile Ser Val Asp Asp Met Gln Ile Gln Arg Lys Ala
100 105 110
ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gac ctg tcg cca aaa tct aac384
Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ser Asn
115 120 125
ctc ata aag cgg aag aga agt cag aat ctc ttt cga ggc cgg aga gca432
Leu Ile Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala
130 135 140
tca atg438
Ser Met
145
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<212>PRT
<213>梅花鹿(Cervus nippon)
<400>2
Ser Tyr Gly Gln Gly Pro Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys Glu
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Tyr Phe Asn Ala Ser Asn Pro Asp Val Ala Glu Gly Gly Pro Leu Phe
20 25 30
Ile Glu Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Ile
35 40 45
Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Glu Asn Phe Lys
50 55 60
Asp Asn Gln Val Ile Gln Arg Ser Val Asp Ile Ile Lys Gln Asp Met
65 70 75 80
Phe Gln Lys Phe Leu Asn Gly Ser Ser Glu Lys Leu Glu Asp Phe Lys
85 90 95
Lys Leu Ile Gln Ile Ser Val Asp Asp Met Gln Ile Gln Arg Lys Ala
100 105 110
Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ser Asn
115 120 125
Leu Ile Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala
130 135 140
Ser Met
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<213>梅花鹿(Cervus nippon)
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atatggatcc gatcttatgg ccagggccca 30
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<212>DNA
<213>梅花鹿(Cervus nippon)
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(34)
<223>
<400>4
taataagctt ttacgttgat gctctccggc ctcg 3权利要求
1.一株能够稳定分泌梅花鹿γ-干扰素单克隆抗体的细胞株CerIFN-γ4C，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOC200966。
2.一种由权利要求1所述细胞株分泌的梅花鹿γ-干扰素的特异性单克隆抗体。
3.一种梅花鹿γ-干扰素的双抗体夹心ELISA检测方法，其步骤包括
(1)用包被液将保藏号为CCTCC NOC200966梅花鹿γ-干扰素单克隆抗体按50ng/孔的量加入酶标板孔内，每孔100μl，37℃作用1h后置4℃冰箱过夜；
(2)弃去孔内液体，用冲洗液洗酶标板3次，每次3min，用吸水纸拍干；
(3)在各酶标板孔的孔中加入封闭液100μl，37℃作用1h，按步骤(2)的方法洗涤；
(4)将诱导的待测的梅花鹿全血培养上清，加入包被有梅花鹿γ-干扰素单克隆抗体的ELISA板孔中，每孔100μl；同时将收集的阴性和阳性对照培养上清分加加入孔中，37℃作用1h，重复步骤(2)的方法洗涤；
(5)用冲洗液将兔抗梅花鹿γ-干扰素多克隆抗体按照50ng/孔的量加入100μl，37℃作用1h，重复步骤(2)的方法洗涤；
(6)用冲洗液将辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG按体积比为1∶5000稀释，每孔加入100μl，37℃作用1h，重复步骤(2)的方法洗涤；
(7)在酶标板孔的每孔中加入显色液100μl，室温避光显色10min；
(8)在酶标板孔的每孔中加入50μl终止液使其终止反应；
(9)在酶联免疫检测仪上于630nm波长处测定步骤(8)酶标板孔混合溶液的吸光度值；
其中
步骤(1)所述的包被液配制如下
碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，用蒸馏水定容至1000ml；
步骤(2)所述的冲洗液配制如下氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠0.2g，磷酸二氢钾2.9g，吐温-20 0.5ml，用蒸馏水定容至1000ml，pH7.4；
步骤(3)所述的封闭液配制如下冲洗液100ml，脱脂牛奶10g；
步骤(7)所述的显色液配制如下磷酸氢二钠7.16g，柠檬酸1.92g，用蒸馏水定容至100ml，得到显色液A；磷酸氢二钠7.16g，柠檬酸1.92g，用蒸馏水定容至100ml，调pH至5.0，得到0.1mol/L的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液100ml，再添加邻苯二胺40mg，30％浓度的过氧化氢0.15ml，得到显色液B，混合所述的显色液A和显色液B，得到显色液；
步骤(8)所述的终止液配制如下2mol/L的硫酸22.2ml，蒸馏水177.8ml。
4.一种梅花鹿γ-干扰素的双抗体夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括保藏编号为CCTCC NOC200966的梅花鹿γ-干扰素单克隆抗体，梅花鹿γ-干扰素多克隆抗体，保藏号为CCTCC NOM208244的牛结核特异性三基因融合抗原蛋白RCE，辣根过氧化物标记羊抗兔IgG，显色液和终止液，
其中所述的显色液和终止液配制方法如下
显色液磷酸氢二钠7.16g；柠檬酸1.92g；补足蒸馏水至100ml，得到A液；磷酸氢二钠7.16g；柠檬酸1.92g；补足蒸馏水至100ml，pH 5.0，得到0.1mol/L的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液100ml，添加邻苯二胺40mg；30％浓度的过氧化氢0.15ml，得到B液，混合所述的A液和B液，得到显色液。
终止液2mol/L硫酸(H2SO4)22.2ml；蒸馏水177.8ml。
5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备梅花鹿γ-干扰素检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明属于农业微生物基因工程和动物传染病领域。涉及一种梅花鹿γ-干扰素双夹心ELISA检测方法及试剂盒与应用。获得一株能稳定分泌梅花鹿γ-干扰素单克隆抗体的细胞株CerIFN-γ4C，其保藏号为CCTCC NOC200966。本发明还建立了梅花鹿γ-干扰素双夹心ELISA检测方法，核心是，构建梅花鹿γ-干扰素的单克隆抗体，制备梅花鹿γ-干扰素多克隆抗体等。本发明的试剂盒包含梅花鹿γ-干扰素的单克隆抗体，梅花鹿γ-干扰素的多克隆抗体，牛结核特异性三基因融合抗原蛋白RCE及其他试剂。本发明还公开了所述检测方法和试剂盒的应用。本发明特异性强、灵敏度高、操作简便和诊断快速。
文档编号G01N33/535GK101788563SQ20101010457
公开日2010年7月28日 申请日期2010年2月3日 优先权日2010年2月3日
发明者郭爱珍, 刘颖, 张广智, 廖娟红, 刘冬光, 于清龙, 王冰, 邹新峰, 熊家军, 杨利国, 陈焕春 申请人:华中农业大学