专利名称：利用单抗检测莱克多巴胺残留的间接化学发光酶联免疫试剂盒的制作方法
利用单抗检测莱克多巴胺残留的间接化学发光酶联免疫试
剂盒
技术领域：
本发明涉及一种酶联免疫试剂盒，尤其涉及一种莱克多巴胺的化学发光酶联免疫 检测试剂盒。
背景技术：
莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)是一种苯乙醇胺类β 2_肾上腺素受体激动剂，可 选择性激动平滑肌的β 2受体，临床上主要用于治疗支气管哮喘，充血性心力衰减症和肌肉
萎缩症等，莱克多巴胺的结构式如下有研究表明，动物日粮中莱克多巴胺的添加量为临床治疗量的5-10倍时，动物体 内的营养成分由脂肪向肌肉转移，表现出营养再分配效应，进而调控动物体营养代谢路径， 增强脂肪分解代谢，促进蛋白质合成，显著增加胴体瘦肉率，提高饲料报酬率，对猪的效应 尤为明显。由于莱克多巴胺在动物脏器中残留，并通过食物链进入人体，人体累计摄入超过 一定值或食用了高残留的内脏组织，易出现副作用。表现为骨骼肌收缩增加，破坏快缩肌纤 维与慢缩肌纤维间的融合，引发肌肉震颤，四肢和面部肌肉尤为明显等症状。其他中毒症状 包括心动过速、心率失常、腹痛、肌肉疼痛、恶心和眩晕等。除美国FDA外，世界各国均禁止 将莱克多巴胺用于生猪生产，尤其近年来，随着我国政府对非法使用克伦特罗打击力度的 加大，莱克多巴胺的非法使用日趋严重。莱克多巴胺残留传统的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)，微生物法，气/质联 用分析法(GC-MS)，液/质联用分析法(LC-MS)等。虽然这些方法测定结果很精确，但由于 存在需要昂贵的仪器设备、熟练的专业人员、烦琐费时、周期长、费用高、不能现场操作等缺 陷，不能满足实际检测工作的需求。ELISA酶联免疫技术具有敏感、特异、快速、简便的特点， 近年来已被应用于莱克多巴胺残留检测，Haasnootet等建立了阻断ELISA方法，Shelver等 建立了间接竞争ELISA方法，国内于洪侠等对莱克多巴胺多克隆抗体、曲勅等对莱克多巴 胺单克隆抗体进行了研究，但有关化学发光酶联免疫(CL-ELISA)检测方法的建立尚未见 报道。

发明内容本发明的目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种利用单抗检测莱克多巴 胺残留的间接化学发光酶联免疫试剂盒。该试剂盒具有检测灵敏度高、应用灵活、方便的特
3点ο本发明提供的利用单抗检测莱克多巴胺残留的间接化学发光酶联免疫试剂盒，包 括盒体，设在盒体内的酶标板和试剂；该试剂盒由下列试剂组成A、各孔包被有包被抗原即莱克多巴胺与载体蛋白的偶联物的酶标板1块；B、莱克多巴胺标准溶液浓度分别为 0. 01ng/mL、0. 05ng/mL、0. lng/mL、0. 2ng/ mL、0. 5ng/mL、0. 8ng/mL、lng/mL、2ng/mL、5ng/mL 各一瓶； C、酶标羊抗鼠抗体溶液辣根过氧化酶-羊抗鼠IgG原液，使用时用洗涤溶液配制 成1 2000的工作浓度；D、莱克多巴胺抗体溶液人工免疫抗原免疫动物制得的单克隆抗体，使用时用洗 涤溶液稀释成1 8000的工作浓度；E、发光溶液0. OlM鲁米诺、pH = 8.8的0. OOlM对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲 烷溶液和体积比3/10000的H2O2的混合液；F、洗涤溶液指含有吐温-20体积分数0. 05%的pH = 7. 5,0. lmol/L的磷酸盐缓 冲液；G、包被溶液1. 59g碳酸钠和2. 53g碳酸氢钠溶于IL水中，调节pH为9. 5 ；H、封闭溶液由IOg OVA溶于IL洗涤溶液中，再加入质量比为0.05%的NaN3配制 而成。上述检测莱克多巴胺残留的酶联免疫试剂盒中所述偶联物的载体蛋白为分子量范围是6. 7KDa 6. SKDa的牛血清蛋白。包被酶标板的包被抗原是采用水溶性碳化亚二胺法(EDC)由莱克多巴胺与牛血 清蛋白偶合制成，纯化后的抗原浓度为15mg/ml，优选包被浓度为稀释1 2000。制备抗体 的人工免疫原同样由莱克多巴胺与牛血清蛋白偶合制成。所述酶标羊抗鼠抗体为辣根过氧化酶_羊抗鼠IgG原液，其稀释倍数优选为 1 2000。所述莱克多巴胺抗体是由莱克多巴胺与分子量范围是6. 7KDa 6. SKDa的牛血清 蛋白偶合制成的人工免疫原免疫动物制得的单克隆抗体，其浓度为5.9ng/ml.其工作浓度 优选为稀释1 8000。本发明中包被莱克多巴胺抗原的酶标板的制备步骤(1)微孔板采用RAC-BSA在设定的包被溶液中，以设定的浓度，在4°C中过夜反应 包被或37°C下包被2h。本发明中微孔板中所包被的RAC-OVA在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑 料表面上，可以经受多次洗板，采用的包被蛋白浓度是原浓度稀释2000倍。(2)倾去包被液，洗涤三次，拍干。(3)包被好的微孔板可以用含封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选0VA，需加入 NaN3防止变质。37°C下，封闭1. 5_2h。(4)倾去封闭液，洗涤三次，拍干。待干燥后，用铝膜真空密闭保存。本发明所述酶标羊抗鼠抗体的制备(1)羊抗鼠抗体的制备以鼠源性抗体为免疫原对无病原山羊进行免疫，得到羊 抗鼠抗体°)将得到的羊抗鼠抗体与辣根过氧化物酶，采用过碘酸钠法进行连接。本发明中涉及的酶标羊抗兔抗体溶液优选用洗涤溶液配制的浓度为1 2000。本发明中莱克多巴胺抗体溶液、酶标羊抗鼠抗体溶液浓度是决定本发明中莱克多 巴胺酶联免疫测试试剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。本发明的优点和积极效果本发明应用化学发光与酶联免疫结合，成功的合成了免疫原，得到了莱克多巴胺 的单克隆抗体，建立了一种检测莱克多巴胺残留的新的试剂盒。由于应用的是单克隆抗体 和发光法，化学发光酶联免疫法具有比普通的ELISA更高的灵敏度和特异性。具有灵敏度 高、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。能够 在检测动物性食品(如奶、动物组织、尿样)中莱克多巴胺的残留发挥重要作用。

图1为本发明的莱克多巴胺包被抗原的合成方案。图2为本发明莱克多巴胺抗体的抑制率曲线。图3为本发明的莱克多巴胺工作曲线。
具体实施方式实施例1、检测莱克多巴胺试剂盒的组分及制备过程1、检测莱克多巴胺的化学发光酶联免疫试剂盒的组成A、包被有包被抗原(莱克多巴胺与载体蛋白的偶联物)的固相载体(酶标板)；B、莱克多巴胺标准溶液0. 01ng/mL、0. 05ng/mL、0. Ing/mL、lng/mL、5ng/mL、IOng/
mLoC、酶标羊抗鼠抗体溶液酶标羊抗鼠抗体为辣根过氧化酶-羊抗兔IgG原液，装 入，使用时用洗涤溶液配制成1 2000的工作浓度。D、莱克多巴胺抗体溶液用人工免疫抗原免疫动物制备所得的单克隆抗体，将所 得莱克多巴胺抗体用洗涤溶液稀释成1 8000工作浓度。E、发光溶液使用pH8. 8的0. 0001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液配制 成0. OlM的鲁米诺溶液，再与H2O2按照3 10000的体积比混合。F、洗涤溶液含有体积分数0. 05%吐温-20的pH7. 5,0. lmol/L磷酸盐缓冲液。G、包被溶液1. 59g碳酸钠和2. 53g碳酸氢钠溶于IL水中，调节pH9. 5。H、封闭溶液配制10g卵清蛋白(OVA)溶于IL洗涤溶液中，再加入重量比为 0. 05% 的 NaN3。2、酶标板的制备用包被液将包被抗原稀释1 2000，每孔加入IOOyLdO过夜，倾去包被液，每孔 加入250 μ L洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入封闭液250 μ L，37°C孵育lh，倾去孔内液 体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。3、抗原的合成(1)免疫原的合成IOmg的BSA溶于0. 5mL双蒸水中，用1. Omol/L的氢氧化钠溶液调节pH值到10. 8，
5加入22mol/L的BDE溶液50L，在氮气保护下，室温搅拌反应22h。17mg (50btmol) RAC-HCl 加入到0. 5mL 0. 511101/1的氢氧化钠溶液中，加入5(^1^ DMF助溶。然后在冰浴中将此溶液 缓慢加入到活化的BSA溶液中，氮气保护下室温搅拌反应22h。反应产物于4°C冰箱中用 PBS透析3d，所得偶联物RAC-BSA中加入0. 叠氮钠，_20°C储存备用。(2)包被抗原的合成取1. 36g(2Xl(T5mol)BSA，溶于 30ml 水或常规 I3BS 中，加入 0.3g(100X2X10_5mol)对醛基本甲酸。0_4°C搅拌过夜反应。离心取上清，用PBS透析。 向透析后得上清液中加入0.4g(60X2X I(T5m0I)盐酸莱克多巴胺。搅拌溶解后，加入 0. 115g(30X2X10_5mol)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，4°C搅拌反应4小时。离心，上清透析，加 1 % NaN3置于0 4°C冷藏备用。4、莱克多巴胺单克隆抗体的制备取6 8周龄雌性Balb/C小鼠做免疫组以合成的RAC-BSA免疫抗原(加佐剂) 分别对每组小鼠进行免疫，每次每只的免疫剂量为100 μ g，每次免疫间隔两周，一共免疫4 次。最后用同样剂量的免疫原(不加佐剂)进行强化免疫。根据检测结果挑选效价最高的小鼠进行细胞融合。取小鼠脾细胞，按7 1比例 (数量配比)与SP2/0骨髓细胞融合。根据观察，当融合细胞克隆达1/3 1/2培养孔的 面积，对有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测。用间接ELISA方法进行初步筛选阳性孔。 采用有限稀释法进行阳性杂交瘤的克隆化，将细胞悬液连续稀释至统计上每孔加样仅含单 个细胞，接种到96孔培养板，通过ELISA筛选出单个细胞繁殖形成的阳性杂交瘤细胞克隆。 将24孔板中扩大培养的阳性杂交瘤细胞株，进一步在5mL，IOmL, 50mL培养瓶中逐步扩大培 养。除一部分用于腹水的制备之外，其余细胞冻存备用。取8 10周龄的BALB/c小鼠，以0. 5mL/只的量用液体石蜡注入小鼠腹腔，IOd 于腹腔内注射单克隆杂交瘤细胞株5X IO7个/只。7d后观察小鼠腹水产生情况，待小鼠 腹部明显膨大，抽取腹水。收集的腹水置于离心管中，1500r/min离心30min。取上清，用辛 酸_饱和硫酸铵法对腹水进行纯化，得到单克隆抗体，-20°C保存备用。实施例2、间接CL-ELISA检测方法的建立(1)抗体与包被抗原浓度的优选(方阵)用包被缓冲液溶解的包被抗原镀盘从首行稀释度1/10开始纵向梯度稀释， 100 μ L/孔，37°C孵育2h ；洗盘五次；封闭，300 μ L/孔，0_4°C，过夜；镀抗体从首列1/100 开始横向梯度稀释(见表一)，100yL/孔，37°C孵育2h ；酶标稀释度用1/2000，100 μ L/孔 镀盘37°C，50分钟；加发光底物溶液每孔加入100 μ L的发光底物溶液，3 5分钟后检 测。选出最佳包被和抗体的配比，再用此包被浓度镀盘，抗体横向稀释，酶标纵向稀释，同理 选出抗体和酶标的最佳配比。(2)化学发光ELISA法测莱克多巴胺单克隆抗体的特异性根据上述对抗体及包被抗原浓度的优选实验，申请人选择并确定抗体浓度为 1 8000，包被抗原浓度为1 2000进行抗体的灵敏度的测定包被用0. 05Μ ρΗ9. 6的碳酸盐包被缓冲液将已知包被抗原稀释至一定浓度，在 每个聚苯乙烯板的反应孔中加100 μ L/孔，4°C过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗 3次，300 μ L/孔，每次5分钟。(简称洗涤，下同)。
封闭用PBST+1 % OVA封闭上述已包被的酶标板，250 μ L/孔，室温孵育2 4小 时，然后洗涤。加样加一定稀释的待检样品(抗体和半抗原)100yL/孔于上述已封闭的反应孔 中，置37°C孵育1小时或室温2 4小时，然后洗涤。加酶标抗体加入新鲜稀释的酶标二抗100 μ L/孔。37°C孵育0. 5 1小时或室 温1 2小时，洗涤。加发光底物溶液每孔加入IOOul的发光底物溶液，3 5分钟后检测。测定结果 由阴性对照孔校正。莱克多巴胺自身对抗体的抑制率，计算公式如下抑制率％=加入竞争物的孔的 发光值/不含竞争物的孔的发光值X100%。计算50%抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。实施例3、检测莱克多巴胺的化学发光酶联免疫试剂盒的应用(1)试剂的配制A、样品稀释液将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍后使用。B、洗涤溶液将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍后使用。C、发光溶液0. OlM鲁米诺+0. OOlM对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液 (ρΗ8· 8)+3/10000 (体积比)H2O2。(2)样品前处理Α、尿液收集到的猪尿样品必须是澄清的，若有杂质，4°C离心15min，取上清液。B、动物组织取样品与4mL 0. IM的盐酸混合，并且放在一起用超生波提取20min， 然后IOOOOg离心15min，取上清液用IOM NaOH调pH至9. 5士0. 5，旋涡振荡5min，然后 IOOOOg离心15min。取上清液加5mL异丁醇振荡2min，混合物室温下静止15min，然后3000g 离心lOmin，分出有机相，水相再用异丁醇(每次IOmL)萃取两次，三次萃取的有机相合并在 一起，50-60°C水浴减压蒸干，残余物用洗涤液重新溶解配成1 10的溶液，得到待测样品。(3)检测步骤A、加样向酶标板微孔中加入莱克多巴胺系列标准浓度溶液或样品溶液50 μ L， 然后加入莱克多巴胺抗体溶液50μ L，37°C恒温孵育1. 5h ；B、洗涤倾出孔中液体，每孔加入洗涤溶液250 μ L，洗涤3次，拍干；C、加酶标羊抗鼠抗体溶液每孔加入酶标羊抗兔抗体溶液100 μ L，37°C孵育Ih ；D、洗涤倾出孔中液体，每孔加入洗涤溶液250 μ L，洗涤3次，拍干；Ε、加发光溶液每孔加入发光溶液100 μ L ；F、检测用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度。(4)结果判断所获得的标准品和样品发光值的平均值除以第一个标准(O标准)的发光值再乘 以100，以抑制率为纵坐标，莱克多巴胺浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓 度可以从标准曲线上读出。%抑制率标准品发光值(或样品)/O标准品发光值。实施例4、试剂盒精密度和准确度试验
取0. 2，0. 5，0. 8，1，2ppb的莱克多巴胺标样，添加到鸡肉样品中，来检测莱克多巴 胺回收率。每个浓度的批间变异系数都以不同的5天的5个重复数据进行计算，批内变异 系数以同一天的5次重复数据计算。根据制定的标准曲线的线性方程进行回收率的定量计算。结果见下表。表一
权利要求
一种利用单抗检测莱克多巴胺残留的间接化学发光酶联免疫试剂盒，其特征是该试剂盒由下列试剂组成A.各孔包被有包被抗原即莱克多巴胺与载体蛋白的偶联物的酶标板1块；B.莱克多巴胺标准溶液浓度分别为0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL各一瓶；C.酶标羊抗鼠抗体溶液辣根过氧化酶 羊抗鼠IgG原液，使用时用洗涤溶液配制成1∶2000的工作浓度；D.莱克多巴胺抗体溶液人工免疫抗原免疫动物制得的单克隆抗体，使用时用洗涤溶液稀释成1∶8000的工作浓度；E.发光溶液0.01M鲁米诺、pH＝8.8的0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液和体积比3/10000的H2O2的混合液；F.洗涤溶液指含有吐温 20体积分数0.05％的pH＝7.5、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液；G.包被溶液1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH为9.5；H.封闭溶液由10g OVA溶于1L洗涤溶液中，再加入质量比为0.05％的NaN3配制而成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述偶联物的载体蛋白为分子量范围 是6. 7KDa 6. 8KDa的牛血清蛋白。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于包被酶标板的包被抗原由莱克多巴胺 与牛血清蛋白偶合制成，制备抗体的人工免疫原由莱克多巴胺与牛血清蛋白偶合制成。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述包被抗原浓度由纯化后浓度为 15mg/ml的抗原稀释1 2000。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述莱克多巴胺抗体是由莱克多巴胺 与分子量范围是6. 7KDa 6. SKDa的牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫动物制得的单 克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述检测方法是将化学发光与间接酶 联免疫法结合的一种新方法。
全文摘要
一种利用单抗检测莱克多巴胺残留的间接化学发光酶联免疫试剂盒。包括各孔包被有以莱克多巴胺与牛血清蛋白偶合制成的包被抗原的酶标板以及莱克多巴胺系列标准溶液、酶标羊抗鼠抗体溶液、莱克多巴胺抗体溶液、发光溶液、洗涤溶液、包被溶液及封闭溶液。本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒利用单克隆抗体进行化学发光酶联免疫检测，IC50＝0.6ng/ml。在鸡肉样品中最低检测限为0.10ng/ml，批间批内变异系数＜13％，回收率为88～114％。本发明应用单克隆抗体并将化学发光与间接酶联免疫法结合，建立了一种检测莱克多巴胺残留的新的体系，具有比普通的ELISA更高的灵敏度和特异性，能够在动物性食品(如奶、动物组织、尿样)中的莱克多巴胺残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N21/76GK101949933SQ20101026201
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月25日 优先权日2010年8月25日
发明者孟萌, 张元阳, 张太昌, 徐静, 王亚宾, 薛虎寅, 郗日沫 申请人:南开大学